CN111494649B - 石墨烯量子点与钆离子螯合物磁共振造影剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开石墨烯量子点与钆离子螯合物(Gd@GQDs)，属于纳米材料领域，所述石墨烯量子点与钆离子螯合物为纳米材料，表面带有亲水基团；其制备方法是利用Hummers法制备得到氧化石墨烯，再经过加热氧化和提纯，得到纯净的石墨烯量子点，最后与Gd³⁺螯合形成稳定的Gd@GQDs。本发明制备的Gd@GQDs易分散于水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、生物培养基等水溶液体系中；具有良好的生物相容性和低毒性；在1.5T磁共振测试系统中，表现出优异的T₁加权造影性能，其r₁弛豫率高达72mM^‑1s^‑1，比现有商用T₁加权磁共振造影剂Gd‑DTPA的r₁值高二十倍。

Description

石墨烯量子点与钆离子螯合物磁共振造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及石墨烯量子点与钆离子螯合物磁共振造影剂及其制备方法，属于纳米新材料技术领域。

背景技术

磁共振成像(MRI)是临床应用中最广泛使用的诊断工具之一。MRI具有许多优点，例如无创性、高空间和时间分辨率，以及良好的软组织对比度。尽管如此，组织之间的固有信号差异，尤其是患病和正常组织之间的差异并没有那么大。因此，通常在扫描之前注射MRI造影剂以改善成像质量。按照作用原理来分类，MRI造影剂可分为纵向弛豫造影剂(T₁造影剂)和横向弛豫造影剂(T₂造影剂)。最常用的T₁造影剂是钆基造影剂，因为Gd³⁺能提供七个未成对电子，导致较高的纵向弛豫率(r₁)。然而，游离Gd³⁺具有高毒性，Gd³⁺在体内能诱发一种称为肾源性系统性纤维化(NSF)的罕见疾病，特别是对于肾功能受损的患者更为致命。为了抑制其毒性，通常使用各种配体与Gd³⁺络合以达到游离的Gd³⁺释放最小化。实例包括Gd-DTPA(DTPA-二亚乙基三胺五乙酸)，钆特酸，Gd-DO3A butrol(DO3A-1,4,7-三(羧甲基)环十二烷-10-氮杂乙酰胺)，钆双胺等。但是，这些钆基螯合物的钆含量和实际用量都很高，仍然会导致Gd³⁺在体内的泄漏从而造成生物安全性问题。因此，迫切需要开发具有极低Gd³⁺含量、生物安全性好以及同时保持高性能的T₁加权造影剂。

石墨烯量子点(GQDs)主要是由sp²杂化碳原子构成，其晶格间距与石墨相同，横向尺寸小于100nm、原子层数少于10层的二维石墨烯薄片。GQDs不仅具有石墨烯的优异性能，如比表面积大、电子迁移率高以及机械强度好，而且拥有优异的荧光性能和光稳定性、低毒性、良好的生物相容性以及表面易修饰等。因为这些优异的特性，使得GQDs在生物医学成像、光学材料与器件、生物传感和环境检测等领域都具有很大应用前景，尤其是为构建临床应用多模式成像平台提供了材料基础。

随着人们对癌症等重大疾病的早期诊断和精准治疗的迫切需求，像MRI、荧光成像和超声波成像等单一的诊断技术已经无法满足人们的需求。因此，集合多种功能于一身的多模式成像技术及其材料受到科研工作者的广泛关注和研究。本发明针对上述问题，发明了兼具MRI和荧光成像功能的GQDs与钆离子螯合物作为医用显影剂。

与本发明相关的现有技术：以碳量子点与钆的复合物作为磁共振造影剂的文献已经发表在国际学术期刊Advanced Materials 2014,26,6761–6766和Advanced Materials2018,1802748上。该工作是利用有机小分子与钆离子络合、或者是利用已有商用钆基造影剂通过水/溶剂热法合成了碳量子点与钆的复合物，然后用于磁共振成像。这种方法的缺点是原料成本昂贵、得到的碳量子点与钆的复合物结构十分不明确，而且其钆含量和造影时使用量都较高，后期会对生物体造成较大影响。更重要的是，该造影剂的纵向弛豫率r₁要远远小于本发明造影剂的r₁，因此其T₁加权造影效果远不如本发明专利技术。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种石墨烯量子点与钆离子螯合物，其生物相容性好、毒性低，可应用于磁共振成像以及荧光成像，具有优异的T₁加权造影效果和高效荧光功能。

本发明还同时提供了该石墨烯量子点与钆离子螯合物的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用石墨烯量子点与钆离子螯合物，所述石墨烯量子点与钆离子螯合物为纳米材料，其具有比表面积大，光学性质稳定，表面带有亲水基团等特点。

另外，本发明还提供了所述的石墨烯量子点与钆离子螯合物的制备方法，利用Hummers法制备得到氧化石墨烯，再经过加热氧化，得到纯净的石墨烯量子点，最后与Gd³⁺螯合形成稳定的石墨烯量子点与钆离子螯合物。

作为改进，具体包括以下步骤：

1)使用Hummers法制备得到氧化石墨烯；

2)称取制得的氧化石墨烯，溶解在去离子水中，超声处理，再加入一定量的强氧化剂充分溶解；

3)在上述溶液中加入400-1000μL的碱性化合物，然后在70-120℃下回流7-12h；

4)回流结束后，提纯、干燥，得到石墨烯量子点，其具有二维规则形貌、尺寸均一、横向尺寸在3-6nm之间、厚度在1-2nm之间、非激发光依赖性发光等特点；

5)将纯净的石墨烯量子点配制成一定浓度的溶液，再加入一定量的氯化钆溶液在一定条件下进行螯合反应；

6)将反应后溶液进行提纯、干燥，制得石墨烯量子点与钆离子螯合物。

作为改进，所述步骤2)中的超声功率为500-800W。

作为改进，所述步骤2)中的强氧化剂采用过硫酸钾、过氧化氢、浓硫酸、浓硝酸、次氯酸中的一种或多种的混合。

作为改进，所述步骤2)中氧化石墨烯和强氧化剂的质量比为(1-3)：(1000-3000)；所述氧化石墨烯与去离子水的质量比为(1-3)：(1000-3000)。

作为改进，所述步骤3)中的碱性化合物为氢氧化钾、氢氧化钠、氨水、水合肼、乙二胺、羟胺中的一种或多种的混合。

作为改进，所述步骤4)和步骤6)中的提纯为抽滤、层析、透析、过滤、萃取、蒸馏分馏中的任一种或多种；所述步骤4)和步骤6)中的干燥为真空干燥、冷冻干燥、高温干燥中的任一种或多种。

作为改进，所述步骤5)中石墨烯量子点配成的溶液浓度为0.05-0.4mg mL^-1；所述氯化钆溶液的浓度为0.1-0.5mmol L^-1。

作为改进，所述步骤5)中的螯合反应，采用常规的水浴加热、水热反应、溶液透析、常温处理中的任一种均可，只是常温处理螯合时间相对会较长些。

最后，本发明还提供了一种所述螯合物或者由所述制备方法得到的石墨烯量子点与钆离子螯合物作为医学影像显影剂的应用。

作为改进，所述的医学影像显影剂包括磁共振成像造影剂和荧光成像所用显影剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明制备的石墨烯量子点与钆离子螯合物(Gd@GQDs)为纳米材料，表面带有羟基、羧基、氨基等亲水基团，该样品尺寸均一，具有稳定的光学性能，且易于进行表面修饰。

2)本发明制备的Gd@GQDs易分散于水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、生物培养基等水溶液体系中。

3)通过MTT法测试本发明制得Gd@GQDs的细胞毒性，测试结果显示采用MCF-7和CHO细胞与不同浓度的Gd@GQDs和DMEM培养基溶液共培养24h后，细胞的存活率仍维持在90％以上，表明本发明制得的Gd@GQDs具有非常低的毒性。

4)本发明制备的Gd@GQDs同时具有优异的荧光性能，其荧光具有标准的石墨烯量子点的非激发光波长依赖性。分别用紫外光、蓝光和绿光激发可以呈现出蓝色、绿色和红色的荧光，可应用于荧光成像技术。

5)本发明制备的Gd@GQDs在1.5T磁共振测试系统中，表现出优异的T₁加权造影性能，其r₁弛豫率高达72mM^-1s^-1，是上述文献报道的碳量子点与钆的复合物造影剂r₁的5-12倍，同时也是现有商用T₁加权磁共振造影剂Gd-DTPA的r₁值(3.0～4.0mM^-1s^-1)的二十倍以上。尤为重要的是，在实际应用中，Gd@GQDs中Gd³⁺的注射用量是上述文献中钆基T₁造影剂和一般商用钆基T₁造影剂的五十分之一。此外，本发明Gd@GQDs材料中Gd³⁺的含量虽然只有上述文献中钆基T₁造影剂的四分之一到三分之一之间，但是仍能达到很好的磁共振造影效果，这使得从源头上避免了Gd³⁺的大量泄漏隐患。因此本发明的Gd@GQDs磁共振造影剂在临床上具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明制得Gd@GQDs的透射电子显微镜图像；

图2为本发明制得Gd@GQDs的傅立叶变换红外光谱图；

图3为本发明制得Gd@GQDs的MTT法细胞毒性测试结果(不同浓度的Gd@GQDs与CHO和MCF-7细胞共培养24h)。

图4为本发明制得Gd@GQDs的水溶液，在1.5T磁共振造影系统中r₁和r₂弛豫率(图中R²为拟合相关系数)。

图5为本发明制得Gd@GQDs、GQDs、氯化钆、Gd-DTPA与MCF-7细胞共培养后，在1.5T磁共振造影系统中T₁加权磁共振图像。

图6为本发明制得Gd@GQDs用于细胞显影的荧光显微镜图像(比例尺：50μm)，依次为明场(左上)、蓝色荧光(右上)、绿色荧光(左下)、红色荧光(右下)。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1

一种石墨烯量子点与钆离子螯合物的制备方法，具体包括以下步骤：

1)使用Hummers法制备得到氧化石墨烯(该方法引用自文献：ACS Nano,2010,4(8),4806–4814.)；

2)称取20mg上述氧化石墨烯，溶解在60g去离子水中，超声功率为500W处理，再加入60g过氧化氢充分溶解；

3)在上述溶液中加入1000μL水合肼溶液，然后将上述溶液转移到圆底烧瓶中，在100℃的油浴锅中回流8h；

4)回流反应结束后，将上述溶液进行过滤提纯处理，除去大块的杂质，再进行高温(80℃)干燥处理，得到GQDs，其具有二维规则形貌、尺寸均一、横向尺寸在3-6nm之间、厚度在1-2nm之间、非激发光依赖性发光等特点；

5)将上述制备得到的GQDs配制成浓度为0.35mg mL^-1溶液，再加入氯化钆，控制氯化钆溶液浓度为0.45mmol L^-1，在120℃水热反应釜中进行螯合反应；

6)将上述反应后的溶液进行旋蒸、冻干处理，制得Gd@GQDs。

对实施例1制得Gd@GQDs进行性能测试。

图1为该Gd@GQDs的透射电子显微镜图像。可以发现加入钆离子后，GQDs出现了自组装行为，其具有比表面积大，光学性质稳定，表面带有亲水基团等特点。

图2为本发明制得Gd@GQDs的傅立叶变换红外光谱图。其中3398cm^-1为羟基伸缩振动峰，2948cm^-1为仲胺基N-H伸缩振动峰，1725cm^-1为C＝O不对称伸缩振动峰，1600cm^-1为C＝C伸缩振动峰，表明本发明制备的Gd@GQDs具有大量的亲水基团同时保持了一定的石墨烯结构。

图3为采用MTT法检测制备的Gd@GQDs的细胞毒性。MTT法是一种常见的检测细胞存活和生长的方法，检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT(噻唑蓝)还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒以沉积在细胞中，死细胞却无此功能，然后用DMSO(二甲基亚砜)溶解出细胞中的甲瓒，再用酶联免疫检测仪在540nm或720nm波长条件下测定其吸光度，以此间接反映活细胞数量。

MTT细胞毒性测试结果显示：将人乳腺癌细胞(MCF-7)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(均由安徽大学生命科学学院提供)与Gd@GQDs共培养24h后，细胞的存活率仍维持在90％以上，表明制得的Gd@GQDs具有很低的毒性。

图4为本发明制备的Gd@GQDs在1.5T磁共振测试系统中r₁和r₂弛豫率，表明Gd@GQDs具有极高的r₁弛豫率。

图5为本发明制备的Gd@GQDs(0.2mg mL^-1，Gd³⁺含量为0.2mmol L^-1)，石墨烯量子点(0.2mg mL^-1)，氯化钆(0.2mmol L^-1)和Gd-DTPA(0.2mmol L^-1)分别于MCF-7细胞中共培养后，在1.5T磁共振测试系统中的T₁加权磁共振图像，显示出Gd@GQDs在细胞磁共振成像方面具有优异的造影效果。

图6为本发明的Gd@GQDs用于细胞荧光显影，结果表明，在没有加入本发明制备的Gd@GQDs时，MCF-7细胞在荧光显微镜下没有荧光。加入本发明制得的Gd@GQDs后，以405nm光激发时，MCF-7细胞在荧光显微镜下呈现蓝色荧光，以488nm光激发时，MCF-7细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光，以543nm光激发时，MCF-7细胞在荧光显微镜下呈现红色荧光。

实施例2

一种石墨烯量子点与钆离子螯合物的制备方法，具体包括以下步骤：

1)使用Hummers法制备得到氧化石墨烯；

2)称取60mg上述氧化石墨烯，溶解在60g去离子水中，超声功率为800W处理，再加入60g，浓度为1mol·L^-1的过硫酸钾溶液充分溶解；

3)在上述溶液中加入800μL氨水溶液，然后将上述溶液转移到圆底烧瓶中，在70℃的油浴锅中回流12h；

4)回流反应结束后，将上述溶液进行层析提纯处理，除去大块的杂质，再进行冷冻干燥处理，得到GQDs；

5)将上述制备得到的GQDs配制成浓度为0.2mg mL^-1的溶液，再加入氯化钆，控制氯化钆溶液浓度为0.2mmol L^-1，在常温下进行螯合反应；

6)将上述反应后的溶液进行透析，然后高温干燥(100℃)处理，制得Gd@GQDs。

实施例3

一种石墨烯量子点与钆离子螯合物的制备方法，具体包括以下步骤：

1)使用Hummers法制备得到氧化石墨烯；

2)称取60mg上述氧化石墨烯，溶解在60g去离子水中，超声功率为600W处理，再加入20g浓硫酸和浓硝酸的混合液充分溶解；

3)在上述溶液中加入400μL，1mol L^-1的氢氧化钠溶液，然后将上述溶液转移到圆底烧瓶中，在80℃的油浴锅中回流10h；

4)回流反应结束后，将上述溶液进行抽滤、提纯处理，除去大块的杂质，再进行真空干燥处理，得到GQDs；

5)将上述制备得到的GQDs配制成浓度为0.05mg mL^-1的溶液，再加入氯化钆，控制其溶液浓度为0.1mmol L^-1，在60℃水浴锅中进行螯合反应；

6)将上述反应后的溶液进行蒸馏干燥处理，制得Gd@GQDs。

将本发明制得的石墨烯量子点与钆离子螯合物(Gd@GQDs)按照商用造影剂相同操作步骤使用。可作为磁共振造影剂和荧光成像显影剂来使用。

本发明制备的Gd@GQDs易分散于水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、生物培养基等水溶液体系中；具有良好的生物相容性和低毒性；在1.5T磁共振测试系统中，表现出优异的T₁加权造影性能，其r₁弛豫率高达72mM^-1s^-1，比现有商用T₁加权磁共振造影剂Gd-DTPA的r₁值高二十倍。在实际应用中，Gd@GQDs中Gd³⁺的注射用量是上述文献中钆基T₁造影剂和一般商用钆基T₁造影剂的五十分之一。此外，本发明Gd@GQDs材料中Gd³⁺的含量虽然只有上述文献中钆基T₁造影剂的四分之一到三分之一之间，但是仍能达到很好的磁共振造影效果，这使得从源头上避免了Gd³⁺的大量泄漏隐患。本发明的Gd@GQDs可作为医学影像显影剂，在临床上具有很好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.石墨烯量子点与钆离子螯合物，其特征在于，所述的石墨烯量子点与钆离子螯合物的制备方法，包括以下步骤：

1）使用Hummers法制备得到氧化石墨烯；

2）称取制得的氧化石墨烯，溶解在去离子水中，超声处理，再加入一定量的强氧化剂充分溶解；所述超声功率为500-800 W；所述氧化石墨烯和强氧化剂的质量比为（1-3）：（1000-3000）；所述氧化石墨烯与去离子水的质量比为（1-3）：（1000-3000）；

3）在上述溶液中加入400-1000 μL的碱性化合物，然后在70-120 ℃下回流7-12 h；

4）回流结束后，提纯、干燥，得到石墨烯量子点；

5）将纯净的石墨烯量子点配制成0.05-0.4 mg·mL^-1的溶液，再加入0.1-0.5 mmol·L^-1的氯化钆溶液进行螯合反应；

6）将反应后溶液进行提纯、干燥，制得石墨烯量子点与钆离子螯合物。

2.如权利要求1所述的石墨烯量子点与钆离子螯合物，其特征在于，所述步骤2）中的强氧化剂采用过硫酸钾、过氧化氢、浓硫酸、浓硝酸、次氯酸中的一种或多种的混合。

3.如权利要求1所述的石墨烯量子点与钆离子螯合物，其特征在于，所述步骤3）中的碱性化合物为氢氧化钾、氢氧化钠、氨水、水合肼、乙二胺、羟胺中的一种或多种的混合。

4.如权利要求1所述的石墨烯量子点与钆离子螯合物，其特征在于，所述步骤4）和步骤6）中的提纯为抽滤、层析、透析、过滤、萃取、蒸馏分馏中的任一种或多种；所述步骤4）和步骤6）中的干燥为真空干燥、冷冻干燥、高温干燥中的任一种或多种。

5.如权利要求1所述的石墨烯量子点与钆离子螯合物，其特征在于，所述步骤5）中的螯合反应，采用水浴加热、水热反应、溶液透析、常温处理中的任一种。

6.权利要求1-5任一项所述的石墨烯量子与钆离子螯合物在制备医学影像显影剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的医学影像显影剂包括磁共振成像造影剂和荧光成像所用显影剂。