CN111646977B - 一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向泛素化降解TGF‑β1的化合物(Ⅰ)，所述靶向泛素化降解TGF‑β1的化合物是由TGF‑β1小分子配体和E3泛素连接酶识别配体通过不同单元的PEG连接链连接而成。本发明公开了一种所述化合物I的制备方法。本发明还公开了所述的靶向泛素化降解TGF‑β1的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗特发性肺纤维化疾病药物中的应用，该类新化合物具有较好的抗肺纤维化应用前景。

Description

一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物及药学上可接受的盐及其制备方法以及在制备预防或治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

背景技术

器官纤维化是一类严重危害人类身体健康及生命的重要疾病，如肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、心肌纤维化等。近年来，随着全球工业化以及人们生活、饮食方式的改变，纤维化疾病的发病率显著增加。

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)为原因不明、局限于肺，以普通型间质性肺炎为病理特征的慢性进行性发展的纤维化性间质性肺疾病。IPF侵犯肺泡壁、肺泡腔进而发展为弥漫性肺间质纤维化，最终导致呼吸衰减而死亡。有关统计表明，IPF患者自疾病确诊后的中值存活时间仅2-5年，5年存活率只有20％。该病预后不良，目前临床尚缺乏有效的治疗方法，属WHO所列疑难病之一。

近年来IPF发生有明显上升的趋势。目前临床可用于IPF疾病治疗的药物仅有吡非尼酮和尼达尼布，本领域迫切需要发现有效治疗IPF的新化合物和新治疗途径。

吡非尼酮(pirfenidone，PFD)是20世纪70年代发现的小分子化合物，其化学名称为5-甲基-1-苯基-2(1H)-吡啶酮。最初的研究发现吡非尼酮具有一定的抗炎、镇痛作用。之后，研究者发现吡非尼酮对于心、肺、肾、肝等多种组织的纤维化有抑制作用。2008年10月，吡非尼酮片剂(商品名Pirespa)由美国InterMune公司授权日本盐野义公司在日本首先上市。2011年3月，欧盟委员会批准了InterMune公司开发的吡非尼酮片剂(商品名Esbriet)，用于治疗成人轻至中度IPF患者。2014年10月美国FDA批准吡非尼酮用于轻至中度IPF治疗。

虽然吡非尼酮给IPF患者带来了希望，但是临床上发现吡非尼酮具有较多的副作用，包括肠胃不适(如呕吐、消化不良、腹泻、厌食)，乏力及光敏性皮炎等。研究发现上述这些副作用与吡非尼酮的高剂量有关。药代动力学研究发现其血浆半衰期较短。为了维持体内吡非尼酮有效的血浆浓度，高剂量和高频率用药成为必选的医治方案。现阶段，人们只能通过减少剂量或停止治疗来减轻吡非尼酮的副作用。因此，仍然迫切需要研发新型高效低毒的抗肺纤维化治疗药物。

传统的药物研发，主要集中在直接调控蛋白质或酶的活性来治疗疾病。蛋白质活性调节剂，特别是抑制剂的应用和开发一直是新药研发的主流，IPF治疗药物的研发也不例外。众所周知，TGF-β1在IPF的发生进展中起到关键作用：TGF-β1参与IPF的各个过程，是成纤维细胞的增殖、肌成纤维细胞的变异以及胶原沉积等多个关键步骤的主要促进因子。因而TGF-β1成为IPF治疗的重要靶标。吡非尼酮是一个有效的TGF-β1抑制剂。而近年来出现的靶向蛋白降解嵌合分子(PROTACs)策略则是一种新兴的药物研发思路。PROTACs是一种新分子，由靶蛋白识别配体、连接链和E3连接酶识别配体三部分组成。PROTAC策略通过募集泛素E3连接酶，完成靶蛋白泛素化，并通过细胞内的蛋白酶体降解，其特异性和可修饰性使其潜在应用前景十分广泛。

目前已有很多国内外学者研究PROTAC技术，包括设计合成针对特定靶蛋白，如雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、芳香烃受体(AHR)和蛋氨酸氨肽酶(MetAP)的PROTACs分子。降解的靶蛋白从最早的MetAP2、AR、细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)等，到最近的ER、Tau微管相关蛋白、激酶类等。涉及的疾病包括癌症、类风湿和神经退行性疾病等。2019年美国Arvinas公司开发的PROTACs分子ARV-110和ARV-471相继进入I期临床试验(NCT03888612和NCT04072952)，这是公开报道的第一、二个进入临床试验的PROTACs分子。ARV-110和ARV-471均为口服PROTAC蛋白降解剂。前者通过靶向降解AR治疗前列腺癌；后者通过靶向降解ER治疗ER阳性/HER2阴性乳腺癌。

中国学者Wang等将Smad3蛋白抑制剂与E3连接酶VHL通过连接链连接设计得到如下结构的PROTACs分子，研究发现对Smad3蛋白有较好的降解效率，对肾纤维化有一定的抑制作用。

PROTAC技术在抗肿瘤药物的研发领域表现出了巨大的潜力。目前尚无基于PROTAC技术的化合物干预IPF的报道。

本发明中设计的PROTACs化合物由TGF-β1小分子配体和E3泛素连接酶识别配体通过不同单元的PEG连接链连接而成，可对靶蛋白TGF-β1进行泛素化标记，诱导TGF-β1蛋白降解。通过降解TGF-β蛋白从而抑制成纤细胞增殖、减少羟脯氨酸生成，进而抑制胶原的生成减少胶原沉积，其抗肺纤维化效果优于现有的治疗药物吡非尼酮。并且可降低药物使用剂量，减轻毒副作用。

发明内容

针对现有技术中，IPF治疗药物吡非尼酮高剂量引起的肠胃不适、乏力及光敏性皮炎等诸多副作用，本发明提供一种高效低毒的抗肺纤维化化合物及其药学上可接受的盐。本发明通过使用不同单元的PEG连接链将TGF-β1小分子配体和E3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白配体连接获得新化合物。本发明涉及的PROTACs化合物，能够泛素化标记TGF-β1，选择性诱导TGF-β1降解，进而干预肺纤维化过程，起到抗肺纤维化功效。

本发明的技术方案如下：

一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物，具有如式I所示结构：

其中，R独立地选自甲基、乙基、异丙基、三氟甲基、二氟甲基、乙烯基、氟或氰基；n为2-5的整数。

进一步优选，所述的化合物选自：

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(2-(2-(4-(5-(甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(PP2)；

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(2-(2-(2-(4-(5-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(PP3)；

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(2-(2-(2-(2-(4-(5-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(PP4)；

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(14-(4-(5-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)-3,6,9,12-四氧十四烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(PP5)。

本发明化合物在药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的盐为所述的化合物与无机酸、有机酸反应成盐。所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、草酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、柠檬酸盐或琥珀酸盐。

本发明还提供了一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物的制备方法，包括步骤a和步骤b。

步骤a：以化合物II和叠氮n甘醇对甲苯磺酸酯为原料，碳酸钾为缚酸剂，经亲核取代反应获得化合物III；

步骤b：以化合物III与化合物IV为原料，在维生素C钠、硫酸铜、水的催化下，经点击化学反应得到通式(I)表示的化合物。

化合物IV的结构如下：

一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗特发性肺纤维化疾病药物中的应用。初步的药理试验发现该类化合物对人肺成纤维细胞HFL1有较好的抑制增殖作用，增殖抑制作用大大强于吡非尼酮。其次具有显著的减少羟脯氨酸生成、抑制胶原合成的作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

提供了一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物；应用靶向泛素化降解蛋白质技术，通过化学合成的方法用不同单元的PEG连接链将TGF-β1小分子配体(化合物II)和泛素连接酶复合体中cereblon蛋白配体(化合物IV)连在一起，构建新颖的化合物。在体外证实所构建的化合物能泛素化降解TGF-β1；并且证实该类化合物通过特异性泛素化途径降解TGF-β1蛋白。由于TGF-β1是已知致纤维化最关键的细胞因子，其极可能成为IPF的治疗新药，不仅具有科学价值还具有重要的社会价值。

附图说明

图1为HFL1细胞模型中不同浓度PROTACs化合物PP2-PP5对TGF-β1蛋白的降解作用图；

图2为HFL1细胞模型中333μM PROTACs化合物PP2-PP5对TGF-β1蛋白降解作用图；

图3为PROTACs化合物PP2-PP5泛素化靶向降解TGF-β1的验证图；

图4为PROTACs化合物PP2-PP5对TGF-β1诱导HFL1细胞分泌羟脯氨酸的相对抑制率图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。

化合物的结构通过核磁共振(NMR)来确定。¹H-NMR和¹³C-NMR采用BRUKER DRX 400型核磁共振仪测定，溶剂为氘代氯仿(CDC1₃)或氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)，TMS为内标。HRMS采用Waters Synapt G2测定，熔点采用Buchi M565熔点仪测定。柱层析采用200-300目硅胶。

实施例1 TGF-β小分子配体的制备

1-(4-羟基-苯基)-5-甲基-1H-吡啶-2-酮(II，R为CH₃)

根据申请号为200810201706.9的中国发明专利公开的方法制得。m.p.167-169℃。¹HNMR(δ,CDCl₃)：7.34-7.37(m,1H),7.14(s,1H),6.97-7.00(d,2H),6.68(s,1H),6.62-6.66(m,2H),2.12(s,3H)。

实施例2 E3连接酶配体的制备

(1)羟基沙利度胺(IV a)

三口烧瓶中依次加入3-羟基邻苯二甲酸酐10.0g(0.06mol)，3-氨基-2,6-哌啶二酮盐酸盐10.0g(0.06mol)和100mL甲苯。氮气保护下，加热回流反应12h，有灰色固体析出，TLC监测反应结束。冷却至室温，抽滤、干燥后得12.0g灰白色粉末。收率73％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₁₃H₁₀N₂O₅[M+Na]⁺:297.0487；found:297.0489.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.21(s,1H),11.13(s,1H),7.66(dt,J＝11.7,5.9Hz,1H),7.37-7.30(m,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,1H),5.10(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),3.05-2.78(m,1H),2.59(ddd,J＝21.9,14.5,11.0Hz,2H),2.16-1.87(m,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ173.30,170.51,167.65,166.30,155.93,136.84,133.61,124.47,124.02,114.80,49.11,31.44,22.51。

(2)炔丙氧基沙利度胺(IV)

三口烧瓶中依次加入羟基沙利度胺(IV a)274mg(1mmol)，3-溴丙炔119mg(1mmol)，加入20mL无水DMF和碳酸钾138mg(1mmol)。氮气保护下室温搅拌反应4h，TLC监测反应结束。加入100mL水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩柱层析，得白色粉末状固体115mg，收率37％。HRMS m/z(ESI)calcd forC₁₆H₁₂N₂O₅[M+H]⁺:313.0824；found:313.0826.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.12(s,1H),7.96-7.75(m,1H),7.57(d,J＝8.5Hz,1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),5.16-5.10(m,1H),5.09(d,J＝2.4Hz,2H),3.70(t,J＝2.3Hz,1H),2.98-2.83(m,1H),2.65-2.52(m,2H),2.24-1.89(m,1H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ173.26,170.39,167.17,165.64,154.75,137.31,133.82,120.69,117.31,116.50,79.89,78.72,56.92,49.28,31.42,22.43。

实施例3连接链的制备

(1)叠氮二甘醇对甲苯磺酸酯(1)

将二甘醇二对甲苯磺酸酯415mg(1mmol)，叠氮化钠65mg(1mmol)分别加入三口烧瓶中。加入10mL无水DMF，氮气保护下，60℃搅拌反应4h。TLC监测反应结束。冷却至室温，加入40mL冷水，乙酸乙酯少量多次萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，合并滤液浓缩得黄色油状物。柱层析得80mg浅黄色液体，收率：28％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₁₁H₁₅N₃O₄S[M+Na]⁺:308.0681；found:308.0688。

(2)叠氮三甘醇对甲苯磺酸酯(2)

操作过程参见实施例3(1)，用三甘醇二对甲苯磺酸酯替代二甘醇二对甲苯磺酸酯，得96mg浅黄色液体，收率：29％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₁₃H₁₉N₃O₅S[M+Na]⁺:352.0943；found:352.0952。

(3)叠氮四甘醇对甲苯磺酸酯(3)

操作过程参见实施例3(1)，用四甘醇二对甲苯磺酸酯替代二甘醇二对甲苯磺酸酯，得105mg浅黄色液体，收率：28％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₁₅H₂₃N₃O₆S[M+H]⁺:374.1386；found:374.2068。

(4)叠氮五甘醇对甲苯磺酸酯(4)

操作过程参见实施例3(1)，用五甘醇二对甲苯磺酸酯替代二甘醇二对甲苯磺酸酯，得120mg浅黄色液体，收率：29％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₁₇H₂₇N₃O₇S[M+Na]⁺:440.1467；found:440.1471。

实施例4 TGF-β1配体与连接链的组合

(1)叠氮二甘醇吡非尼酮(5)

将叠氮二甘醇对甲苯磺酸酯(1)285mg(1mmol)，TGF-β1配体(II)241.2mg(1.2mmol)分别加入三口烧瓶中。加入20mL无水DMF，氮气保护下，60℃搅拌反应4h。TLC监测反应结束。冷却至室温，加入80mL水，乙酸乙酯少量多次萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得黄色油状物。柱层析洗脱得102mg浅黄色液体，收率：32％。HRMS m/z(ESI)calcd forC₁₆H₁₈N₄O₃[M+H]⁺:315.1457；found:315.1463。

(2)叠氮三甘醇吡非尼酮(6)

操作过程参见实施例4(1)，用叠氮三甘醇对甲苯磺酸酯(2)替代叠氮二甘醇对甲苯磺酸酯(1)，得110mg浅黄色液体，收率：31％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₁₈H₂₂N₄O₄[M+Na]⁺:381.1539；found:381.1514。

(3)叠氮四甘醇吡非尼酮(7)

操作过程参见实施例4(1)，用叠氮四甘醇对甲苯磺酸酯(3)替代叠氮二甘醇对甲苯磺酸酯(1)，得120mg浅黄色液体，收率：30％。HRMS m/z(ESI)calcd for C20H26N4O5[M+H]+:403.1981；found:403.1986。

(4)叠氮五甘醇吡非尼酮(8)

操作过程参见实施例4(1)，用叠氮五甘醇对甲苯磺酸酯(4)替代叠氮二甘醇对甲苯磺酸酯(1)，得122mg浅黄色液体，收率：27％。HRMS m/z(ESI)calcd for C₂₂H₃₀N₄O₆[M+H]⁺:447.2244；found:447.2249。

实施例5 PROTACs化合物PP2

将炔丙氧基沙利度胺(IV)78mg(0.25mmol)，叠氮二甘醇吡非尼酮(4)79mg(0.25mmol)，抗坏血酸钠10mg(0.05mmol)，无水硫酸铜8mg(0.05mmol)依次加入三口烧瓶中，加入5mL四氢呋喃，滴入若干滴冷水并置换氮气保护。室温搅拌反应24h，TLC监测反应结束。过滤，滤液浓缩，柱层析度洗脱得白色粉末状固体78mg。收率50％。mp:179.6p 180.4℃.HRMS m/z(ESI)calcd for C₃₂H₃₀N₆O₈[M+H]⁺:627.2202；found:627.2203.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.11(s,1H),8.25(d,J＝3.9Hz,1H),7.87-7.78(m,1H),7.73(d,J＝8.6Hz,1H),7.47(dd,J＝7.1,3.4Hz,1H),7.36(s,1H),7.35-7.19(m,2H),7.16-6.96(m,2H),6.93-6.85(m,1H),6.40(d,J＝9.7Hz,1H),5.39(d,J＝2.8Hz,2H),5.16-4.94(m,1H),4.60(dd,J＝10.1,5.0Hz,2H),4.17-3.96(m,2H),3.88(ddd,J＝13.8,9.9,4.8Hz,2H),3.84-3.65(m,2H),3.48-3.28(m,3H),2.17-1.79(m,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ173.25,170.38,167.24,165.71,161.07,158.21,155.73,143.34,142.24,137.40,136.81,134.38,133.75,128.25,125.80,120.65,116.98,116.10,115.02,114.33,72.92,67.66,62.66,49.60,31.40,29.29,22.45,18.65,16.78。

实施例6 PROTACs化合物PP3

操作过程参见实施例5，用叠氮三甘醇吡非尼酮(6)代替叠氮二甘醇吡非尼酮(5)，得白色粉末状固体92mg。收率55％。mp:186.5p 187.2℃。HRMS m/z(ESI)calcd forC₃₄H₃₄N₆O₉[M+H]⁺:671.2466；found:671.2466。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.11(s,1H),8.25(s,1H),7.87(m,1H),7.73(d,J＝8.6Hz,1H),7.47(d,J＝7.1Hz,1H),7.36(s,1H),7.25(d,J＝8.9Hz,2H),6.99(d,J＝8.9Hz,2H),6.88(d,J＝8.9Hz,1H),6.43(m,1H),5.39(s,2H),5.07(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),4.56(t,J＝5.1Hz,2H),4.15(m,2H),4.03(t,J＝7.1Hz,2H),3.83(t,J＝5.0Hz,2H),3.70(dd,J＝9.7,5.3Hz,2H),3.55(d,J＝3.5Hz,2H),2.96(m,2H),2.00(s,3H),1.17(t,J＝7.1Hz,2H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ173.27,170.39,167.24,165.71,161.06,158.27,155.71,143.35,142.21,137.42,136.84,134.33,133.74,128.26,125.78,120.63,116.96,116.09,115.03,114.32,70.13,69.30,69.16,67.89,62.64,55.40,49.97,49.21,31.39,22.44,16.78。

实施例7 PROTACs化合物PP4

操作过程参见实施例5，用叠氮四甘醇吡非尼酮(7)代替叠氮二甘醇吡非尼酮(5)，得白色粉末状固体98mg。收率55％。mp:182.7p 183.9℃。HRMS m/z(ESI)calcd forC₃₆H₃₈N₆O₁₀[M+H]⁺:715.2728；found:715.2728.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.13(s,1H),8.25(s,1H),7.91-7.78(m,1H),7.72(dd,J＝19.3,10.1Hz,1H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.46–7.15(m,1H),7.18-7.08(m,2H),7.11-6.91(m,1H),6.92(dd,J＝19.2,8.8Hz,2H),6.39(d,J＝15.2Hz,1H),5.42(s,2H),5.08(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),4.55(t,J＝4.9Hz,2H),4.09-4.01(m,2H),3.82(t,J＝5.0Hz,2H),3.73-3.67(m,2H),3.55(dd,J＝5.8,3.3Hz,2H),3.53–3.51(m,2H),3.49(t,J＝4.0Hz,4H),3.33–3.17(m,2H),2.10-1.95(m,3H),1.59-1.41(m,2H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ173.28,170.39,169.08,167.24,165.70,156.90,155.71,142.19,137.44,136.98,133.74,128.27,127.85,125.80,120.73,120.51,116.95,116.10,114.89,114.37,70.17,69.23,67.81,62.62,58.22,49.96,49.22,33.18,29.17,22.44,18.65。

实施例8 PROTACs化合物PP5

操作过程参见实施例5，用叠氮五甘醇吡非尼酮(8)代替叠氮二甘醇吡非尼酮(5)，得白色粉末状固体86mg。收率45％。mp:188.1p 188.9℃。HRMS m/z(ESI)calcd forC₃₈H₄₂N₆O₁₁[M+H]⁺:759.3005；found:759.2990.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.09(s,1H),8.24(s,1H),7.88-7.78(m,1H),7.74(d,J＝8.5Hz,1H),7.47(d,J＝7.1Hz,1H),7.36(dd,J＝12.1,2.7Hz,2H),7.30-7.27(m,1H),7.27-7.25(m,1H),7.12-6.90(m,2H),6.39(d,J＝9.2Hz,1H),5.75(s,1H),5.42(s,2H),5.07(dd,J＝12.7,5.3Hz,1H),4.54(t,J＝5.1Hz,2H),4.10(dd,J＝20.2,15.4Hz,2H),3.81(t,J＝5.2Hz,2H),3.77-3.70(m,2H),3.57(dd,J＝5.9,3.2Hz,2H),3.55-3.49(m,4H),3.50–3.43(m,6H),2.94-2.80(m,1H),2.56(t,J＝14.1Hz,1H),2.02(d,J＝9.5Hz,3H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ173.24,170.36,167.24,165.69,161.07,158.30,155.74,143.34,142.21,137.42,136.86,134.37,133.76,128.28,125.78,120.79,120.53,116.99,116.10,115.07,114.31,70.38,70.24,70.08,70.02,69.32,69.11,67.94,62.67,55.49,49.96,49.23,31.40,22.45,16.77。

实施例9 PROTACs化合物PP3的盐酸盐

取PP3 100mg，溶于1mL乙酸乙酯，冰水浴中冷却至0℃，滴加饱和HCl乙酸乙酯溶液，离心干燥得白色固体，收率70％。

实施例10 PROTACs化合物稳定性评价

化合物：PP2，PP3，PP4和PP5；

温度：室温25℃，细胞培养箱37℃；

介质：乙腈，水，pH＝8的磷酸盐缓冲液，含10％胎牛血清的F12K完全培养基；

时间：0,1,3,6,12,24,36,48h；

方法：4个PROTACs化合物在上述温度、上述介质和上述时间间隔分别取样，经前处理后HPLC进样比较。

结论：化合物PP2，PP3，PP4和PP5在不同温度：25℃、37℃，在不同介质：乙腈，水，pH＝8的磷酸盐缓冲液和含10％胎牛血清的F12K完全培养基48h内稳定。

实施例11 PROTACs化合物降解效率考察

Western Blot检测PROTACs化合物给药后TGF-β1蛋白水平变化

选用对数生长期的贴壁HFL1细胞，胰酶消化后，用F12K完全培养基将HFL1细胞悬液(5×10⁵个/2mL)接种于6孔板，放置含5％二氧化碳培养箱24h。弃上清，用含2％FBS的低血清培养基饥饿处理12h后，加入含TGF-β1(10ng/mL)的完全培养基诱导24h后，分别给药一定浓度的PP2、PP3、PP4、PP5、PFD孵育24h，低、中、高剂量分别为100,333,1000μM。

弃上清，PBS洗两次，采用RIPA∶PMSF(100∶1)裂解液，冰上操作，离心提取蛋白。根据Broadford试剂盒的使用说明测样品的总蛋白浓度。按10μL体积上样。电泳、转膜。5％脱脂奶粉室温封闭2h。一抗孵育TGF-β1(1:1000)、β-actin(1:1000)，4℃过夜。次日，二抗室温下孵育2h后，发光、拍照，采用软件对蛋白条带进行结果计算，结果见图1和图2。

图1为HFL1细胞模型中PROTACs化合物对TGF-β1蛋白的降解作用图。图2为HFL1细胞中333μM PROTACs化合物对TGF-β1蛋白降解作用图。由图1可见：PROTACs化合物在TGF-β1诱导的HFL1细胞模型中对TGF-β1蛋白有一定的降解作用，随着PROTACs化合物浓度的增加，TGF-β1蛋白的含量逐渐降低，TGF-β1蛋白降解效率逐渐增加。由图2可见：在中剂量333μM时，PROTACs化合物PP3具有较高的TGF-β1蛋白降解效率，其TGF-β1蛋白含量较阳性对照PFD低了近1倍。

实施例12 PROTACs化合物靶向泛素化途径降解TGF-β1作用的验证

为验证PROTACs化合物是否通过蛋白酶体途径降解TGF-β1，在细胞给药中分别加入或不加入蛋白酶体阻断剂MG32(10μM)和NAE特异性小分子抑制剂MLN4924(10μM)。按照实施例10处理HFL1细胞，经TGF-β1(10ng/mL)诱导24h后，分别给药一定浓度的PP2、PP3、PP4、PP5、MG32和MLN4924孵育24h。

按照实施例11进行Western Blot检测，结果见图3。图3为PROTACs化合物PP2-PP5泛素化靶向降解TGF-β1的验证图。由图3可见，在加入MG32阻断蛋白酶体途径后，TGF-β1仅能被PROTACs化合物泛素化而无法通过蛋白酶体途径被降解。另一种情况：加入NAE特异性小分子抑制剂MLN4924后，由于灭活了CRL E3连接酶，PROTACs化合物无法靶向泛素化途径降解TGF-β1。综合上述实验结果，表明PROTACs化合物PP2-PP5确实是通过靶向泛素化蛋白酶体途径来降解靶蛋白TGF-β1的。

实施例13抗肺纤维化生物活性测试

人肺成纤维细胞离体培养：选取人肺成纤维细胞HFL1，含10％FBS的F12K培养基常规培养。

(1)MTT法测定PROTACs化合物对TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞HFL1增殖的抑制作用：

选用对数生长期的贴壁HFL1细胞，胰酶消化后，用F12K完全培养基将HFL1细胞(5000个/100μL)接种于96孔板，置于5％的二氧化碳培养箱24h，用含2％FBS的低血清培养基饥饿处理12h后，加入含TGF-β1 10ng/mL的完全培养基孵育24h，配置不同浓度的PP2、PP3、PP4、PP5、PFD进行给药，每组设置3个复孔并设置调零孔，药物作用24h后，加入提前配置好的MTT溶液(5mg/mL)，37℃培养箱孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，酶标仪上490nm处测定OD值。计算以上4个PROTACs化合物和PFD对TGF-β1诱导增殖的IC₅₀值。所得结果见表1。

表1化合物对TGF-β1诱导HFL1细胞增殖的抑制作用

化合物	n	IC<sub>50</sub>(mmol/L)
			PP2	2	0.72
PP3	3	0.59
			PP4	4	0.75
PP5	5	0.58
			PFD		2.49

从表1中可以看出：4个化合物对TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞HFL1增殖均有一定的抑制作用，其IC₅₀值均小于阳性对照吡非尼酮；其中PP3和PP5的IC₅₀值较小。

(2)化合物对TGF-β1诱导HFL1细胞分泌羟脯氨酸的抑制作用

选用对数生长期的贴壁HFL1细胞，胰酶消化后，用F12K完全培养基将HFL1细胞悬液(5×10⁵个/2mL)接种于6孔板，放置含5％二氧化碳培养箱24h。弃上清，用含2％FBS的低血清培养基饥饿处理12h后，加入含TGF-β1(10ng/mL)的完全培养基诱导24h后，分别给药不同浓度的PP2、PP3、PP4、PP5、PFD孵育24h。取500μL上清培养液，每孔平行取3次上清培养液，，按照羟脯氨酸测定试剂盒(消化法，南京建成生物工程研究所有限公司)说明书测定上清液中的羟脯氨酸含量。结果见表2与图4。图4化合物对TGF-β1诱导HFL1细胞分泌羟脯氨酸的相对抑制率图(n＝3,

)。

表2化合物对TGF-β1诱导HFL1细胞分泌羟脯氨酸的抑制作用(n＝3,

)

羟脯氨酸相对抑制率(％)计算公式：(1-实验组/模型组)×100％

表2和图4可见：经TGF-β1诱导，可显著性促进HFL1细胞分泌羟脯氨酸。提示HFL1细胞已发生纤维化，体外肺纤维化模型构建成功。在给予PROTACs化合物治疗后羟脯氨酸水平显著降低并呈现剂量依赖性。4个化合物抑制羟脯氨酸效果较为接近，低剂量组与阳性对照吡非尼酮中剂量组效果相当，中剂量组与吡非尼酮高剂量组效果相当。结合增殖抑制实验与羟脯氨酸抑制实验结果，提示PROTACs化合物能显著干预肺纤维化。该类新化合物具有较好的抗肺纤维化应用前景。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

Claims (7)

1.一种靶向泛素化降解TGF-β1的化合物，其特征在于，为如式I所示结构的化合物：

其中，R为甲基；n为2-5的整数。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的化合物选自以下四种：

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(2-(2-(4-(5-(甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮，结构式如PP2所示；

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(2-(2-(2-(4-(5-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮，结构式如PP3所示；

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(2-(2-(2-(2-(4-(5-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮，结构式如PP4所示；

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((1-(14-(4-(5-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)苯氧基)-3,6,9,12-四氧十四烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)异吲哚啉-1,3-二酮，结构式如PP5所示；

3.如权利要求1或2所述的化合物在药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐为所述的化合物与无机酸、有机酸反应成盐。

4.如权利要求1或2所述的化合物在药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、草酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、柠檬酸盐或琥珀酸盐。

5.如权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，

步骤a：以化合物II和叠氮n甘醇对甲苯磺酸酯为原料，碳酸钾为缚酸剂，经亲核取代反应获得化合物III；

所述的叠氮n甘醇对甲苯磺酸酯为

步骤b：以化合物III与化合物IV为原料，在维生素C钠、硫酸铜、水的催化下，经点击化学反应得到式I表示的化合物；

6.如权利要求1或2所述的化合物在制备治疗特发性肺纤维化疾病药物中的应用。

7.如权利要求3或4所述的化合物在药学上可接受的盐在制备治疗特发性肺纤维化疾病药物中的应用。

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