CN111440732A - 一种鲁保一号突变菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种菟丝子生防菌鲁保‑TB182（Colletotrichum acutatum），保藏编号为CGMCC No.17472。可用于防治菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）、南方菟丝子（Cuscuta australis R.Br.）或日本菟丝子（Cuscuta japonica Choisy）。本发明提供的菟丝子生防菌采用分子生物学的方式获得，具有很高的产孢能力，对菟丝子具有具有稳定的致病力遗传，为菟丝子的生物防治提供了新的工具。

Description

一种鲁保一号突变菌株及其应用
技术领域
本发明涉及杂草生物防治领域，具体涉及一种“鲁保一号”突变菌株。
背景技术
近年来，我国在杂草生物防治方面也取得了一系列的成果，例如初步利用画眉草弯孢霉（Culvularia eragrostidis）防治马唐（Digitaria sanguinalis）；利用假隔链格孢菌（Nimbya alternantherae）防治空心莲子草（Alternantera phyloxeroides）和利用齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）防治加拿大一枝黄花（Solidago canadensis）等方面均取得了一定成果。
菟丝子（Cuscutaspp）是属于旋花科或菟丝子科的一类恶性寄生植物，我国约14种。菟丝子生长迅速，产籽量大，种子存活力强，宿主范围广，对农林作物危害严重，并且危害持久。我国生物除草剂的研究起步较早，而在20世纪60年代就已经开发出“鲁保一号”菌剂，该菌剂是利用炭疽菌防治菟丝子，曾在山东、江苏、安徽、宁夏等20多个省、区，开展了“鲁保一号”菌剂的生产和应用。但是，经过长时间的人工培养和保藏，“鲁保一号”菌种孢子多核化现象增多，菌剂对菟丝子的致病力严重降低，甚至丧失生产和应用价值。菌种的严重退化，使“鲁保一号”的生产、应用很快陷入困境，几乎濒于消亡的边缘。
自1995年，Bundock等首次利用根癌农杆菌成功介导酵母菌遗传转化以来，该法已经在构建真菌的突变体库中取得了巨大的进展。根癌农杆菌介导遗传转化的T-DNA插入突变技术即成为了研究病原真菌功能基因的重要技术之一。在“鲁保一号”全基因组没有完成测序的情况下，通过突变体寻找致病性相关基因是研究其致病机理有效方法之一。
发明内容
针对“鲁保一号”对菟丝子致病力和防治效果降低等问题，本发明提供一种“鲁保一号”突变菌株，在致病力和防效上有较大幅度提高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种菟丝子生防菌鲁保-TB182（Colletotrichum acutatum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 17472。
所述菟丝子为菟丝子属（Cuscuta Linn.）植物。优选为菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）、南方菟丝子（Cuscuta australis R. Br.）或日本菟丝子（Cuscuta japonica Choisy）。
本发明具有以下优点：
本发明提供的菟丝子生防菌采用分子生物学的方式获得，具有很高的产孢能力，对菟丝子具有具有稳定的致病力遗传；对“鲁保一号”的进一步改良应用提供参考依据，为菟丝子的生物防治提供了新的工具。
生物保藏信息
鲁保-TB182（Colletotrichum acutatum），于2019年03月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17472。
附图说明
图1为“鲁保-TB182”与“鲁保一号”菌株防治菟丝子差异。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 高致病力突变体的筛选
1.1 阳性突变体的获得
“鲁保一号”菌株能够通过商业购买获得，如中国微生物菌种保藏中心(CMCC)，平台编号为Bio-17420。上述菌株活化后于9cm PDA培养平板上培养，10 d后以6 mL/皿的无菌水洗下菌落表面分生孢子，过滤后，通过血球计数板在显微镜下观察滤液中的孢子浓度，稀释至孢子浓度为1×105个/mL，备用。
挑取新鲜活化好的含双元载体pBHt2的农杆菌AGL-1单菌落，接种于2 mL的LB液体培养基(卡那霉素50 μg/mL)中，220 rpm、28 ℃培养1 d。取摇好的农杆菌溶液250 μL置于50 mL的MM培养基(含卡那霉素50 μg/mL)中，220 rpm，28 ℃摇床瓶培养2 d，测量菌液的OD600，然后用MM液体培养基调整菌体浓度使OD600达到0.3，备用。
将含200μM乙酰丁香（AS）和1.0 mg/mL的2-吗啉乙磺酸（MES）的Co-IM（pH 5.5）培养基倒平板（9cm），将100μL孢子浓度为1×106个/mL的分生孢子和100 μL OD600= 0.3农杆菌菌液混匀后用涂布器轻涂于玻璃纸上，并铺在平板上，25 ℃共培养36 h，然后将玻璃纸揭下，带菌面朝贴于PDA固体培养基(含潮霉素B 250 μg/mL)上，25 ℃培养3 d后揭下玻璃纸，继续培养4-7 d至PDA培养基内长出转化子，挑取转化子至新的PDA培养基（潮霉素B 250μg/mL）内。
剪取部分转化子的滤纸片在PDA培养基上进行连续继代培养，连续培养5代后接种到含有潮霉素B的PDA培养基上，验证其潮霉素B抗性遗传稳定性。同时挑取部分转化子菌落接种到PDA液体培养基中，26 ℃，180 rpm振荡培养3 d，过滤收集菌丝体，CTAB法提取基因组DNA，以下引物进行PCR检测潮霉素基因：
Hyg-F：TCGATGTAGGAGGGCGTGGA；（SEQ ID NO: 1）
Hyg-R：CGCGTCTGCTGCTCCATACAAG；（SEQ ID NO: 2）
将PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，能够获得625bp条带的为阳性转化子；然后将鉴定为阳性的菌种进行编号、保存。
1.2 致病力相关突变体的筛选
初筛选：选取生长旺盛，茎秆生长粗细均匀健壮的菟丝子，用针刺茎秆，将浓度为1×105个/mL的阳性转化子分生孢子液接种在创伤茎秆上，设置野生型“鲁保一号”对照，3次重复。于28℃恒温培养箱中培养72 h后，观察菟丝子的发病情况，初步获得致病力差异突变体。
高致病力突变体的获得：采用田间自然生境防效验证方式进行强致病性突变体的再验证。4月中旬，田间种植大豆，待大豆长到约10-15cm高度时，撒播菟丝子种子，45d后，菟丝子完成对大豆的完全侵染。在下午17：:00左右，均匀喷施初筛突变体和野生型菌株分生孢子液，所用孢子液浓度为1×105个/mL，用水量为45L/亩，分生孢子的制取参照实施例1.1方法。接菌10d后，观察防治效果，如图1所示：喷施突变株的菟丝子茎秆枯萎变褐，喷施野生型的菟丝子茎秆为绿色，生长正常；获得高致病力的生防菌菌株“鲁保-TB182”。对该鲁保-TB182于2019年03月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏编号为CGMCC No.17472。
实施例2 高致病力突变体对菟丝子的防效
参照实施例1.2高致病力突变体的获得相关方法进行菌株防效验证。接菌10d后，摘取相同面积内突变体和野生型防治后残存菟丝子，称量重量，并与清水防治组进行比较。防效（%）=（对照组菟丝子重量-接菌组菟丝子重量）/对照组菟丝子重量。其中接菌组分别为突变体和野生型。
将鲁保一号菌株和鲁保-TB182菌株于PDA培养基上进行活化，28 ℃培养6 d后挑取菌落边缘在新PDA平板（9 cm）上培养，培养7d后，测定菌落直径，计算平均生长速率；然后每皿用6mL无菌水冲洗表面孢子进行产孢量测定。
表1 鲁保-TB182与鲁保一号菌株在防效等性状的差异
Figure 101315DEST_PATH_IMAGE002
由表1可知突变体“鲁保-TB182”与野生型“鲁保一号”菌株相比，生长速率没有显著差异，但是产孢量更高，防控效果更好。
将鲁保-TB182菌株在正常PDA培养基上连续转接5代后再次进行致病力测定，初代菌株与F5代菌株的防效分别为83.6%和82.7%，致病力并无发生明显变化，说明获得的高致病力菌株可稳定遗传。
序列表
<110> 山东省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种鲁保一号突变菌株及其应用
<130> 2020051302
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hyg-F
<400> 1
tcgatgtagg agggcgtgga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hyg-R
<400> 2
cgcgtctgct gctccataca ag 22

Claims (3)

1.一种用于菟丝子的生防菌鲁保-TB182（Colletotrichum acutatum），保藏编号为CGMCC No. 17472。
2.根据权利要求1所述的生防菌鲁保-TB182，其特征在于，所述菟丝子为菟丝子属（Cuscuta Linn.）植物。
3.根据权利要求1所述的生防菌鲁保-TB182，其特征在于，所述菟丝子为菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）、南方菟丝子（Cuscuta australis R. Br.）或日本菟丝子（Cuscuta japonica Choisy）。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106417357A (zh) * 2016-09-12 2017-02-22 田新华 一种防除菟丝子的除草剂及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106417357A (zh) * 2016-09-12 2017-02-22 田新华 一种防除菟丝子的除草剂及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU HAO等: "Isolation and identification of parasitic fungus YTJ-8 on dodder.", 《SOUTHWEST CHINA JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES 》 *
刘新晶等: "大豆菟丝子的识别与综合防治", 《大豆通报》 *
李健等: "菟丝子生防菌"鲁保一号"生物学特性及T-DNA插入突变体库的构建", 《草业学报》 *

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