CN111778339B - 与食管癌相关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与食管癌相关的miRNA标志物及其应用，所述miRNA标志物选自miR‑4718、miR‑4771、miR‑191‑5p中的至少一个。本发明的miRNA标志物诊断食管癌具有较高的诊断效能，能够有效的区分食管癌和正常对照。

Description

与食管癌相关的miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及与食管癌相关的miRNA标志物及其应用。
背景技术
食管癌(esophageal cancer,EC)是世界上第八大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第六大原因(Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].Ca Cancer J Clin,2011，61(2):69-90.)。食管癌是最严重的消化道恶性肿瘤之一，其恶性潜能高、预后差，具有高致死性，现已显示其全球发病率急剧上升超过6倍(Simard EP,Elizabeth WM,Rebecca S,et al.Cancers with increasing incidence trends in theUnited States:1999through 2008[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2012,62(2):118-28.)。在全球范围内，每年食管癌新发病例超过455,800例，死亡人数接近400,200人，严重威胁人类生命健康(Tome LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancerstatistics,2012[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians,2015,65(2):87-108.)。食管癌从病理组织学方向可分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)，在全球范围内食管鳞癌是主要组织学类型。
尽管近年来在手术、术前放疗和化疗方面取得了很大进展，一定程度上有效提高了食管癌患者的生存率。但不幸的是，由于食管癌早期症状不明显，大多数食管癌患者诊断时就已处于晚期，无法进行手术切除。肿瘤转移、复发和对放化的抗性严重影响了食管癌患者的预后，导致其预后不良(Huang FL,Yu SJ.Esophageal cancer:Risk factors,geneticassociation,and treatment[J].Asian Journal of Surgery,2016,41(3):51015958416302019.)。据报道，食管癌患者的中位生存时间约为1.5年，5年生存率仅为15％-20％(Rustgi AK,Elserag HB.Esophageal Carcinoma[J].New England Journal ofMedicine,2014,371(26):2499-509.)。因此，迫切需要发展新的治疗方式改善食管癌患者的预后。
近年来，随着基因测序、转录组学和生物信息学的发展，已发现越来越多的非编码RNA(non-coding RNAs)参与肿瘤的发生发展进程，包括微小RNAs(microRNAs,miRNAs)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)。这为筛查新的肿瘤诊断标志物和治疗靶点提供了坚实的基础。miRNAs是一类短的(约22个核苷酸)非蛋白编码的单链小分子RNAs，通过与目标基因mRNAs的3‘非翻译区(3'untranslated regions，3'-UTR)中的互补序列结合，导致mRNAs的降解或抑制其转录翻译从而起到转录后调控子的作用。越来越多的研究表明miRNAs是肿瘤发生和进展的关键调节因子，也是人类癌症中有用的诊断和预后标志物(Ventura A,Jacks T.MicroRNAs and cancer:short RNAs go a long way[J].Cell,2009，136(1):586-91.)。同样，miRNAs也被证实参与食管癌的发生和发展进程。因此，发现新的食管癌相关miRNA，深入了解miRNA影响食管癌生长转移的分子机制，将为明确食管癌发生发展的分子机制提供新的思路，为食管癌的临床治疗提供新的分子靶点。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在与食管癌发生发展相关的miRNA标志物，本发明提供的食管癌miRNA标志物用于食管癌的诊断具有较高的灵敏性和特异性，有利于实现食管癌的诊断。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了食管癌相关miRNA标志物，所述miRNA标志物包括miR-4718、miR-4771、miR-191-5p中的一种或几种。
优选地，所述miRNA标志物是miR-4718、miR-4771、miR-191-5p中的任意一种；
优选地，所述miRNA标志物是miR-4718、miR-4771、miR-191-5p中的任意两种；
优选地，所述miRNA标志物是miR-4718、miR-4771、miR-191-5p的组合。
本发明的第二方面提供了一种试剂，所述试剂检测本发明第一方面所述的miRNA标志物。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别本发明第一方面所述的miRNA标志物的寡核苷酸探针；或
特异性扩增本发明第一方面所述的miRNA标志物的引物。
本发明的第三方面提供了一种诊断食管癌的产品，所述产品包括检测本发明第一方面所述miRNA标志物的表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测本发明第一方面所述miRNA标志物的表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。
所述的芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明的剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
本发明的第四方面提供了一种建立食管癌诊断模型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将患者分为训练组和验证组，从训练组受试者采集的标本中测定差异表达基因；
2)根据所述差异表达基因，确定具有统计显著性的设定值范围；
3)多变量Cox回归分析每个差异表达基因对食管癌诊断的贡献，建立风险评分模型；
4)使用验证组对风险评分模型进行验证，检验所建模型的预测准确度；
优选地，所述差异表达基因为本发明第一方面所述的miRNA标志物。
进一步，所述风险评分模型以miR-4718、miR-4771或miR-191-5p的表达水平作为输入变量，通过一维卷积神经网络构建，当风险评分大于0.5时，受试者患有食管癌的风险高；当风险评分小于0.5时，受试者患有食管癌的风险低。
本发明的第五方面提供了如下任一项所述的应用：
1)本发明第一方面所述的miRNA标志物在构建预测食管癌的计算模型中的应用；
2)本发明第二方面所述的试剂在制备诊断食管癌的工具中的应用；
3)本发明第三方面所述的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用；
4)本发明第四方面所述的方法在构建食管癌诊断模型中的应用；
5)本发明第一方面所述的miRNA标志物在制备治疗食管癌的药物组合物中的应用。
在本发明中，术语“miRNA”具有其在本领域中的普通含义，表示来自遗传基因位点的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，尽管其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。
miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特定的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。采用Dicer方法切割这个miRNA前体可以得到miRNA双链体，其发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。
所述的miRNA随后被引导到其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。
本发明所用的术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指miRNA初级转录物的一部分，成熟miRNA从该miRNA初级转录物加工得到。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(将miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段都算在内，但排除更远端的序列)。
本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定RNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或其一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较，对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量和/或蛋白质的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则RNA或蛋白质是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。
“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。
“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的RNA或蛋白质的表达相比，从以患有食管癌为特征的个体分离的血或组织RNA或蛋白质表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的血相比，从以患有食管癌为特征的个体分离的血或组织中RNA或蛋白质表达水平降低的基因。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明主要强调收集生物标志物来评估食管癌患病风险，通过R分析获得训练集中风险判断相关基因，然后利用神经网络方法最终确定模型。根据风险评分的中位数将受试者分为高风险和低风险。本发明的miRNA标志物或风险模型的确定为食管癌的诊断提供了一种可靠的分子手段。
附图说明
图1是训练集中miR-4718的诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图2是训练集中miR-4771的诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图3是训练集中miR-191-5p的诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图4是训练集中miR-4771与miR-4718的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图5是训练集中miR-4718与miR-191-5p的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图6是训练集中miR-191-5p与miR-4771的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图7是训练集中miR-4771、miR-4718与miR-191-5p的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图8是测试集中miR-4718的诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图9是测试集中miR-4771的诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图10是测试集中miR-191-5p的诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图11是测试集中miR-4771与miR-4718的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图12是测试集中miR-4718与miR-191-5p的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图13是测试集中miR-191-5p与miR-4771的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图；
图14是测试集中miR-4771、miR-4718与miR-191-5p的联合诊断效能图，其中图A是ROC曲线图，图B是混合矩阵图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
实施例1筛选与食管癌相关的miRNA
1、样本
从GEO数据库中选择食管癌患者和相应的正常人作为研究对象，共纳入了775例食管癌样本及2000例正常人样本。从775例食管癌样本随机选取150例作为测试集，其余的作为训练集；从2000例正常人中随机选取150例作为测试集，其余的作为训练集。
2、数据归一化处理
对测试集数据和训练集数据归一化处理：
a)把数据归一化至(0，1)区间或者(1,1)区间；
b)把有量纲表达式变成无量纲表达式。
3)筛选差异表达分子
针对测试集数据和训练集数据使用edgeR包筛选出差异表达miRNA；
筛选标准为p-value≤0.05，︱logFC︱≥2，FDR≤0.05。
4)结果
结果显示，经分析筛选得到3个在食管癌患者中显著上调的miRNA，相关信息如表1所示。
表1差异表达基因
Figure BDA0002634857480000081
实施例2风险评分模型构建
利用1维卷积神经网络模型构建风险评分模型。
一维卷积神经网络模型的输入张量维度为(length，1)，其中length代表选取特征miRNA的数量。模型主体依次包括初始卷积层(init_conv)、八个残差卷积模块(res_block)、一个全局池化层(GlobalAveragePooling)，一个全连接层(Dense)以及一个激活输出层(Sigmoid)。其中，conv为一维卷积操作，k代表卷积核的大小，filters代表卷积核的个数。BatchNorm为批标准化层，其作用为将上一层的输出张量规范化至均值为0、方差为1的标准正态分布，以缓解网络训练中的梯度弥散和梯度爆炸，加快模型的训练速度。ReLU为线性整流函数(Rectified Linear Unit)，又称修正线性单元，是一种神经网络中常用的激活函数。初始卷积层由conv(k＝2，filters＝64)、BatchNorm、ReLU组成。卷积模块由BatchNorm、ReLU、conv(k，filters)组成。残差卷积模块由conv_block(k＝1，filters1)，conv_block(k＝2，filters2)，conv_block(k＝1，filters3)三者组成，其中filters1、filters2、filters3，代表选取三种数量的卷积核。实验表明，利用上述设计的CNN分类模型，可以精确判断输入的miRNA的表达量是否为食管癌。
根据一维卷积神经网络模型代入前面所述的三种差异表达miRNA构建的风险评分模型为：风险评分＝model(miR-4771的表达水平，miR-4718的表达水平，miR-191-5p的表达水平)。当风险评分大于0.5时，受试者患有食管癌风险高；当风险评分小于0.5时，受试者患有食管癌风险低。
实施例3风险评分模型的诊断效能检测
在训练集中，使用本发明的风险评分模型诊断受试者食管癌患病风险的结果显示，单个miRNA或几个miRNA联合后可作为诊断食管癌患病风险的独立预后因子，miRNA联合后形成的曲线下面积(AUC)是最高的，同时也具有较高的特异性和灵敏性(混合矩阵图)，如表2和图1-7所示，
表2不同miRNA标志物形成的曲线下面积
Figure BDA0002634857480000091
Figure BDA0002634857480000101
在测试集中，使用本发明的风险评分模型诊断受试者食管癌患病风险的结果显示，单个miRNA或几个miRNA联合后可作为诊断食管癌患病风险的独立预后因子，3个miRNA联合后形成的曲线下面积(AUC)是最高的，同时也具有较高的特异性和灵敏性(混合矩阵图)如表3和图8-14所示。
表3不同miRNA标志物形成的曲线下面积
miRNA AUC
miR-4718 0.654
miR-4771 0.762
miR-191-5p 0.712
miR-4771+miR-4718 0.910
miR-4718+miR-191-5p 0.930
miR-4771+miR-191-5p 0.943
miR-4771+miR-4718+miR-191-5p 0.957
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.如下任一项所述的应用：
1）检测miRNA标志物的表达水平的试剂在制备诊断食管癌的工具中的应用，其特征在于，所述miRNA标志物为miR-4718、miR-4771的任意一种，或miR-4718、miR-4771、miR-191-5p的任意两种或三种；
2）产品在制备诊断食管癌的工具中的应用，其特征在于，所述产品包括检测miRNA标志物的表达水平的试剂，所述miRNA标志物为miR-4718、miR-4771的任意一种，或miR-4718、miR-4771、miR-191-5p的任意两种或三种。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂选自：
特异性识别所述miRNA标志物的寡核苷酸探针；或
特异性扩增所述miRNA标志物的引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测所述miRNA标志物的表达水平的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。
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