CN111743897A - 二十四元大环席夫碱在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二十四元大环席夫碱在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用。本发明通过圆二色光谱、Western‑Blot等方法发现二十四元大环席夫碱可以和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中MecA基因的核心序列形成G‑四链体结构，从而抑制了相应青霉素结合蛋白PBP2a的表达。通过药敏实验证实二十四元大环席夫碱可以降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林的最低抑菌浓度。所述二十四元大环席夫碱使用量为5μM时，最低可以使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度降低为0.5μg/mL，达到使用β‑内酰胺类药物治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体的指二十四元大环席夫碱在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用。
背景技术
1961年，科学家首次分离出了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，该菌种在90年代迅速扩散，如今，其导致感染已遍布全球。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林有类似结构的β-内酰胺类抗生素均耐药，还可通过改变抗生素作用靶位、产生修饰酶、降低膜通透性等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，这对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起感染的临床治疗带来极大的挑战。目前普遍认为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制主要由MecA基因调控，MecA基因的过度表达导致了PBP2a蛋白的高表达。PBP2a是青霉素结合蛋白家族中的一种，但其活性位点与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低。当正常青霉素结合蛋白和β-内酰胺类抗生素结合而失去活性时，PBP2a能够代替其功能，继续肽聚糖合成，从而维持细菌的生长和繁殖，因此呈现出高度耐药性。如何从基因层面减轻PBP2a的表达量，进而减轻耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述背景技术的不足，提供二十四元大环席夫碱在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用，所述二十四元大环席夫碱的结构式如式Ⅰ所示：
进一步，所述二十四元大环席夫碱可以使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的青霉素结合蛋白PBP2a的表达量下降为对照组的11.7％。
进一步，所述二十四元大环席夫碱使用量为5μM时，最低可以使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(苯唑西林)降低为0.5μg/mL。
进一步，所述二十四元大环席夫碱制备的药品类型为注射剂、粉针剂、口服剂、口含片、喷雾剂、胶囊剂、栓剂等。
进一步，所述二十四元大环席夫碱与β-内酰胺类抗生素合用制成治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物。
本发明合成的二十四元大环席夫碱可以通过使MecA基因调控区域关键序列形成G-四链体结构从而抑制MecA基因的表达，降低了PBP2a的表达量，极大的降低了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌使用β-内酰胺类药物的最低抑菌浓度，达到使用常规剂量的β-内酰胺类药物治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的作用。
本发明的优点在于：
1.本发明对二十四元大环席夫碱开发了新的医疗用途，作为治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物会产生可观的经济效益。
2.本发明使用的二十四元大环席夫碱可以人工合成，步骤简单，合成产品纯度高，能够保证工业化生产。
3.本发明的二十四元大环席夫碱性质稳定，可以作为多种剂型使用，如：注射剂、粉针剂、口服剂、口含片、喷雾剂、胶囊剂、栓剂等。
附图说明
图1为二十四元大环席夫碱的核磁共振1H谱图。
图2为二十四元大环席夫碱的核磁共振13C谱图。
图3为MecA基因核心序列和二十四元大环席夫碱作用前后的圆二色光谱谱图。
图4为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和二十四元大环席夫碱作用前后的最低抑菌浓度(MIC值)结果。
图5为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中青霉素结合蛋白PBP2a和二十四元大环席夫碱孵育后的Westerm-Blot结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：二十四元大环席夫碱的合成。
1.实验仪器
核磁共振谱仪使用Bruker公司500MHz核磁共振谱仪，质谱使用赛默飞公司LCQFleet液质联用仪器。
2.实验药品与试剂
2,5-二羟基对苯二甲醛和对苯二胺购自于萨恩化学技术(上海)有限公司。其余常规试剂均为分析纯。
3.实验方法
二十四元大环席夫碱的合成采用溶剂稀释法。具体为：称取0.83g 2,5-二羟基对苯二甲醛(5mmol)溶于500mL甲醇溶液中，搅拌条件下逐滴滴加100mL溶解有0.54g对苯二胺(5mmol)的甲醇溶液，室温下搅拌6小时，得到橙黄色沉淀。抽滤，收集沉淀，大量乙醚洗涤，得到的黄色固体真空干燥，通过核磁和质谱进行表征。1H核磁谱图如附图1所示。1H-NMR(500MHz,d6-DMSO)δ＝8.83(s,4H)；7.21(s,4H)；7.11(s,4H)；7.01(s,4H)。13C核磁谱图如附图2所示。13C-NMR(125MHz,d6-DMSO)δ＝163.65,147.39,140.88,132.39,121.85,118.46。质谱：[M+H]+计算值477.16，观测值477.58。核磁和质谱表征结果和结构式相符。
实施例2：二十四元大环席夫碱诱导MecA基因核心序列形成G-四链体结构的验证。
1.实验仪器
圆二色光谱仪购自于英国应用光学物理公司
2.实验药品与试剂
MecA基因序列来自GeneBank,选取其核心序列为5’-GATGGTAAAGGTTGGCAGG-3’，DNA购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，三甲基氨基甲烷(Tris)购自于华美生物工程公司，二十四元大环席夫碱高浓度储备液为20mM，使用DMSO溶解。
3.实验方法
体系1：含终浓度为10μM MecA DNA和10mM的Tris-HCl，总体积200μL，不足部分蒸馏水补齐。
体系2：含终浓度为10μM的MecA DNA和10mM的Tris-HCl，10μM的二十四元大环席夫碱，总体积200μL，不足部分蒸馏水补齐。
设定圆二色光谱仪测试波长为230-310nm，分别扫描体系1和2的谱图。
4.实验结果
由附图3结果可以看出，单纯的单链DNA峰出现在257nm附近，加入二十四元大环席夫碱后出现了295nm附近的正峰和265nm附近的负峰，表明了平行结构的G-四链体的生成。该结果表明二十四元大环席夫碱可以诱导MecA基因核心序列形成G-四链体结构。
实施例3：二十四元大环席夫碱降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(MIC值)的验证。
1.实验仪器
麦氏比浊仪购自于北京天安联合科技有限公司，隔水式恒温培养箱购自于上海树立仪器仪表有限公司。
2.菌株
收集某医院微生物检验室2018年7月至12月分离的金黄色葡萄球菌菌株，排除同一病人的重复菌株，根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)鉴定出其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株，共收集17株菌株。质控菌株采用金黄色葡萄球菌ATCC29213，购自于广东环凯微生物科技有限公司。
3.实验药品与试剂
M-H肉汤粉购自于英国Oxoid公司，血平板购自于合肥天达生物有限公司，苯唑西林购自于石药集团中诺药业(石家庄)有限公司。M-H肉汤配制：称取M-H肉汤粉10.5g溶于500mL蒸馏水中，待充分溶解后用氢氧化钠或盐酸调整溶液pH至7.0，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。苯唑西林高浓度储备液为20mg/mL，蒸馏水溶解。二十四元大环席夫碱高浓度储备液为20mM，使用DMSO溶解。
4.实验方法
4.1.菌株培养。
从菌种保存管复种金黄色葡萄球菌，转种于血平板上35℃空气环境下培养18小时。
4.2微量肉汤稀释法
1)使用无菌棉挑选单个菌落，溶于灭菌生理盐水中，配制成0.5麦氏浊度的菌种悬浮液，再用M-H肉汤稀释100倍。
2)配制苯唑西林对倍稀释系列培养基，美罗培南浓度范围0.25-512μg/mL。
3)配制含有二十四元大环席夫碱的苯唑西林对倍稀释系列培养基，二十四元大环席夫碱的浓度为5μM，美罗培南浓度范围0.25-512μg/mL。
4)将菌液接种到上述步骤2,3所配制的对倍稀释系列培养基中，35℃摇菌培养20小时。
实验结果根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)进行判定。
5.实验结果
微量肉汤稀释法可以直观的看出金黄色葡萄球菌对苯唑西林的敏感程度。根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)规定，对于金黄色葡萄球菌，最低抑菌浓度MIC值≥4μg/mL时定义为苯唑西林耐药，不能使用该药物治疗相应菌株导致的感染；MIC值≤2μg/mL时定义为苯唑西林敏感，使用该药物治疗相应菌株导致的感染时常规剂量有效。由附图4结果可以看出，未加入二十四元大环席夫碱培养时，所有17株菌株的MIC值均大于8μg/mL，最高值达256μg/mL，均为苯唑西林耐药菌株，无法使用常规剂量的β-内酰胺类药物治疗该菌株所引起的感染。5μM的二十四元大环席夫碱和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株共同培养20小时后，所有菌株中的MIC值均出现了明显的下降，最低的MIC值降低为0.5μg/mL(SA10)。其中10株(SA4,SA6,SA7,SA9,SA10,SA12,SA13,SA14,SA15,SA17)对苯唑西林表现为敏感，说明该菌株所引起的感染使用常规剂量β-内酰胺类药物即可治疗；7株(SA1,SA2,SA3,SA5,SA8,SA11,SA16)菌株对苯唑西林仍表现为耐药，但其MIC值已出现了明显的下降,治疗部分菌株(SA11和SA16)所引起的感染时调整β-内酰胺类药物的剂量也可以达到治疗效果。以上药敏实验结果证实二十四元大环席夫碱可以降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林的最低抑菌浓度，达到使用常规剂量的β-内酰胺类药物治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的作用。
实施例4：二十四元大环席夫碱抑制PBP2a蛋白表达的验证
1.实验仪器
Western-Blot结果通过美国Bio-Rad公司ChemDoc XRS+化学发光仪测定，电泳仪购自于北京六一生物科技有限公司。
2.菌株
选取实施例3中最低抑菌浓度最低的菌种(SA10菌株，MIC值0.5μg/mL)进行实验。
3.实验药品与试剂
M-H肉汤粉购自于英国Oxoid公司，血平板购自于合肥天达生物有限公司，苯唑西林购自于石药集团中诺药业(石家庄)有限公司。细菌总蛋白提取试剂盒和BSA购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。PVDF膜购自于GE公司。PBP2a抗体购自于RayBiotech公司，GAPDH抗体和相应二抗购自于Abcam公司。M-H肉汤配制：称取M-H肉汤粉10.5g溶于500mL蒸馏水中，待充分溶解后用氢氧化钠或盐酸调整溶液pH至7.0，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。苯唑西林高浓度储备液为20mg/mL，蒸馏水溶解。二十四元大环席夫碱高浓度储备液为20mM，使用DMSO溶解。
4.实验方法
4.1.菌株培养。
1)从菌种保存管复种金黄色葡萄球菌，转种于血平板上上35℃空气环境下培养18小时。
2)使用无菌棉挑选单个菌落，溶于灭菌生理盐水中，配制成0.5麦氏浊度的菌种悬浮液，接种到M-H肉汤或含有不同浓度二十四元大环席夫碱的M-H肉汤中，35℃摇菌培养20小时。
4.2 Western-Blot实验
1)细菌总蛋白质的提取按照细菌总蛋白提取试剂盒的操作进行，提取所得的总蛋白质使用Nanodrop2000测定总蛋白质浓度。
2)每个电泳孔中上样10μg，使用15％的聚丙烯酰胺SDS凝胶在恒压90V的条件下电泳60分钟，取出凝胶，采用PVDF膜在恒压90V，4℃条件下湿法电泳转膜过夜。
3)将转膜完成后的PVDF膜使用5％的BSA溶液常温封闭2小时，PBS溶液洗3次。分别用1:500比例的PBP2a和GAPDH抗体溶液常温孵育2小时，PBS溶液洗3次。1:1000比例的二抗常温孵育2小时，PBS溶液洗3次。显色剂显色后直接采用ChemDoc XRS+化学发光仪观察实验结果，条带的强度由ChemDoc XRS+仪器自带软件计算得出。
5.实验结果
耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类药物主要由MecA基因调控，MecA基因表达PBP2a青霉素结合蛋白，PBP2a能够维持细菌肽聚糖的合成但其与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低，导致β-内酰胺类抗生素失去作用靶点，导致了耐药性的产生。因此降低PBP2a的表达会降低耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类药物的耐受性。
由附图5结果可以看出，不同浓度的二十四元大环席夫碱(分别为对照、0.5μM、1μM、2μM)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌共同培养20小时后，对照蛋白GAPDH的表达量没有没有变化，但是PBP2a蛋白质的表达量随着化合物浓度的升高出现了明显的下降，化合物浓度为2μM时，PBP2a表达量降低为对照组的11.7％。该结果表明二十四元大环席夫碱可以抑制PBP2a蛋白的表达。
因此，综合以上实验结果说明本发明合成的二十四元大环席夫碱可以和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中MexA基因的核心序列形成G-四链体结构，从而抑制了相应青霉素结合蛋白PBP2a的表达。通过药敏实验验证二十四元大环席夫碱可以降低耐耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林的最低抑菌浓度，达到使用常规剂量的β-内酰胺类药物治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的作用。
需要说明的是，实验中采用了苯唑西林(标准方法)进行药敏测试，苯唑西林属于β-内酰胺类抗生素的一种，根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)相应说明，对金黄色葡萄球菌各种β-内酰胺类抗生素的耐药结果，可以通过只检测苯唑西林而推测得到，因此推断其它β-内酰胺类抗生素也应该有同样的效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.二十四元大环席夫碱在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用，其特征在于：所述二十四元大环席夫碱的结构式如式Ⅰ所示：
2.如权利要求1所述的二十四元大环席夫碱在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用，其特征在于：所述二十四元大环席夫碱使用量为5μM时，使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度降低为0.5μg/mL。
3.如权利要求1所述的二十四元大环席夫碱在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用，其特征在于：所述二十四元大环席夫碱与β-内酰胺类抗生素合用制成治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物。
4.如权利要求1或3所述的二十四元大环席夫碱在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物中的应用，其特征在于：所述二十四元大环席夫碱制备的药物类型为注射剂、粉针剂、口服剂、口含片、喷雾剂、胶囊剂、栓剂。
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