CN111491656A - 采用高蛋白质诱发自噬的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可采用高蛋白质在对其有需要的个体中诱发自噬的组合物和方法。优选，将包含有效诱发例如肌肉中自噬的量的蛋白质的配方组成施用给个体。该配方组成可同时促进蛋白质合成和受损细胞物质的去除。施用的接受者可以是危重患者，例如重症监护病房(ICU)中的患者，和/或老龄患者，例如老年个体或患有肌肉减少症的个体。

Description

采用高蛋白质诱发自噬的组合物和方法

背景技术

本公开整体涉及采用高蛋白质诱发自噬的组合物和方法。更具体地讲，本公开涉及施用有效诱发例如肌肉中的自噬的量的富含蛋白质的配方组成。该配方组成可同时促进蛋白质合成和受损细胞物质的去除。施用的接受者可以是危重患者，例如重症监护病房(ICU)中的患者，和/或老龄患者，例如老年个体或患有肌肉减少症或虚弱的患者。

由于重症监护医学的重大进步，危重患者通常会在过去致命的急性病症中存活下来。然而，在此初始阶段存活下来并进入严重疾病的慢性阶段的这些患者中，死亡率仍然很高。死亡率通常因未解决的多器官衰竭、危重病性肌病或不太严重形式的肌无力所致。已引入治疗来改善肌肉肌病和肌无力，诸如静脉输入营养液(hyperalimentation)、生长激素或雄激素，但由于这些干预意外地增加器官衰竭和死亡的风险而失败。此外，对创伤和外科手术患者的营养支持实际上可能有不利影响。

仍然缺乏为危重患者提供适当治疗和充足营养的有效措施。

此外，与年龄相关的肌肉质量损失和功能降低在所有个体中都是不可避免的；然而其进展主要取决于遗传和环境因素，诸如体力活动和营养摄入。肌肉减少症已被定义这样一个点，在该点处与年龄相关的肌肉质量损失和功能丧失使患者变得衰弱并影响生活质量。相比之下，虚弱是与年龄相关身体功能下降的另一种分类，其特性在于低肌肉力量和低肌肉功能而不是低肌肉质量。针对处于病理活动状态的个体采用将老年人群分级的截止值，根据低肌肉质量和低肌肉功能对肌肉减少症进行临床定义。肌肉减少症预示未来的残疾和死亡，并且于2016年被指定为官方ICD-10疾病编码(Anker等人，2016年)。

发明内容

细胞质蛋白质的降解由被称为巨自噬(也简称为自噬)的细胞过程介导。自噬过程也涉及炎症应答并且促进细菌的免疫系统破坏。自噬构成主要的溶酶体降解途径，从而造成再循环受损和潜在的有害细胞物质，诸如受损的线粒体。值得注意的是，自噬抵消细胞死亡并且延长各种老龄模型中的寿命。如本文稍后示出的实验数据所详述，本发明人惊奇地发现，高蛋白质饮食诱发骨骼肌中的自噬。高蛋白质和自噬诱发剂的组合对肌肉的此协同诱发与在肝脏中观察到的情况形成对比。

因此，在一般实施方案中，本公开提供了在对其有需要的个体中诱发自噬的方法。该方法包括施用包含高含量蛋白质的组合物。高含量蛋白质可是占组合物的至少约25能量％的蛋白质的量，和/或高含量蛋白质可为提供组合物的大于6g/100kcal的蛋白质/能量比的蛋白质的量。可在骨骼肌中诱发自噬。

在一个实施方案中，个体为老龄个体。

在一个实施方案中，个体患有肌肉减少症或虚弱或者存在发展成肌肉减少症或虚弱的风险。

在一个实施方案中，个体是危重的。

在一个实施方案中，个体患有危重病性肌病或者存在发展成危重病性肌病的风险。

在一个实施方案中，蛋白质的至少一部分选自(i)来自动物来源的蛋白质、(ii)来自植物来源的蛋白质以及(iii)它们的混合物。

在一个实施方案中，蛋白质的至少一部分选自(i)乳蛋白质、(ii)乳清蛋白质、(iii)酪蛋白酸盐、(iv)胶束酪蛋白、(v)豌豆蛋白质、(vi)大豆蛋白质以及(vii)它们的混合物。

在一个实施方案中，蛋白质具有选自以下的配方组成：(i)蛋白质的至少50重量％为酪蛋白，(ii)蛋白质的至少50重量％为乳清蛋白质，(iii)蛋白质的至少50重量％为豌豆蛋白质，以及(iv)蛋白质的至少50重量％为大豆蛋白质。

在一个实施方案中，蛋白质的至少一部分选自(i)游离形式的氨基酸、(ii)未水解蛋白质、(iii)部分水解蛋白质、(iv)充分水解蛋白质以及(v)它们的混合物。蛋白质可包含选自以下的一种或多种氨基酸：组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、酪氨酸以及它们的混合物。蛋白质可包含长度为2至10个氨基酸的肽。

在一个实施方案中，蛋白质包含至少一种形式的支链氨基酸，该至少一种形式选自(i)游离形式、(ii)与至少一种另外的氨基酸结合的形式，以及(iii)它们的混合物。支链氨基酸可包括亮氨酸。

在一个实施方案中，蛋白质的至少一部分为5％至95％水解的。

在一个实施方案中，蛋白质具有选自以下的配方组成：(i)蛋白质的至少50％具有1kDa至5kDa的分子量，(ii)蛋白质的至少50％具有5kDa至10kDa的分子量，以及(iii)蛋白质的至少50％具有10kDa至20kDa的分子量。

在一个实施方案中，组合物包含碳水化合物来源。组合物可具有高蛋白质:碳水化合物比率。

在一个实施方案中，施用采用选自口服、胃肠内、胃肠外和静脉内注射的至少一种途径。

在另一个实施方案中，本公开提供了组合物，该组合物每份包含在对其有需要的个体中有效诱发自噬的蛋白质的量。该组合物可选自食物组合物、膳食补充剂、营养组合物、营养药品、在食用前用水或乳重构的粉末状营养产品、食品添加剂、药物、饮料以及它们的组合。

在另一个实施方案中，本公开提供了制备治疗组合物的方法，该方法包括向基础组合物添加一定量的蛋白质以形成治疗组合物，该治疗组合物每份包含在对其有需要的个体中有效诱发自噬的蛋白质的量。基础组合物可被配制成通过选自口服、胃肠内、胃肠外和静脉内注射的至少一种途径施用。

在另一个实施方案中，本公开提供了包括向对其有需要的个体施用包含一定量的蛋白质的组合物的方法，该量的蛋白质同时促进蛋白质合成和受损细胞物质的去除。

本公开提供的一个或多个实施方案的优点是改善危重动物、危重人类、老龄动物或老龄人类的病症。

本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是预防或治疗例如危重患者或老龄个体的过度分解代谢。

本公开提供的一个或多个实施方案的又一个优点是降低或预防由于例如危重患者或老龄个体的过度分解代谢而导致的发病率或死亡率的风险。

本公开的另一个优点是逆转、治疗或治愈危重患者的多器官功能障碍综合征。

本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是一种组合物，该组合物可例如作为含水液体组合物经胃肠外或经胃肠内施用给危重患者以诱发自噬，例如治疗多器官功能障碍或烧伤。

本公开提供的一个或多个实施方案的又一个优点是缩短危重患者用呼吸机的时长或加快撤除呼吸机的时间。

本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是保护经受胃肠外营养的危重患者，例如，免受由胃肠外营养物质递送尤其是不平衡的或相对营养物质过载引起的多器官衰竭或肌无力。

本公开提供的一个或多个实施方案的另外优点是保护老龄个体免受肌无力的影响。

本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是提高危重患者或老龄个体的存活能力。

本公开提供的一个或多个实施方案的另外优点是在从重症监护病房离开之后加速活动性的恢复或缩短不活动的时间。

本公开提供的一个或多个实施方案的又一个优点是即使当危重患者已经处于危及生命的病症的深层发展阶段也具有有益效果。

本公开提供的一个或多个实施方案的另外优点是保护老龄个体免受神经疾病的影响，神经疾病诸如轻度认知损害、阿尔茨海默病、帕金森病、淀粉样侧索硬化症、多发性硬化症、亨廷顿病、痴呆和相关的神经性罕见疾病。

本公开提供的一个或多个实施方案的另外优点是保护老龄个体免受肌肉功能障碍的影响，例如肌肉减少症、虚弱、包涵体肌炎、由药物诸如皮质类固醇或他汀类药物诱发的肌病/肌溶解、或由不活动或住院诱发的肌肉消耗。

本公开提供的一个或多个实施方案的另外优点是保护患有遗传疾病的患者，遗传疾病包括但不限于肌营养不良症，诸如杜氏肌营养不良症或胶原VI肌营养不良症、线粒体脑肌病、线粒体肌病、糖原贮积病、溶酶体贮积病、庞贝病。

本文描述了额外的特征和优点，并且根据下文的具体实施方式和附图，这些特征和优点将显而易见。

附图说明

图1A示出了本文所公开的实施例1中的实验的蛋白质印迹图像。

图1B示出了本文所公开的实施例1的实验中归一化为GAPDH的LC3-II蛋白质量的密度计定量(A.U.：任意单位)。星号表示通过未配对双尾学生t检验计算的显著性水平。***p<0.001。

图2A示出了本文所公开的实施例2中的实验的蛋白质印迹图像。

图2B示出了本文所公开的实施例2的实验中归一化为GAPDH的LC3-II蛋白质量的密度计定量(A.U.：任意单位)。星号表示通过未配对双尾学生t检验计算的显著性水平。**p<0.01。

图3A示出了本文所公开的实施例3中的实验的蛋白质印迹图像。

图3B示出了本文所公开的实施例3的实验中归一化为GAPDH的LC3-II蛋白质量的密度计定量(A.U.：任意单位)。星号表示通过未配对双尾学生t检验计算的显著性水平。*p<0.05。

图4示出了用鱼浸液(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4、0.00001％(w/v)亚甲蓝)中的500μM缬氨酸处理的转基因LC3-ZsGreen斑马鱼胚胎。自噬通过对胚胎肌肉中的LC3阳性点数计数进行测量，按总面积归一化。

具体实施方式

定义

下文提供了一些定义。然而，定义可位于下文的“实施方案”部分，并且以上标题“定义”并不表示“实施方案”部分中的此类公开不是定义。

所有百分数均以占组合物总重量的重量计，除非另有表示。类似地，所有比率均按重量计，除非另有表示。提及pH时，其值对应于利用标准设备在25℃下测量的pH。如本文所用，“约”、“大约”和“基本上”应理解为是指某一数值范围内的数字，例如该所提及数字的-10％至+10％的范围内，优选该所提及数字的-5％至+5％，更优选该所提及数字的-1％至+1％，最优选该所提及数字的-0.1％至+0.1％。

此外，本文中的所有数值范围都应理解为包含该范围内的所有整数、全部或分数。另外，这些数值范围应理解为对涉及该范围内任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，1至10的公开应理解为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。

如本文及所附权利要求所用，除非上下文另外明确规定，否则词语的单数形式包括复数。因此，提及“一个”、“一种”和“该”通常包括相应术语的复数形式。例如，提及“成分”或“方法”包括提及多种此类成分或方法。在“X和/或Y”的上下文中采用的术语“和/或”应被解释为“X”或“Y”或“X和Y”。类似地，“X或Y中的至少一者”应被解释为“X”或“Y”或“X和Y两者”。

与此类似，词语“包括/包含/含有(comprise)”、“包括/包含/含有(comprises)”和“包括/包含/含有(comprising)”都用于包含性而非排他性地解释。同样地，术语“包含”和“或”(“include,”“including”和“or”)都应当视为包含性的，除非上下文明确禁止这一解释。然而，本公开提供的实施方案可能不含本文未明确公开的任何要素。因此，采用术语“包括/包含/含有”限定的一个实施方案的公开内容，也是“基本上由所公开的组分组成”和“由所公开的组分组成”的多个实施方案的公开内容。“基本上由...组成”意指该实施方案包含超过50重量％的所识别组分，优选至少75重量％的所识别组分，更优选至少85重量％的所识别组分，最优选至少95重量％的所识别组分，例如至少99重量％的所识别组分。

本文采用的术语“示例”(尤其后跟一列术语时)，仅用于举例说明，而不应当被视为排他性的或全面的。本文所公开的任何实施方案可与本文所公开的任何其他实施方案结合，除非另有明确指示。

“动物”包括但不限于哺乳动物，哺乳动物包括但不限于啮齿动物；水栖哺乳动物；家养动物，诸如狗和猫；农场动物诸如羊、猪、牛和马；以及人类。在采用“动物”、“哺乳动物”或它们的复数形式时，这些术语还适用于能够具有通过段落上下文表现出的或意欲表现出的作用的任何动物，例如能够自噬的动物。如本文所用，术语“患者”应被理解为包括接受或意欲接受本文所定义的治疗的动物，例如哺乳动物，并且优选为人类。虽然本文中常用术语“个体”和“患者”来指人类，但本公开并非限制于此。

因此，术语“个体”和“患者”是指可受益于本文所公开的方法和组合物的任何动物、哺乳动物或人类。实际上，非人类动物经历类似人类病症的长期危重疾病。这些危重动物经历与人类对应物相同的代谢、免疫和内分泌干扰以及器官衰竭和肌肉消耗的发展。此外，动物也经历老龄的效应。

在人类的上背景中，术语“老年”是指自出生起的年龄为至少55岁，优选63岁以上，更优选65岁以上，并且最优选70岁以上。在人类的背景中，术语“中老年”或“老龄个体”是指自出生起的年龄为至少45岁，优选50岁以上，更优选55岁以上，并且包括老年个体。

对于其它动物，“中老年”或“老龄个体”是指已超过其特定物种和/或物种内品种的平均寿命的50％。如果动物超过平均预期寿命的66％，则将其视为“老年”，优选超过平均预期寿命的75％，更优选超过平均预期寿命的80％。老龄猫或狗自出生起的年龄为至少约5岁。老年猫或狗自出生起的年龄为至少约7岁。

“肌肉减少症”被定义为与年龄相关联的肌肉质量和功能(包括肌肉力量和步行速度)的损失。如本文所用，“虚弱”被定义为脆弱性增加的临床可识别状态，该脆弱性增加是由于多个生理系统中与衰老相关联的储备和功能下降所致，使得应对日常或急性压力的能力受到损害。在没有确定的定量标准的情况下，Fried等人在操作上将虚弱定义为满足五个表型标准中的三个，这些标准表明能量受到损害：(1)无力(握力为基线群体的最低20％，根据性别和身体质量指数进行调整)，(2)耐力和精力不佳(自我报告的消耗与

最大值相关联)，(3)缓慢(基线群体的最低20％，基于步行15英尺的时间，根据性别和站立高度进行调整)，(4)身体活动量低(基线处每周消耗的千卡加权分数，对每个性别确定的身体活动量的最低五分位数；例如，男性小于383kcal/周，并且女性小于270kcal/周)和/或非故意的体重减轻(过去一年中减轻10磅)。Fried LP、Tangen CM、Walston J等人，“Frailty in olderadults:evidence for a phenotype.”J.Gerontol.Biol.Sci.Med.Sci.56(3):M146–M156(2001)(中老年人虚弱：表型的证据，《老年医学杂志系列A：生物科学与医疗科学》，第56卷第3期，第146–156页，2001年)。存在这些标准中的一个或两个的虚弱前期阶段鉴定出进展到虚弱的高风险。

术语“治疗”包括导致病症或障碍改善，例如减轻、减少、调节或消除病症或障碍的任何效果。该术语不一定表示个体被治疗直至完全恢复。“治疗”病症或障碍的非限制性示例包括：(1)抑制病症或障碍，即阻止病症或障碍或其临床症状的发展，以及(2)缓解病症或障碍，即，使病症或障碍或其临床症状暂时或永久地消退。治疗可为患者相关的或医生相关的。

术语“预防”是指使得所提及的病症或障碍的临床症状不在可能暴露于或易患上该病症或障碍但尚未经历或表现出该病症或障碍的症状的个体中发展。术语“病症”和“障碍”意指任何疾病、病症、症状或适应症。

相对术语“改善”、“增加”、“增强”等是指(本文所公开的)包含高蛋白质的组合物相对于蛋白质较少但在其它方面相同的组合物的效应。

术语“食物”、“食物产品”和“食物组合物”意指旨在供个体(诸如，人类)摄入并且向个体提供至少一种营养物质的产品或组合物。本公开(包括本文所述的多个实施方案)的组合物可包含下列要素、由或基本上由下列要素组成：本文所述的基本要素和限制，以及本文所述的或者说可用于饮食中的任何其他或可选的成分、组分或限制。

如本文所用，“完全营养”包含种类全面、含量充足的常量营养素(蛋白质、脂肪和碳水化合物)和微量营养素，其对于施用该组合物的动物而言足以作为唯一营养来源。从这类完全营养组合物中，个体可得到其100％的营养需求。

如本文所用，术语“危重患者”是经历急性危及生命的发作或被诊断为即将处于此类发作的危险中的个体。危重患者是医学上不稳定的，并且在未治疗的情况下可能死亡(例如，死亡几率>50％)。

危重患者的非限制性示例包括由于疾病或受伤而患有持续急性危及生命的单器官或多器官系统衰竭或存在其风险的患者、正在接受手术并且随后发生并发症的患者，以及在上一周内进行重要器官手术或在上一周内经受过大手术的患者。

危重患者的更具体的非限制性示例包括由于疾病或受伤而具有持续急性危及生命的单器官或多器官系统衰竭或存在其风险的患者，以及正在接受手术并且随后发生并发症的患者。危重患者的另外具体非限制性示例包括：对接收心脏手术、脑手术、胸部手术、腹部手术、血管手术或移植中的一种或多种有需要的患者；以及患有以下一种或多种的患者：神经疾病、脑创伤、呼吸功能不全、腹部腹膜炎、多重创伤、严重烧伤、危重病多发性神经病、危重病性肌病或ICU获得性肌无力。

术语“重症监护病房”(ICU)是指治疗危重患者的医院的部分。术语“重症监护病房”还涵盖：疗养院；诊所，例如私人诊所；或进行的治疗活动与ICU的治疗活动相同或相似的类似地点。术语“危重患者”涵盖“ICU患者”。

术语“多器官功能障碍”是指由感染、血流灌注过少、高代谢或损伤诸如事故或外科手术引起的病症。导致危重患者死亡的“多器官衰竭”被认为是由至少两个重要器官系统的功能障碍或衰竭所定义的描述性临床综合征。受到一致且最具体的影响的重要器官系统为肝、肾、肺以及心血管系统、神经系统和血液学系统。多器官功能障碍的非限制性示例包括急性呼吸窘迫综合征、心衰、肝衰、肾衰、呼吸功能不全、重症监护、休克、大面积烧伤、败血症(例如，全身性炎性反应综合征(SIRS))和中风。

术语“经肠胃内施用”涵盖口服施用(包括管饲法施用)以及经直肠施用，但优选口服施用。术语“胃肠外施用”是指经除消化道之外的途径递送给定物质，并且涵盖多种施用途径，诸如静脉内、动脉内、肌内、脑室内、骨内、皮内、鞘内以及腹膜内施用、膀胱内输注和海绵体内注射。

优选的胃肠外施用是静脉内施用。胃肠外施用的具体形式是通过静脉内施用营养物质来递送。当其它途径不提供食物时，胃肠外营养是“完全胃肠外营养”。“胃肠外营养”优选为等渗或高渗水溶液(或待溶解的固体组合物或待稀释的液体浓缩物以获得等渗或高渗溶液)，其包含糖类诸如葡萄糖并且还包含脂质、氨基酸和维生素中的一者或多者。

实施方案

因此，本公开的一个方面是在对其有需要的个体中诱发自噬的方法。该方法包括施用包含高含量蛋白质的组合物(例如，组合物总能量的约25％)，并且该组合物以有效诱发例如肌肉中的自噬的量施用。该组合物可经胃肠外、经胃肠内或静脉内施用。

在一个实施方案中，该组合物具有大于6g蛋白质/100kcal、优选大于9g蛋白质/100kcal的蛋白质/能量比。在一个实施方案中，蛋白质占组合物的至少24能量％，并且更优选占组合物的至少36能量％。

作为非限制性示例，组合物可以提供大于1.0g蛋白质/kg体重/天、优选大于1.2g蛋白质/kg体重/天的蛋白质的量的日剂量施用；例如最多2.5g蛋白质/kg体重/天(例如，1.0蛋白质/kg体重/天至2.5g蛋白质/kg体重/天；1.2至2.5g蛋白质/kg体重/天；或1.5蛋白质/kg体重/天至2.5g蛋白质/kg体重/天)，优选最多2.0g蛋白质/kg体重/天(例如1.0蛋白质/kg体重/天至2.0g蛋白质/kg体重/天；1.2蛋白质/kg体重/天至2.0g蛋白质/kg体重/天；或1.5蛋白质/kg体重/天至2.0g蛋白质/kg体重/天)，更优选最多1.5g蛋白质/kg体重/天(例如1.0蛋白质/kg体重/天至1.5g蛋白质/kg体重/天或1.2蛋白质/kg体重/天至1.5g蛋白质/kg体重/天)。蛋白质的日剂量可由每天一份或多份组合物提供。

如果组合物为液体形式，则合适的高蛋白质浓度的非限制性示例包括6g蛋白质/100ml至20g蛋白质/100ml，例如6g蛋白质/100ml至11g蛋白质/100ml；7g蛋白质/100ml至14g蛋白质/100ml；7g蛋白质/100ml至12g蛋白质/100ml；8g蛋白质/100ml至11g蛋白质/100ml，例如，8g蛋白质/100ml至20g蛋白质/100ml；9g蛋白质/100ml至20g蛋白质/100ml；以及11g蛋白质/100ml至20g蛋白质/100ml。

组合物可在肌肉例如骨骼肌中诱发自噬。此类肌肉的非限制性示例包括以下中的一者或多者：股外侧肌、腓肠肌、胫骨肌、比目鱼肌、伸肌、趾长肌(EDL)、股二头肌、半腱肌、半膜肌、臀大肌、眼外肌、面肌或隔膜。

对诱发自噬有需要的个体可为老龄个体，诸如老龄动物或老龄人类。在一些实施方案中，对诱发自噬有需要的个体为老年动物或老年人类。

对诱发自噬有需要的个体可能是危重患者。在各种实施方案中，该方法：可治疗或预防危重患者的多器官功能障碍，例如，如果患者因接受胃肠外营养而具有失败或紊乱的体内平衡；可保护危重患者免受多器官功能障碍的影响；可治疗或预防乳酸血症的发展，例如由胃肠外营养诱发的乳酸血症；可治疗或预防危重患者的肌无力；可降低或预防因胃肠外营养而恶化的发病率或死亡率；和/或可预防身体系统崩溃。

在一些实施方案中，危重患者具有选自以下的至少一种危及生命的病症：乳酸血症、肌无力、高血糖症、多器官衰竭、体内平衡失败和体内平衡紊乱。在一个实施方案中，危重患者患有非感染性障碍。在一个实施方案中，危重患者患有不是由败血症引起或与败血症不相关的多器官功能障碍。多器官功能障碍和肌无力在关键护理环境中是常见的，并且可由不平衡的胃肠外营养物质递送或经胃肠外递送的相对或绝对营养物质过载引起或加重。

在一些实施方案中，危重患者患有选自以下的至少一种障碍：严重的创伤、多发性创伤、高危手术、大面积手术、脑创伤、脑出血、呼吸功能不全、腹部腹膜炎、急性肾损伤、急性肝损伤、严重烧伤、危重病多发性神经病、危重病性肌病和ICU获得性肌无力。

在一些实施方案中，危重患者正在接受胃肠内或胃肠外营养。在一些实施方案中，该组合物治疗或预防线粒体功能障碍，例如由对危重患者而言不足或不平衡的胃肠外营养诱发的线粒体功能障碍。

如本文所用，术语“蛋白质”包括游离形式的氨基酸、介于2和20个氨基酸之间的分子(本文称为“肽”)，并且还包括更长的氨基酸链。小的肽(即，具有2至10个氨基酸的链)单独或与其它蛋白质组合后适用于该组合物。氨基酸的“游离形式”是氨基酸的单体形式。合适的氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸两者。该组合物可包含一种或多种类型的蛋白质的混合物，例如一种或多种(i)肽、(ii)较长的氨基酸链或(iii)游离形式的氨基酸；并且该混合物经优选配制以实现所需的氨基酸分布/含量。

蛋白质的至少一部分可来自：动物来源或植物来源，例如乳蛋白质，诸如乳蛋白质中的一种或多种，例如乳蛋白质浓缩物或乳蛋白质分离物；酪蛋白酸盐或酪蛋白，例如胶束酪蛋白浓缩物或胶束酪蛋白分离物；或乳清蛋白质，例如乳清蛋白质浓缩物或乳清蛋白质分离物。除此之外或另选地，蛋白质的至少一部分可为植物蛋白质，诸如大豆蛋白质或豌豆蛋白质中的一种或多种。

这些蛋白质的混合物也是合适的，例如其中酪蛋白是蛋白质的大部分但不是全部的混合物，其中乳清蛋白质是蛋白质的大部分但不是全部的混合物，其中豌豆蛋白质是蛋白质的大部分但不是全部的混合物，以及其中大豆蛋白质是蛋白质的大部分但不是全部的混合物。在一个实施方案中，蛋白质的至少10重量％为乳清蛋白质，优选至少20重量％，并且更优选至少30重量％。在一个实施方案中，蛋白质的至少10重量％为酪蛋白，优选至少20重量％，并且更优选至少30重量％。在一个实施方案中，蛋白质的至少10重量％为植物蛋白质，优选至少20重量％，更优选至少30重量％。

乳清蛋白质可以是任何乳清蛋白质，例如选自乳清蛋白质浓缩物、乳清蛋白质分离物、乳清蛋白质胶束、乳清蛋白质水解物、酸乳清、甜乳清、改性甜乳清(其中已去除酪蛋白-糖巨肽的甜乳清)、乳清蛋白质的级分以及它们的任何组合。

酪蛋白可以从任何哺乳动物获得，但优选从牛乳获得，并且优选为胶束酪蛋白。

蛋白质可以是未水解的、部分水解的(即，具有3kDa至10kDa的分子量并且平均分子量小于5kDa的肽)或充分水解的(即，其中90％的肽具有小于3kDa的分子量)，例如在5％至95％水解的范围内。在一些实施方案中，水解蛋白质的肽分布可在不同分子量的范围内。例如，肽中的大多数(>50摩尔百分比或>50重量％)可具有1kDa至5kDa或5kDa至10kDa或10kDa至20kDa内的分子量。

蛋白质可包含必需氨基酸和/或条件必需氨基酸，例如，在热量限制方案中可能递送不足的此类氨基酸。例如，蛋白质可包含一种或多种必需氨基酸，其选自组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；并且这些氨基酸(如果存在的话)中的每一种可以约0.0476mg至约47.6mg氨基酸/kg体重的日剂量施用于组合物中。值得注意的是，较低的甲硫氨酸摄入导致较低水平的蛋白质翻译并最终导致较低水平的肌肉合成。蛋白质可包含一种或多种条件必需氨基酸(例如，在疾病或应激情况下为条件必需的氨基酸)，其选自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、丝氨酸和酪氨酸；并且这些氨基酸(如果存在的话)中的每一种可以约0.0476mg至约47.6mg氨基酸/kg体重的日剂量施用于组合物中。

所述组合物可包含一种或多种支链氨基酸。例如，组合物可包含游离形式和/或结合为肽和/或蛋白质(诸如乳蛋白质、动物蛋白或植物蛋白)的亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸。支链氨基酸的日剂量可包括下列中的一者或多者：0.35mg/kg体重的亮氨酸至142.85mg/kg体重的亮氨酸，优选0.175mg/kg体重的亮氨酸至71.425mg/kg体重的亮氨酸；0.175mg/kg体重的异亮氨酸至71.425mg/kg体重的异亮氨酸；以及0.175mg/kg体重的缬氨酸至71.425mg/kg体重的缬氨酸。一种或多种支链氨基酸的日剂量可由每天一份或多份组合物提供。

在一个实施方案中，组合物包含碳水化合物来源。任何合适的碳水化合物均可用于组合物中，包括但不限于淀粉(例如改性淀粉、直链淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉)、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精、木糖醇、山梨糖醇或它们的组合。

碳水化合物来源优选不大于组合物的50能量％，更优选不大于组合物的36能量％，并且最优选不大于组合物的30能量％。组合物可具有高蛋白质:碳水化合物能量比，例如大于0.66，优选大于0.9，并且更优选大于1.2。

在一个实施方案中，组合物包含脂肪来源。脂肪来源可包括任何合适的脂肪或脂肪混合物。合适的脂肪来源的非限制性示例包括植物脂肪(诸如橄榄油、玉米油、葵花油、高油酸葵花油、油菜籽油、低芥酸菜籽油、榛子油、大豆油、棕榈油、椰子油、黑加仑籽油、琉璃苣油、卵磷脂等)、动物脂肪(诸如乳脂肪)；或它们的组合。

可将包含高蛋白质的组合物以治疗有效剂量施用给个体，诸如人类，例如老龄个体或危重个体。该治疗有效剂量可以由本领域的技术人员确定，并且将取决于本领域的技术人员已知的许多因素，诸如病症的严重程度和个体的体重以及一般状况。

组合物优选每周至少两天、更优选每周至少三天、最优选每周全部七天施用给个体；持续至少一周、至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少六个月或甚至更长时间。在一些实施方案中，将组合物连续多天施用给个体，例如至少直到实现治疗效果。在一个实施方案中，可将组合物每天施用给个体持续至少连续30天、60天或90天。

上述施用示例不需要无中断的连续每日施用。相反，在施用中可以存在一些短暂的中断，例如在施用期间中断两至四天。施用组合物的理想持续时间可以由本领域的技术人员确定。

在一个优选的实施方案中，将该组合物以口服方式或经胃肠内(例如管饲)施用给个体。例如，该组合物可以饮品、胶囊、片剂、粉末或混悬剂形式施用给个体。

该组合物可以是适合人类和/或动物食用的任何种类的组合物。例如，所述组合物可选自食物组合物、膳食补充剂、营养组合物、营养药品、在食用前用水或乳重构的粉末状营养产品、食品添加剂、药物、饮品和饮料。在一个实施方案中，所述组合物是口服营养补充剂(ONS)、完全营养配方、医药、医疗产品或食物产品。在一个优选的实施方案中，该组合物以饮品形式施用给个体。所述组合物可以粉末形式储存在小袋中，然后混悬在液体如水中以供采用。

在不能或不建议口服或胃肠内施用的一些情况下，所述组合物也可以经胃肠外方式施用。

在一些实施方案中，该组合物以单一剂型施用给个体，即所有化合物均存在于一种产品中，该产品将与膳食组合提供给个体。在其它实施方案中，组合物以单独的剂型共同施用，例如至少一种组分与组合物的其它组分中的一种或多种分开。

实施例

以下非限制性实施例呈现了科学数据，这些科学数据发展并支持施用包含高蛋白质的组合物以在对其有需要的个体中诱发自噬的概念。

材料和方法

小鼠

在自由采食期间，给10至15周龄的C57bl6/J小鼠喂食标准饮食或富含蛋白质且碳水化合物较少的饮食(高蛋白质等热量)4周。在肌肉采集前的连续两天内，经历秋水仙碱治疗的小鼠接受溶解于生理盐水溶液中的0.4mg/kg/天的秋水仙碱的腹膜内注射。标准饮食由16％脂肪(大豆油)、20％蛋白质(酪蛋白)、64％碳水化合物(40％玉米淀粉、14％糊精化玉米淀粉、10％蔗糖)组成。高蛋白质等热量饮食由16％脂肪(大豆油)、60％蛋白质(酪蛋白)、24％碳水化合物(7％玉米淀粉、10％糊精化玉米淀粉、7％蔗糖)组成。这些量是喂食总能量的百分比。通过吸入异氟烷然后放血来处死小鼠。收集四头肌肌肉和肝脏，并且在液氮中冷冻。

蛋白质印迹

用组织解离器(gentleMACS Miltenyi Biotec)从在20ml/g RIPA缓冲液(150mM氯化钠、50mM Tris pH:8、1％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸盐、0.1％SDS，蛋白酶抑制剂混合物)中匀化的30mg至50mg组织中提取总蛋白质裂解物。通过BCA测定法测定蛋白质浓度，并且添加4倍LDS样品缓冲液(英杰公司(Invitrogen))制备样品。通过SDS-PAGE在4％至12％梯度凝胶中分离20μg蛋白质，并且采用干燥iBLOT系统(英杰公司(Invitrogen))转移至PVDF膜。将膜用LC3(Novus Biologicals 2220)和GAPDH(Cell Signaling 2118)抗体温育并且用ECL底物(Pierce公司(Pierce))检测。采用ImageJ软件通过图像的密度计分析进行蛋白质定量。

实施例1：高蛋白质饮食诱发骨骼肌中的自噬

图1A和1B示出了用标准饮食或高蛋白质含量的等热量饮食喂养年轻成年WT小鼠4周的结果。LC3-I和LC3-II蛋白质的量通过蛋白质印迹在骨骼肌(四头肌)中测量并且归一化为GAPDH。通过评估LC3-II水平来测量自噬。将LC3-II蛋白质的量的密度计定量归一化为GAPDH(A.U.：任意单位)。

实施例2：在存在溶酶体抑制剂的情况下，高蛋白质饮食诱发骨骼肌中的自噬流

图2A和2B示出了在肌肉收获之前连续两天喂食不同饮食并用秋水仙碱(0.4mg/kg/天)腹膜内注射以便抑制溶酶体活性并监测自噬流的小鼠的结果。通过蛋白质印迹测量LC3-I和LC3-II蛋白质的量。通过评估进行溶酶体抑制时的LC3-II水平来测量自噬流。高蛋白质等热量饮食在经秋水仙碱处理时的累积LC3-II积聚指示增加的自噬流。

实施例3：高蛋白质等热量饮食不诱发肝脏中的自噬

图3A和3B示出了通过蛋白质印迹在肝脏中测量LC3-I和LC3-II蛋白质的量并归一化为GAPDH的小鼠的结果。通过评估LC3-II水平来测量自噬。密度计分析指示，在用高蛋白质等热量饮食喂养的小鼠的肝脏中没有自噬诱发。

实施例4：缬氨酸诱发骨骼肌中的自噬

图4示出了用鱼浸液(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4、0.00001％(w/v)亚甲蓝)中的500μM缬氨酸处理的转基因LC3-ZsGreen斑马鱼胚胎的结果。自噬通过对胚胎肌肉中的LC3阳性点数计数进行测量，按总面积归一化。

方法：

通过在骨骼肌特异性促进剂(下文称为LC3-ZsGreen)的控制下融合到ZsGreen的LC3蛋白质的稳定表达，产生斑马鱼自噬报告基因。来自远交转基因斑马鱼的胚胎在标准实验室条件下于28℃下进行抚育，并且在受精后48小时之时在96孔板中进行处理(n＝24)。处理16小时之后，将胚胎用0.016％三卡因麻醉并用ImageXpress共焦系统(美谷分子仪器公司(Molecular Devices))以20倍放大率成像。采集之后，用NH4Cl 100mM进一步处理胚胎4小时以阻断LC3降解并再次成像。捕获每个胚胎的Z堆叠图像，并且生成最大投影图像。LC3点数利用MetaXpress软件(美谷分子仪器公司(Molecular Devices))计算并且按鱼面积归一化。

结果：

500μM的缬氨酸处理诱发了斑马鱼胚胎骨骼肌中的LC3阳性点的增加。在存在溶酶体抑制剂NH₄Cl的情况下，LC3点的累积增加表明自噬流的增加。

应当理解，对本文所述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明主题的实质和范围且不减弱其预期优点的前提下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (29)

1.在对其有需要的个体中诱发自噬的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含高含量蛋白质的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述高含量蛋白质是占所述组合物的至少约25能量％的蛋白质的量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述高含量蛋白质是提供所述组合物的大于6g/100kcal的蛋白质/能量比的蛋白质的量。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述自噬在骨骼肌中诱发。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体是老龄个体。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体患有肌肉减少症或虚弱或者存在发展成肌肉减少症或虚弱的风险。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体是危重的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体患有危重病性肌病或者存在发展成危重病性肌病的风险。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)来自动物来源的蛋白质、(ii)来自植物来源的蛋白质以及(iii)它们的混合物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)乳蛋白质、(ii)乳清蛋白质、(iii)酪蛋白酸盐、(iv)胶束酪蛋白、(v)豌豆蛋白质、(vi)大豆蛋白质以及(vii)它们的混合物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质具有选自以下的配方组成：(i)所述蛋白质的至少50重量％为酪蛋白，(ii)所述蛋白质的至少50重量％为乳清蛋白质，(iii)所述蛋白质的至少50重量％为豌豆蛋白质，以及(iv)所述蛋白质的至少50重量％为大豆蛋白质。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)游离形式的氨基酸、(ii)未水解蛋白质、(iii)部分水解蛋白质、(iv)充分水解蛋白质以及(v)它们的混合物。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白质包含长度为2至10个氨基酸的肽。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包含至少一种形式的支链氨基酸，所述至少一种形式选自(i)游离形式、(ii)与至少一种另外的氨基酸结合的形式、以及(iii)它们的混合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述支链氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中的一种或多种。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质的至少一部分为5％至95％水解的。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质具有选自以下的配方组成：(i)所述蛋白质的至少50％具有1kDa至5kDa的分子量，(ii)所述蛋白质的至少50％具有5kDa至10kDa的分子量，以及(iii)所述蛋白质的至少50％具有10kDa至20kDa的分子量。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含碳水化合物来源。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物具有高蛋白质:碳水化合物比率。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用采用选自口服、胃肠内、胃肠外和静脉内注射的至少一种途径。

21.组合物，所述组合物每份包含在对其有需要的个体中有效诱发自噬的蛋白质的量。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物选自食物组合物、膳食补充剂、营养组合物、营养药品、在食用前用水或乳重构的粉末状营养产品、食品添加剂、药物、饮料以及它们的组合。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)乳蛋白质、(ii)乳清蛋白质、(iii)酪蛋白酸盐、(iv)胶束酪蛋白、(v)豌豆蛋白质、(vi)大豆蛋白质以及(vii)它们的混合物。

24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)游离形式的氨基酸、(ii)未水解蛋白质、(iii)部分水解蛋白质、(iv)充分水解蛋白质以及(v)它们的混合物。

25.制备治疗组合物的方法，所述方法包括向基础组合物添加蛋白质以形成所述治疗组合物，所述治疗组合物每份包含在对其有需要的个体有效诱发自噬的蛋白质的量。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述基础组合物被配制用于通过选自口服、胃肠内、胃肠外和静脉内注射的至少一种途径施用。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)乳蛋白质、(ii)乳清蛋白质、(iii)酪蛋白酸盐、(iv)胶束酪蛋白、(v)豌豆蛋白质、(vi)大豆蛋白质以及(vii)它们的混合物。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质的至少一部分选自(i)游离形式的氨基酸、(ii)未水解蛋白质、(iii)部分水解蛋白质、(iv)充分水解蛋白质以及(v)它们的混合物。

29.包括向对其有需要的个体施用包含一定量的蛋白质的组合物的方法，所述量的所述蛋白质同时促进蛋白质合成和受损细胞物质的去除。

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