CN111808110B - 一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嘧啶‑哌嗪‑1,2,4‑三氮唑衍生物及其制备方法和应用。该化合物的结构式为：

其中，R₁为链状或环状脂肪烃基、芳香烃基；R₂为链状或环状脂肪烃基；R₃为H或C1～C4烷基；R₄为链状或环状脂肪烃基、芳香烃基、饱和杂环取代基或芳杂环取代基。本发明制备得到的化合物能够有效地抑制BRD4蛋白的表达，可用于制备BRD4蛋白抑制剂或相应的治疗药物。

Description

一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

BRD4蛋白是BET蛋白家族的一员，起初被称为MCAP(mitotic chromosome-associated protein)，又被称之为Fshrg4和Hunk1，1988年在研究哺乳类调节复合物时，发现了BRD4。BRD4包含三种长度不同的亚型：长亚型含有1362个残基，两个短亚型分别含有722个和796个残基。BRD4含有两个N-末端BRDs结构域(BD1和BD2)和外末端域(ETD)及C-末端域(CTD)。BRD4的每个BRD结构域都是由四个左手α-螺旋束组成，分别为αZ、αA、αB、αC；αZ和αA螺旋之间、αB和αC螺旋之间由ZA Loop和BC Loop来连接，并构成乙酰化赖氨酸结合位点。BRD4通过结合位点来识别组蛋白上的乙酰化赖氨酸位点(如图1所示)，调节基因转录、DNA复制、细胞周期进程和其他细胞内活动。虽然BRD4的两个BRD结构域序列相似，但是由于他们结合不同的乙酰化组蛋白和转录蛋白，所以具有不同的生物学功能。BRD4的第一个BRD结构结合到二乙酰化的组蛋白H4K5AcK8Ac上，并调节相关蛋白到靶基因的启动子和增强子位置上；BRD4的第二个BRD结构域与二乙酰化的H3K4AcK9Ac有很强的相互作用，并且可以招募非组蛋白的蛋白质。研究表明，在BRD4(BD1)与组蛋白的晶体结构中，乙酰化赖氨酸结合到中心疏水腔，与140位的天冬酰胺残基形成第一个氢键，此外，乙酰基的氧原子通过一个水分子和97位酪氨酸形成第二个氢键。大部分BRD4抑制剂是通过模仿乙酰化赖氨酸的结构去竞争性结合BRD4，从而达到阻断BRD4与乙酰化赖氨酸的结合，达到抑制BRD4功能的目的。

BRD4在细胞周期的不同时期发挥着作用，具有复杂的生长调节功能。BRD4在整个细胞周期中都与染色质相互作用，直接维持了组蛋白的乙酰化状态和染色质高度有序的结构。在有丝分裂间期，BRD4通过招募阳性转录延长因子(P-TEFb)复合物到启动子上，来调节基因转录；而P-TEFb由CDK9和细胞周期素T1/T2/K组成，可以磷酸化负性延长因子和C-末端的RNA聚合酶Ⅱ，刺激基因转录延长。同时，研究表明BRD4还可以通过招募细胞核SET含域蛋白(NSD)3直接磷酸化C-末端的RNA聚合酶Ⅱ，因此称BRD4为非典型的激酶。BRD4在整个细胞周期中都有表达，并在G1期下调，有利于细胞向S期转化。BRD4的过表达会使正常细胞和癌细胞在G1/S期发生停滞，而BRD4抑制剂会使癌细胞停滞在G0/G1阶段。在HeLa癌细胞研究中表明，BRD4对细胞G2/M期的过渡是很重要的；BRD4的第二个BRD结构可以与复制子C的亚基RFC-140相互作用而抑制RFC的功能，阻滞细胞周期进程。BRD4和RFC之间的平衡受到破坏后，会影响细胞周期进程。而且，BRD4对Aurora B激酶的表达是很重要的，进而影响细胞分裂中的染色质分离、细胞质分裂等。这些都表明BRD4在细胞周期进程中的重要作用。

BRD4参与了细胞内多种信号通路，更是在多种疾病的病理过程中发挥着重要作用；BRD4的抑制对多种疾病展现出很好的治疗效果，比如癌症、炎症、肥胖、心血管疾病和中枢神经疾病等。BRD4的染色体易位到睾丸核蛋白(NUT)上形成了BRD4-NUT融合蛋白，可以造成c-MYC的过度表达，导致对传统化疗不起作用的恶性肿瘤NUT中线癌(NMC)的形成。BRD4的抑制可以下调MYC基因的转录表达，然后影响与MYC相关靶基因的表达。MYC在癌症发病形成过程中，占据了很重要的角色，通过BRD4的抑制来调节MYC的方式，可以用来治疗癌症，这一点在NMC的肿瘤模型上得到了验证。二乙酰化的Twist蛋白质结合到BRD4的第二个BRD结构域，并招募P-TEFb/RNA-PolⅡ到WNT5A超级增强子，直接激活WNT5A表达，促进癌细胞扩散和维持癌细胞的类干细胞特性。BRD4可以和雄性受体(AR)相互作用，促进前列腺癌相关基因的的转录，而BRD4的抑制可以作为前列腺癌的一种治疗方式。目前已经确定BRD4是多种癌症的治疗靶点，比如：急性髓性白血病(AML)、成神经细胞瘤、肺腺癌等；关于癌症方面，BRD4抑制剂的研究一直是热门的领域，目前也有很多药物处于临床研究阶段。

肥胖一直是人类的公众健康问题，而研究表明肥胖也可能会影响肿瘤的发生；BRD4可以影响成年人的身体结构组成，比如肥胖和脂肪分布、胰岛素耐受及相关并发症，比如肥胖相关的肿瘤。但是，目前相关机制的研究还不是很明确。研究表明，BRD4结合到RELA蛋白的310位乙酰化赖氨酸位点上，促进NF-κB转录共激活，招募P-TEFb调节促炎靶基因的表达，调控炎症的发生。BRD4定位在促纤维化转录因子上，调节多个促纤维化通路；在老鼠模型中，BRD4抑制剂可以消除细胞因子诱导的肝星状细胞，以及逆转四氯化碳诱导的纤维化。BRD4抑制剂也可以治疗快速发展特发性肺纤维化疾病等。BRD4在心理衰竭的发病过程中，具有很重要的作用；BRD4抑制剂可以在体外阻断心肌细胞肥大，可以在体内抑制病理心脏重组。在神经系统中，BRD4可能调节潜在记忆和学习的转录调控，BRD4功能缺失会影响重要的突触蛋白，导致老鼠的记忆力受损和增加了癫痫发作的可能性。而BRD4敲除实验表明，BRD4可以调控病毒转录，比如HIV、Epstein-Barr virus(EBV)和人乳头瘤病毒(HPV)等；BRD4抑制剂可以抑制病毒的转化，提供了一个新方法来治疗病毒感染等相关疾病。

综上所述，BRD4参与了细胞内多种信号通路，并且在多种疾病的发病机制中占据了重要作用。所以，BRD4抑制剂的研究是非常有必要的。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物及其制备方法和应用，该化合物能够有效地抑制BRD4蛋白的表达，可用于制备BRD4蛋白抑制剂或相应的治疗药物。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物，该化合物的结构式为：

其中，R₁～R₄均为-H、C₁～C₄烷基、-C₃H₅、苄基、C₁～C₄烷氧基、芳基或芳杂基，且相互独立。

进一步地，R₁为-H、C₁～C₄烷基、苄基或环烷基；R₂为-H或C₁～C₄烷基；R₃为-H或C₁～C₄烷基；R₄为-H、C₁～C₄烷基、-C₃H₅、苄基、C₁～C₄烷氧基、芳基或芳杂基。

进一步地，化合物的结构式为：

上述嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)在冰水浴，保护气体环境中，向(R)-2-氨基丁酸溶液中加入氯化亚砜，然后于60～90℃反应1～2h，经减压蒸馏纯化后，得(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐；(R)-2-氨基丁酸与氯化亚砜的摩尔比为0.1～1:0.1～2；

其反应式为：

(2)向(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐溶液中加入含有羰基的化合物，再加入无水醋酸钠，室温反应30～60min后，加入三乙酰氧基硼氢化钠，室温继续反应10～12h后，过滤纯化得中间体Ⅰ；(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐、羰基化合物、无水醋酸钠和三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为0.1～1:0.1～1:0.1～1:0.5～2；

其反应式为：

(3)向中间体Ⅰ溶液中加入N,N-二异丙基乙胺，再加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶溶液，室温反应10～15h，减压纯化得中间体Ⅱ；中间体Ⅰ、N,N-二异丙基乙胺和2,4-二氯-5-硝基嘧啶的摩尔比为0.5～1:1～2:1～5；

其反应式为：

(4)在室温，保护气体环境中，将氯化铵和还原性金属粉末加入至中间体Ⅱ溶液中，于80～100℃反应2～5h，纯化后得中间体Ⅲ；所述中间体Ⅱ、氯化铵和还原性金属粉末的摩尔比为0.5～1:1～4:2～5；

其反应式为：

(5)于-30～-20℃，向中间体Ⅲ溶液中加入叔丁醇钾，冰水浴反应30～60min，然后在-50～-40℃继续加入氯磷酸二乙酯后，升温至室温，并加入还原剂反应10～15h，纯化后得中间体Ⅳ；中间体Ⅲ、叔丁醇钾和氯磷酸二乙酯的摩尔比为0.2～1:0.5～1.5:1～3；

其反应式为：

(6)将中间体Ⅳ溶解在原酸酯中，回流反应1～2h，纯化得中间体Ⅴ；然后将其溶解，并加入各类取代环胺、杂环胺、脂肪胺或芳胺等和酸液，于保护气体环境中，100～150℃反应10～12h即可；中间体Ⅴ与胺基化合物的摩尔比为1～2:1～3；中间体Ⅳ在原酸酯溶液中所占体积百分比为3～5％。

其反应式为：

进一步地，(R)-2-氨基丁酸与氯化亚砜的摩尔比为1:2。

进一步地，(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐、羰基化合物、无水醋酸钠和三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1:1:1:2。

进一步地，中间体Ⅰ与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:2。

进一步地，中间体Ⅱ、氯化铵和还原性金属粉末的摩尔比为1:4:5。

进一步地，中间体Ⅲ与叔丁醇钾的摩尔比为1:1.5。

进一步地，含有羰基的化合物为环戊酮或甲醛。

进一步地，还原剂为水合肼。

进一步地，还原性金属粉末为还原铁粉。

进一步地，原酸酯为原甲酸三甲酯或原乙酸三甲酯。

一种BRD4抑制剂，包括上述嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物，以及辅助成分。

上述嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物在制备抗肿瘤、抗心血管疾病、抗中枢神经疾病或抗炎药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明方法制备得到的嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物对于BRD4具有优异的抑制效果，能够制备具有抑制BRD4蛋白能力的抑制剂以及相应的药物。

附图说明

图1为蛋白活性检测结果；

图2为化合物IC50检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐

将(R)-2-氨基丁酸(6.18g，60mmol，1.0eq)溶于100mL(40eq)的甲醇溶液中，在氮气保护下，置于冰水浴中，缓慢加入氯化亚砜(14.28g，120mmol，2.0eq)；等滴加完毕后，转移至70℃油浴锅中，反应回流1-2h，待TLC检测反应完全，等反应液冷却后，减压蒸馏除去反应溶剂；利用二氯甲烷反复溶解旋干2-3次，得到白色晶体状产物，收率99％。

(2)制备中间体Ⅰ

室温下，将(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐(1.0eq)溶于DCM中，随后加入环戊酮(1.0eq)；并迅速加入无水醋酸钠(1.0eq)，反应半个小时后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.0eq)。常温下反应10-12h，利用TLC和茚三酮显色来检测反应情况；反应完全后，加入饱和NaHCO3溶液，除去多余的三乙酰氧基硼氢化钠，调节溶液至弱碱性，用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，得到无色油状的粗产品，直接用于下一步反应。其中，R₁为环戊基。

(3)制备中间体Ⅱ

室温下，首先将中间体Ⅰ(1.0eq)溶解在THF溶液中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(2.0eq)；最后将2,4-二氯-5-硝基嘧啶(2.0eq)溶解在THF中，缓慢地加入反应液中。常温下反应12h后，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，固体残渣溶解在饱和NaHCO₃溶液中，用EA萃取，收集有机相，并用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产品。粗产品经柱层析纯化后，得到目标化合物。

(4)制备中间体Ⅲ

室温下将中间体Ⅱ(1.0eq)溶解在EtOH/H₂O(v:v＝1:1)的混合溶液中，N₂保护，并依次加入NH₄Cl(4.0eq)和还原铁粉(5.0eq)。置于85℃油浴锅中反应3h，TLC检测反应完全。趁热过滤，除去反应残渣，并用EA洗涤滤饼3-5次，滤液在减压蒸馏下除去溶剂，残渣溶解在饱和NaHCO₃溶液中，用EA萃取，收集有机相，用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产品。粗产品经柱层析纯化后，得到目标化合物。

(5)制备中间体Ⅳ

在无水无氧条件下，首先中间体Ⅲ(1.0eq)溶解在超干THF溶液中，然后置于-20℃冷阱中，缓慢加入叔丁醇钾(1.5eq)，随后将反应瓶置于冰水浴中反应半个小时；接着转移至-40℃的冷阱中，缓慢加入氯磷酸二乙酯(1.0eq)，之后再让反应溶液温度缓慢升至常温。在常温下，加入高纯度水合肼(10.0eq)，反应12h。TLC检测，减压蒸馏除去反应溶剂，加入饱和NaHCO₃溶液，DCM萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品。粗产品经柱层析纯化后，得到目标化合物。

(6)制备中间体Ⅴ

中间体Ⅳ溶解在原甲酸三甲酯中，形成体积百分比为3％的溶液，回流反应1-2h，TLC检测反应完全，减压蒸馏除去反应溶剂，得到较纯的目标化合物，其中，R₃为-H。

(7)常温下，中间体Ⅴ(1.0eq)溶解在EtOH/H₂O(v:v＝1:4)的混合溶液中，随后加入芳胺(1.2eq)和浓盐酸(0.0024eq)，氮气置换保护。在100℃下反应10-12h，TCL检测反应完全。减压蒸馏除去反应溶剂，加入饱和NaHCO₃溶液，调pH-11，DCM萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产品。进一步纯化，得化合物1，其中，R₄为芳基。

其核磁数据为：δ:8.46(s,1H),7.65(s,1H),6.40-6.12(m,5H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例2

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物2。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.62(s,1H),5.24(s,1H),2.81(m,1H),2.68(m,2H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.56(m,14H),0.98(m,3H),0.92(m,3H)。

实施例3

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物3。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.68(s,1H),6.40(d,J＝7,8Hz,2H),6.12(d,J＝7,8Hz,2H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.26(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.96(m,3H)。

实施例4

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物4。其核磁数据为：δ:8.61(s,1H),7.63(s,1H),6.42-6.23(m,3H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.32(s,3H),2.26(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例5

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物5。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.65(s,1H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),3.74(m,4H),3.62(m,4H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例6

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物5。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.66(s,1H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),3.68(m,6H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.58(m,14H),0.92(m,3H)。

实施例7

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物7。其核磁数据为：δ:8.66(s,1H),7.68(s,1H),7.16(d,J＝7,8Hz,2H),7.02(d,J＝7,8Hz,2H),4.43(m,1H),4.20(m,2H),3.95(m,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.98(m,3H)。

实施例8

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物8。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.65(s,1H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.83(m,1H),2.62(m,1H),2.41-2.56(m,4H),2.18(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,12H),0.93(m,3H)。

实施例9

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物9。其核磁数据为：δ:8.62(s,1H),7.65(s,1H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.49(s,8H),2.20(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.91(m,3H)。

实施例10

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物10。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.62(s,1H),4.43(m,1H),4.20(m,2H),4.03(m,1H),3.95(m,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.96(m,3H)。

实施例11

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物11。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.60(s,1H),6.40-6.12(m,5H),5.94(s,1H),4.48(s,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.98(m,3H)。

实施例12

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物12。其核磁数据为：δ:8.62(s,1H),7.65(s,1H),6.40(d,J＝7,8Hz,2H),6.12(d,J＝7,8Hz,2H),5.94(s,1H),4.48(s,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.26(m,2H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),1.52(m,2H),0.94(m,3H)。

实施例13

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB1。其核磁数据为：δ:8.65(s,1H),7.64(s,1H),6.40(d,J＝7,8Hz,2H),6.12(d,J＝7,8Hz,2H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.26(m,2H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),1.52(m,2H),0.92(m,3H)。

实施例14

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB2。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.65(s,1H),6.42-6.23(m,3H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.28(s,3H),2.22(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例15

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB3。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.65(s,1H),6.40(d,J＝7,8Hz,2H),6.12(d,J＝7,8Hz,2H),5.94(s,1H),4.48(s,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.26(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.96(m,3H)。

实施例16

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB4。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.65(s,1H),6.42-6.23(m,4H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.26(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.95(m,3H)。

实施例17

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB5。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.69(s,1H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),3.26(m,4H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),1.21(m,6H),0.92(m,3H)。

实施例18

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB6。其核磁数据为：δ:8.65(s,1H),7.65(s,1H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),3.44(m,4H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.90(m,4H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例19

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB7。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.62(s,1H),5.24(s,1H),2.81(m,1H),2.68(m,2H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.56(m,10H),0.98(m,3H),0.92(m,3H)。

实施例20

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB8。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.62(s,1H),5.24(s,1H),2.81(m,1H),2.52(m,1H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.56(m,10H),0.98(m,3H),0.84(m,2H),0.60(m,2H)。

实施例21

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB9。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.65(s,1H),7.16(d,J＝7,8Hz,2H),7.02(d,J＝7,8Hz,2H),4.86(s,1H),4.43(m,1H),4.20(m,2H),3.95(m,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.92(m,3H)。

实施例22

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB10。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.65(s,1H),5.94(s,1H),4.46(s,1H),3.95(m,2H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.49(s,8H),2.20(m,2H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例23

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB11。其核磁数据为：δ:8.60(s,1H),7.62(s,1H),5.24(s,1H),2.81(m,1H),2.68(m,2H),2.62(m,1H),1.95(m,2H),1.84-1.56(m,12H),0.98(m,3H),0.94(m,3H)。

实施例24

参照实施例1的合成方法，改变底物的取代基和反应物摩尔比，得到化合物HB12。其核磁数据为：δ:8.64(s,1H),7.65(s,1H),6.42-6.23(m,4H),5.94(s,1H),3.81(m,1H),2.62(m,1H),2.26(s,3H),1.95(m,2H),1.84-1.63(m,8H),0.94(m,3H)。

实施例1～24制备得到的化合物具体分子量、结构式等信息见表1。

表1制备得到的化合物

实验例细胞增殖抑制实验

1、材料

溴化噻唑蓝四唑(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均是购自Sigma公司；DMEM培养基、RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均是购自Gibco BRL公司；100U/mL的青霉素和100U/mL链霉素的DMEM完全培养基在37℃、5％CO₂环境下的培养箱中进行培养。

2、实验原理和方法

采用MTT法测定化合物体外对肿瘤细胞增殖抑制的活性。MTT是一种能够接受氢离子的黄色四氮唑类染料，通过作用于线粒体呼吸链，并在琥珀酸脱氢酶及细胞色素C的共同作用下使MTT的四氮唑开环并生成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，然后用DMSO溶解，最后通过测定吸光度来测定活细胞的数目。通常而言，活细胞数目越多，沉淀的甲瓒数量也就越多，从而酶标仪测定的吸光度就越大。MTT实验常应用于抗肿瘤药物体外筛选、检测生物活性因子等实验中。

收集对数生长期的肿瘤细胞，将细胞以2.5-10×10³个细胞/孔的密度接种到96孔板中，每孔体积100μL。将板置于37℃、5％CO₂细胞培养孵箱内培养24h。加药组中，按浓度梯度(浓度分别为1000nM、333nM、111nM、37nM、12nM、4nM)每孔加入100μL化合物的培养基溶液，每个浓度设3个复孔；对照组每孔中只需加入100μL培养基，不加药物。将板置于37℃、5％CO₂细胞培养孵箱内培养72h。

药物处理组、对照组每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养2-4h，待甲瓒形成后，终止培养，倾去上清液后每孔加150μL DMSO(仅针对贴壁细胞)，而对于悬浮细胞MV4-11则是直接加入50μL 20％SDS溶液，在摇床上摇15-20min。在570nm波长下，用酶标仪检测每孔细胞吸光度(OD_570nm)，取其平均值记录结果。细胞增殖抑制率＝(对照组OD_570nm-实验组OD_570nm)/对照组OD_570nm*100％。通过Graphpad Prism5计算出每个化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)。

3、激酶活性检测

Eurofins公司提供的体外激酶活性抑制实验测，试了化合物在体外对BRD4激酶的抑制活性。主要的测试方法如下：首先配制反应缓冲液；反应缓冲液包含了0.2nM乙二胺四乙酸(EDTA)、10mM醋酸镁、Km浓度的γ33P-ATP和8mM丙磺酸盐等物质；然后将待测化合物(1μM/0.33μM/0.11μM/0.036μM/0.012μM)或者空白溶剂与BRD4蛋白激酶及相应多肽底物一同添加到反应缓冲液中，并在室温下孵化40min；最后，将3％的磷酸盐溶液加入到反应缓冲液中，终止反应。反应停止后，在P30滤纸上滴加10ul的反应溶液，然后用75mM磷酸盐溶液洗涤(3次)，接着用甲醇洗涤一次，待P30滤纸晾干后，将其加入闪烁液中进行闪烁计数。化合物抑制激酶活性用半数抑制浓度(IC₅₀)表示，根据5个浓度梯度对应的抑制率来拟合计算IC50值。

4、蛋白活性检测

采用Alphascreen^TM方法来检测BRD4(BD1)体外活性，Alphascreen^TM方法是一种检测生物分子间相互作用的技术，通过微球的连接作用，将相互作用级联放大产生信号。

本实验方法如下：利用(+)-JQ1为阳性对照物，将化合物从10μM开始3倍稀释，设置6个浓度梯度：10μM/3.3μM/1.1μM/0.37μM/0.12μM/0.04μM。首先准备HEPES缓冲液，利用HEPES缓冲液配置BRD4蛋白质溶液，加入氨甲酸到HEPES缓冲液制备底物溶液；取5μl蛋白溶液到待测的孔板里，在对照组加5μl的空白测试缓冲液，并在室温下孵育15min；然后在每个孔加上5μL底物溶液，并在室温下孵育60min；紧接着加入15μL的受体和供体溶液，在弱光和室温下孵育60min；最后用EnSpire的Alpha模式识别结点，用Excel软件拟合获得抑制值，再用GraphPad拟合计算得到IC50值，其结果见图1和图2。

图1对我们得到的部分化合物进行的酶水平活性测试，其中在10微摩尔水平，大多数都有100％是抑制率。图2是部分化合物的IC50值测试，测试结果表明我们的化合物酶活性水平均在纳摩尔水平，其中化合物7的活性水平达到了35纳摩尔，酶活性水平已经非常高。

Claims (6)

1.一种嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物，其特征在于，该化合物的结构式为：

。

2.权利要求1所述的嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在冰水浴，保护气体环境中，向（R）-2-氨基丁酸溶液中加入氯化亚砜，然后于60~90℃反应1~2h，经减压蒸馏纯化后，得(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐；所述（R）-2-氨基丁酸与氯化亚砜的摩尔比为0.1~1:0.1~2；

（2）向(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐溶液中加入含有羰基的化合物，再加入无水醋酸钠，室温反应30~60min后，加入三乙酰氧基硼氢化钠，室温继续反应10~12h后，过滤纯化得中间体Ⅰ；所述(R)-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐、羰基化合物、无水醋酸钠和三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为0.1~1:0.1~1:0.1~1:0.5~2；所述含有羰基的化合物为环戊酮；

制备得到的中间体Ⅰ的结构式为：

；

（3）向中间体Ⅰ溶液中加入N,N-二异丙基乙胺，再加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶溶液，室温反应10~15h，减压纯化得中间体Ⅱ；

所述中间体Ⅰ、N,N-二异丙基乙胺和2,4-二氯-5-硝基嘧啶的摩尔比为0.5~1:1~2:1~5；

制备得到的中间体Ⅱ的结构式为：

；其中，R₁为环戊烷；

（4）在室温，保护气体环境中，将氯化铵和还原性金属粉末加入至中间体Ⅱ溶液中，于80~100℃反应2~5h，纯化后得中间体Ⅲ；所述中间体Ⅱ、氯化铵和还原性金属粉末的摩尔比为0.5~1:1~4:2~5；

制备得到的中间体Ⅲ的结构式为：

；

（5）于-30~-20℃，向中间体Ⅲ溶液中加入叔丁醇钾，冰水浴反应30~60min，然后在-50~-40℃继续加入氯磷酸二乙酯后，升温至室温，并加入还原剂反应10~15h，纯化后得中间体Ⅳ；所述中间体Ⅲ、叔丁醇钾和氯磷酸二乙酯的摩尔比为0.2~1:0.5~1.5:1~3；

制备得到的中间体Ⅳ的结构式为：

；

（6）将中间体Ⅳ溶解在原酸酯中，回流反应1~2h，纯化得中间体Ⅴ；然后将其溶解，并加入胺基化合物和酸液，于保护气体环境中，100~150℃反应10~12h即可；所述胺基化合物为芳胺；

制备得到的中间体Ⅴ的结构式为：

；其中，R₃为H；所述芳胺的结构式如下：

所述中间体Ⅴ与胺基化合物的摩尔比为1~2:1~3。

3.根据权利要求2所述的嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述（R）-2-氨基丁酸与氯化亚砜的摩尔比为1:2。

4.根据权利要求2所述的嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述原酸酯为原甲酸三甲酯或原乙酸三甲酯。

5.一种BRD4抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物。

6.权利要求1所述的嘧啶-哌嗪-1,2,4-三氮唑衍生物在制备抗肿瘤、抗心血管疾病、抗中枢神经疾病或抗炎药物中的应用。

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