CN111732656A - 一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用 - Google Patents

一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用，属于免疫胶体金技术领域。该C线抗体为酪蛋白抗体；所述C线抗体的重链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：1所示的序列；所述C线抗体的轻链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：2所示的序列。该C线抗体可以和待标记样品配制成样品混合液进行免疫胶体金标记，其标记的pH为8.3~9。本发明通过将酪蛋白抗体与待标记样品进行混合，可以实现与真C线羊抗鼠的结合，从而可以增加T线与C线强弱的消长变换，以提高侧向层析检测的灵敏度和避免出现假阳性。

Description

一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫胶体金技术领域，具体是一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用。
背景技术
免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，还原聚合成为特定大小的纳米金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金颗粒带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
侧向层析技术是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、简便、单人份检测、经济的优点,现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。
侧向层析技术以硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将特异性的抗原或抗体固定在NC膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用侧向移动，与结合垫上的胶体金或微球标记的试剂发生特异的免疫反应，再移动到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗体检测线（T线）捕获，聚集在检测带上，通过目测硝酸纤维素表面标记物（胶体金或乳胶颗粒）的光反射信号得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带，被质控线（C线）的抗体（通常是羊抗鼠）捕获。通过T线和C线的有无和颜色深浅实现待测物的定性或半定量检测。
抗体是免疫胶体金标记的主要标记物，抗体的空间结构呈Y字型，由两条轻链和两条重链组成。重链的氨基端与轻链组成与抗原结合的Fab段，两条重链的羧基端由二硫键连接组成保守的Fc段。
在免疫胶体金标记过程，抗体与胶体金颗粒的结合构型，在空间上具有方向性。为了描述这种空间结合构型的方向性，笔者将抗体的Fab段定义为头部（Head），Fc段定义为脚部（Foot）。这样抗体分子与胶体金颗粒的空间结合构型有三种状态：1，Fab段与胶体金颗粒结合态，头朝下结合态，Head-on；2，Fc段与胶体金颗粒结合态，脚朝下结合态，Foot-on；3，侧卧态，Side-on。在生产标记中发现，有一些抗体标记后，仅存在Foot-on结合态，或者Foot-on与Side-on结合混合态，而无Head-on结合态。在侧向层析试纸条的测试结果判读直观表现就是，T线显色强度良好，抑制率良好，但抗体C线显色非常弱，或不显色。
很多抗生素、农药、毒品的单克隆抗体很难筛选，使用受体蛋白检测，受体蛋白没有Fc段，不能够与抗体结合。
目前的解决方法是应用牛血清白蛋白（BSA）封闭胶体金颗粒混合化学染料在NC膜上划假C线。假C线的显色强度是恒定的，无T线与C线强弱的消长变换，这就丧失了一部分的灵敏度。另外假C线与胶体金标记物的活性无关，与免疫金的活性状态不同步，不能指示免疫金的活性状态，在质量控制上容易造成假阳性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体，所述C线抗体为酪蛋白抗体；所述C线抗体的重链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：1所示的序列；所述C线抗体的轻链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：2所示的序列。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述C线抗体是通过以酪蛋白为免疫源并经筛选得到的小鼠单克隆抗体，命名为CAB02；所述小鼠单克隆抗体的细胞株于2020年1月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.19285，保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述C线抗体在免疫胶体金混合标记中的应用。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述应用包括以下步骤：将C线抗体和待标记样品配制成样品混合液进行免疫胶体金标记。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述样品混合液中，C线抗体的浓度为0.8~1.5μg/mL。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述样品混合液中，待标记样品的浓度为4~6μg/mL。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，免疫胶体金标记的pH为8.3~9。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：本发明实施例提供了一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体，其为酪蛋白抗体，可与待标记样品进行混合，可以实现与真C线羊抗鼠的结合，从而可以增加T线与C线强弱的消长变换，以提高侧向层析检测的灵敏度和避免出现假阳性。
附图说明
图1为胶体金溶液的pH值与C线显色强度的关系曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。
实施例1
该实施例提供了一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体，该C线抗体为酪蛋白抗体，其制备筛选方法包括以下步骤：
（1）选用酪蛋白作为免疫原；其中，酪蛋白等封闭蛋白在自然样本中的含量丰度大，容易获得，且其特异性好，与其他检测物基本无交叉反应，以及具有易获得、成本低廉等优点。
（2）将酪蛋白注射到小鼠体内，进行一免、二免、三免、加强免四次免疫；具体的免疫程序如下：
一免：D0天，酪蛋白与弗氏完全佐剂混合注射到小鼠腹腔，用量50mg；
二免：D21天，酪蛋白与弗氏不完全佐剂混合注射到小鼠皮下，用量30mg；
三免：D35天，酪蛋白与弗氏完全佐剂混合注射到小鼠皮下，用量30mg；
加强免：D42天，酪蛋白与弗氏不完全佐剂混合注射到腹腔，用量50mg。
（3）将经上述四次免疫的小鼠用酶联免疫吸附测定（Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）血清效价，若血清效价大于10万，则无菌取免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞（SP20），并进行融合处理；然后，对融合处理的细胞进行培养筛选，即可得到酪蛋白的单克隆抗体，即为上述酪蛋白抗体，其克隆号为：4C12，命名为：CAB02，该抗体的重链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：1所示的序列，其轻链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：2所示的序列。另外，该小鼠单克隆抗体的细胞株于2020年1月8日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC No.19285。
其中，上述筛选的方法包括以下步骤：
1、将浓度为5μg/mL的酪蛋白，以100μL/well的量包被酶标板。
2、制备酪蛋白单克隆抗体，培养上清经1000倍稀释后，OD450nm值应大于2.0。
3、纯化酪蛋白单克隆抗体，调节浓度为5μg/mL，用免疫胶体金直接标记，标记pH为7.8-9.0。
4、使用NC膜，T线为0.5mg/mL酪蛋白，C线为0.5mg/mL羊抗鼠抗体，划膜液为0.05MPBS，40℃条件下干燥24小时。
5、筛选条件：ELISA检测与酪蛋白亲和力强，血清效价大于10万；与其他封闭蛋白无交叉反应；5μg/mL酪蛋白单克隆直接标记，免疫胶体金T线不显色，C线显色强度大于1200。
实施例2
该实施例提供了一种样品混合液，包括待标记样品以及上述实施例1提供的酪蛋白抗体；所述酪蛋白抗体的浓度为0.8μg/mL。所述待标记样品的浓度为4μg/mL。所述样品混合液的溶剂为水。其中，待标记样品为实际需要进行标记测试的样品；酪蛋白抗体的制备方法与实施例1相同。
实施例3
该实施例提供了一种样品混合液，包括待标记样品以及上述实施例1提供的酪蛋白抗体；所述酪蛋白抗体的浓度为1.5μg/mL。所述待标记样品的浓度为6μg/mL。所述样品混合液的溶剂为水。其中，待标记样品为实际需要进行标记测试的样品；酪蛋白抗体的制备方法与实施例1相同。
实施例4
该实施例提供了一种样品混合液，包括待标记样品以及上述实施例1提供的酪蛋白抗体；所述酪蛋白抗体的浓度为1μg/mL。所述待标记样品的浓度为5μg/mL。所述样品混合液的溶剂为水。其中，待标记样品为实际需要进行标记测试的样品；酪蛋白抗体的制备方法与实施例1相同。
实施例5
该实施例提供了一种上述样品混合液在免疫胶体金混合标记应用中的标记pH筛选方法，其包括以下步骤：
（1）取酪蛋白溶液5μg/mL，100μL/well包被酶标板，备用。
（2）利用现有的侧向层析试纸条对上述实施例1得到的酪蛋白抗体进行检测，其中，试纸条的NC膜上的T线为0.5mg/mL的酪蛋白，C线为0.5mg/mL的羊抗鼠，划膜液为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液，烘膜40℃、24h；然后，分别用不同pH值的胶体金溶液直接标记上述酪蛋白抗体，其分别对应的C线显色强度如附图1所示。从图中可以看出，当标记pH值在小于8.3之前，C线显色强度迅速下降，当标记pH值小于8.2时C线不显色。因此，酪蛋白抗体（CAB02）在免疫金标记的pH适用范围为8.3~9.0。
实施例6
该实施例提供一种免疫胶体金混合标记氯霉素抗体的方法，其包括以下步骤：
（1）往5mL离心管的离心管中加入2.4mL的胶体金溶液，接着，往离心管中添加0.1mol/L的碳酸钾溶液进行涡旋混匀2轮，将胶体金溶液的pH值调至8.3。
（2）取30μL上述实施例4提供的样品混合液（待标记样品为氯霉素抗体）添加至上述离心管中，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置10min；接着，添加24μL质量百分比浓度为12%的牛血清白蛋白溶液，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置5min；然后，添加24μL质量百分比浓度为12%的聚乙二醇溶液，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮后，再使用台式高速离心机，将离心管置于10000rpm的转速进行离心处理4min，弃上清，得到沉淀物。
（3）除去上述沉淀物表面的残液，然后加入300μL的复溶液进行摇晃重悬处理，并涡旋混匀2轮，得到标记溶液，即可完成对待标记样品的标记。该标记溶液可以直接加到侧向层析试纸条上进行测试分析。
实施例7
该实施例提供一种免疫胶体金混合标记氯霉素抗体的方法，其包括以下步骤：
（1）往5mL离心管的离心管中加入3.6mL的胶体金溶液，接着，往离心管中添加0.3mol/L的碳酸钾溶液进行涡旋混匀2轮，将胶体金溶液的pH值调至9。
（2）取30μL上述实施例4提供的样品混合液（待标记样品为氯霉素抗体）添加至上述离心管中，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置10min；接着，添加36μL质量百分比浓度为8%的牛血清白蛋白溶液，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置5min；然后，添加36μL质量百分比浓度为8%的聚乙二醇溶液，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮后，再使用台式高速离心机，将离心管置于15000rpm的转速进行离心处理4min，弃上清，得到沉淀物。
（3）除去上述沉淀物表面的残液，然后加入300μL的复溶液进行摇晃重悬处理，并涡旋混匀2轮，得到标记溶液，即可完成对待标记样品的标记。该标记溶液可以直接加到侧向层析试纸条上进行测试分析。
实施例8
该实施例提供一种免疫胶体金混合标记氯霉素抗体的方法，其包括以下步骤：
（1）往5mL离心管的离心管中加入3mL的胶体金溶液，接着，往离心管中添加0.2mol/L的碳酸钾溶液进行涡旋混匀2轮，将胶体金溶液的pH值调至8.6。
（2）取30μL上述实施例3提供的样品混合液（待标记样品为氯霉素抗体）添加至上述离心管中，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置10min；接着，添加30μL质量百分比浓度为10%的牛血清白蛋白溶液，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置5min；然后，添加30μL质量百分比浓度为10%的聚乙二醇溶液，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮后，再使用台式高速离心机，将离心管置于12000rpm的转速进行离心处理4min，弃上清，得到沉淀物。
（3）除去上述沉淀物表面的残液，然后加入300μL的复溶液进行摇晃重悬处理，并涡旋混匀2轮，得到标记溶液，即可完成对待标记样品的标记。该标记溶液可以直接加到侧向层析试纸条上进行测试分析。
对比例1
该对比例提供了一种现有免疫胶体金直接标记氯霉素抗体的方法，其与实施例8的唯一区别在于，将步骤（2）中的样品混合液替换成了5μg/mL的氯霉素抗体溶液（即没有添加酪蛋白抗体）。
对比例2
该对比例提供了一种免疫胶体金混合标记氯霉素抗体的方法，其与实施例8的唯一区别在于，在步骤（2）中所使用样品混合液中酪蛋白抗体的浓度为0.5μg/mL。
对比例3
该对比例提供了一种免疫胶体金混合标记氯霉素抗体的方法，其与实施例8的唯一区别在于，在步骤（2）中所使用样品混合液中酪蛋白抗体的浓度为2μg/mL。
对比例4
该对比例提供了一种免疫胶体金混合标记氯霉素抗体的方法，其与实施例8的唯一区别在于，在步骤（2）中所使用样品混合液中酪蛋白抗体的浓度为4μg/mL。
将上述实施例8、对比例1~4提供的标记方法分别与氯霉素侧向层析试纸条进行配合对不同氯霉素加标量的样品进行测试，其测试得到的T值、C值以及T/C值如下表1所示（每个条件平行测试3条取平均值）。其中，该氯霉素侧向层析试纸条的质控标准为：阴性，T值1100~1300，C值大于200，T/C值大于2.5；阳性（0.1ppb的氯霉素），T/C值0.7~0.9。另外，在使用实施例8以及对比例2~4提供的标记方法进行测试时，C线为真C线，即为羊抗鼠；在使用对比例1提供的标记方法进行测试时，C线为假C线，即为牛血清白蛋白封闭胶体金颗粒混合化学染料。
表1
Figure 82134DEST_PATH_IMAGE001
从上表1可以看出，本发明实施例通过将酪蛋白抗体与待标记样品进行混合，可以实现与真C线羊抗鼠的结合，从而可以增加T线与C线强弱的消长变换，以提高侧向层析检测的灵敏度30%~100%，以及可以避免出现假阳性。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<110> 北京纳百生物科技有限公司
<120> 一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Tyr Gly Ala Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Tyr Arg Leu Ser Cys Lys Ala Pro Gly Ile Thr Phe Ser Leu Ser
20 25 30
Ser Met His Trp Pro Arg Gln Ala Val Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ser Trp Tyr Asp Gly Ile Lys Arg Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Ala Gly Arg Phe Thr Ile Asp Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Ser Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Tyr Ala Val Ala Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Pro Thr Leu Val Thr Val Val
100 105 110
Ser Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Leu Phe Val Asp Ser Pro Cys
115 120 125
Ser Arg Ser Ser Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Asp Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Thr Ser Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Thr His Val Gly Phe Pro Ala Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val Val Thr Pro Ser Val Ser Ser Leu Cys
180 185 190
Asn Val Asp His Thr Lys Thr Tyr Thr Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 2
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Ile Val Leu Thr Gln Ser Glu Ala Thr Leu Ser Leu Pro Glu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Pro Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Leu Leu Lys Glu Leu Gly Gln Ala Glu Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Glu Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Ala Thr Ile Ser Ser Leu Pro Glu
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Val Thr Lys Glu Ile Lys Arg Gly Thr Val Val Phe
100 105 110
Ala Ser Pro Ser Ile Phe Ser Pro Lys Ser Asp Gln Leu Ser Gly Thr
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Thr His Gln Val Tyr Ala Cys Gly Lys Ser Phe Asn Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Arg Gly Glu Cys Ala Ser
210 215

Claims (7)

1.一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体，其特征在于，所述C线抗体为酪蛋白抗体；所述C线抗体的重链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：1所示的序列；所述C线抗体的轻链的氨基酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种适用于特定pH的胶体金混合标记用C线抗体，其特征在于，所述C线抗体是通过以酪蛋白为免疫源并经筛选得到的小鼠单克隆抗体，命名为CAB02；所述小鼠单克隆抗体的细胞株于2020年1月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.19285。
3.一种如权利要求1或2所述C线抗体在免疫胶体金混合标记中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将C线抗体和待标记样品配制成样品混合液进行免疫胶体金标记。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样品混合液中，C线抗体的浓度为0.8~1.5μg/mL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样品混合液中，待标记样品的浓度为4~6μg/mL。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤中，免疫胶体金标记的pH为8.3~9。
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