CN111426765A - 蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法及其样品处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法及其样品处理方法。所述样品处理方法包括：将由PAN、DMF溶液和ZIF‑8@GO粉末组成的成膜分散液在金属片上固化成膜，得到PAN交联ZIF‑8@GO薄膜涂层；蜂蜜样品经稀释后用PAN交联ZIF‑8@GO薄膜涂层进行提取、洗涤和洗脱，洗脱液吹干得到处理后蜂蜜样品。所得处理后蜂蜜样品直接采用现有大环内酯类抗生素的测定方法中的一种或者多种进行测定。本发明操作简便、快速且检测结果准确，能够广泛的推广应用。

Description

蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法及其样品处理方法

技术领域

本发明涉及抗生素的检测技术领域，具体涉及一种蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法及其样品处理方法。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜、分泌物、蜜露等中的一种或多种经蜜蜂体内多种转化作用或在蜂巢中经过充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜营养丰富，成分极为复杂，主要含有天然的葡萄糖和果糖，还含有蛋白质、无机盐、有机酸、多种维生素以及钙、镁、钾、磷等等，是一种广受欢迎的天然保健食品。目前在蜜蜂饲养中为了降低蜜蜂的死亡率，提高蜂蜜产量，多种药物被使用，其中喹诺酮和大环内酯类药物是常被使用的两种抗生素，药物的使用造成蜂蜜中药物残留较多，对蜂蜜的质量和安全造成了影响，控制蜂蜜中抗生素的残留量是目前保证蜂蜜质量的一种有效途径，因此蜂蜜中抗生素残留问题不容忽视。

大环内酯类抗生素(macrolides antibiotics，MA)是一类分子结构中具有12-16碳内酯环的抗菌药物的总称，通过阻断50s核糖体中肽酰转移酶的活性来抑制细菌蛋白质合成，属于快速抑菌剂，如螺旋霉素(SPI)、替米考星(TILM)、竹桃霉素(OLE)、泰乐菌素(TYL)、北里霉素(KT)、红霉素(ERM)、交沙霉素(JOS)、罗红霉素(ROX)、阿奇霉素(AZI)、克拉霉素(CLR)等。目前大环内酯类抗生素的检测方法主要采用液相色谱(HPLC)检测法、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/LC-MS)检测法，针对不同的样品一般会采用适用的样品处理方法，以降低样品中其它物质对检测结果的干扰。

蜂蜜中成分复杂，对大环内酯类抗生素的检测干扰大，直接用蜂蜜作为样品进行大环内酯类抗生素的检测误差大，现有技术中一般会先对蜂蜜样品进行样品处理后再进行后续的仪器分析，例如：中国专利ZL201010181345.3中公开了一种采用液相色谱串联质谱而同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，包括标准溶液制备、蜂王浆样品处理、标准曲线制作和蜂王浆样品检测工序；蜂王浆样品处理工序中使用体积浓度为97％的乙腈氨水作为提取液，包括：a、先称取蜂王浆样品5g加入10ml水制得蜂王浆样品液；b、然后将蜂王浆样品液置于100ml离心塑料瓶中，再向100ml离心塑料瓶中加入浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液100μl并旋涡混合3min，然后静置15min后再向100ml离心塑料瓶中加入40ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液并混合均匀，然后对置于100ml离心塑料瓶中的液体进行超声提取10min，再在转速为3000rpm下离心5min得到一号上清液；吸取25ml一号上清液置于50ml一号离心瓶中，再向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到二号上清液，将二号上清液置于50ml玻璃离心瓶中，再将5ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液置于50ml一号离心瓶中，然后向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到三号上清液，将三号上清液置于50ml玻璃离心瓶中；将50ml玻璃离心瓶中的液体置于旋转蒸发器上于35℃以下减压浓缩至干得到残渣，然后用5ml磷酸盐缓冲溶液将残渣移到15ml塑料离心管中，再向15ml塑料离心管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取1min，再对15ml塑料离心管中的液体在转速为3000rpm下离心5min后分层，然后取乙酸乙酯层置于10ml离心管中并用氮气吹干，再向10ml离心管中加入初始流动相1ml并进行超声溶解，然后加入2ml正己烷并用力手动振摇充分混合去脂，再在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；该样品处理方法使用有机溶剂(97％的乙腈氨水)进行提取，提取后前处理方法包括脱水、离心、旋蒸、氮吹等步骤，过程繁琐。中国专利ZL201110022494.X中公开了液相色谱串联质谱同位素稀释法同时测定蜂蜜中多类药物残留的方法，该方法通过磷酸盐缓冲溶液(pH＝8)直接稀释样品后采用HLB固相萃取净化、液相色谱串联质谱法测定，同位素内标稀释内标法和外标法定量；其中样品处理具体包括：称取5g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞离心管中，加0.1mL同位素内标溶液，加20mL磷酸盐缓冲溶液稀释，混匀，待净化；净化：将蜂蜜稀释溶液转移至HLB固相萃取小柱中，弃去流出液，加20mL水淋洗，抽干，6mL甲醇洗脱，控制流速1mL/min-2mL/min，收集洗脱液，在40℃以下水浴中减压浓缩至近干，用2.0mL甲醇水溶液定容，混匀，溶液过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定；该方法采用HLB固相萃取法净化洗脱，方法简单易操作，但一次可检测样品数量不多，样品处理全程需要技术人员操作。中国专利ZL 201510351044.3中公开了一种用于检测动物源食品中残留药物的液质数据库及其使用方法，该数据库的制备包括如下步骤：(1)标准工作溶液的制备；(2)分析前处理，采用快速酶解释放结合态残留+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作；(3)一次性进样色谱分析；(4)构建液质谱库；其动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品。

目前，蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法应用较广泛的为固相萃取法，使用传统吸附材料固相萃取柱进行萃取，不能进行大批量样品的检测，效率较低。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种操作简便且检测结果准确的蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法及其样品处理方法

一种蜂蜜中大环内酯类抗生素检测的样品处理方法，包括步骤：

(1)ZIF-8@GO粉末的合成：将氧化石墨烯(GO)在水中超声分散均匀，得到氧化石墨烯分散液；将二水合乙酸锌溶于水得到A液，将A液倒入氧化石墨烯分散液中，混合均匀，得到混合液；将2-甲基咪唑溶于水得到B液，将B液倒入上述混合液中，搅拌反应至少16h，离心，弃去上清液，剩余物用甲醇多次清洗，洗去未反应物，余下固体经干燥得到灰白色固体，研磨充分得到ZIF-8@GO粉末；

(2)涂层的制备：将聚丙烯腈(PAN)粉末于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中充分溶解后加入ZIF-8@GO粉末，将ZIF-8@GO粉末分散均匀，得到成膜分散液；吸取成膜分散液，执行“将金属片缓慢浸入成膜分散液，停留3秒-7秒后迅速拿出，100℃-150℃固化1分钟-3分钟”步骤至少15次得到ZIF-8@GO薄膜涂层；

(3)称取蜂蜜样品，加入pH＝9.0-9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，混匀，得到样品液；吸取样品液进行薄膜微萃取程序：将ZIF-8@GO薄膜涂层浸入样品液中，震动频率800rpm-1000rpm提取45min-60min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入水中于震动频率800rpm-1000rpm洗涤3秒-7秒后取出，然后将薄膜涂层浸入由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液中于震动频率800rpm-1000rpm洗脱30min-45min后取出，洗脱液吹干，得到处理后蜂蜜样品。

为了降低或者避免样品中其它物质对检测结果的干扰，本发明针对蜂蜜样品的特点，基于本发明制备的特定薄膜涂层及特定的薄膜微萃取程序(例如由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液进行洗脱)高通量检测蜂蜜中的大环内酯类抗生素，方法自动化程度高，可以进行大批量样品的检测，方法更加高效。本发明制备的特定薄膜微萃取涂层与C18、聚二甲基硅氧烷(PDMS)/二乙烯基苯(DVB)等传统萃取涂层相比，对蜂蜜中大环内酯类抗生素检测的回收率更高，检测效果更好。

采用本发明样品处理方法得到的处理后蜂蜜样品能够有效的克服蜂蜜中其他物质对大环内酯类抗生素检测的干扰。

所述大环内酯类抗生素包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、北里霉素、红霉素、交沙霉素、罗红霉素等中的一种或多种。

本发明制备的特定薄膜微萃取涂层所使用的原料ZIF-8@GO粉末是采用本发明特定的制备方法即原料GO、二水合乙酸锌和2-甲基咪唑均选择在水中分散在水环境中制备得到的，与市售的ZIF-8@GO粉末或者现有技术制备的ZIF-8@GO粉末显著不同：本发明ZIF-8@GO粉末粒径较大，粒径在1μm-1.1μm，且GO镶嵌在ZIF-8(2-甲基咪唑锌盐)晶体孔内和/或GO附着在ZIF-8晶体表面，而非ZIF-8晶体附着在GO表面。本发明发现具备1μm-1.1μm粒径且GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或GO附着在ZIF-8晶体表面的ZIF-8@GO粉末与PAN交联成膜后对本发明的待测化合物(大环内酯类抗生素)具有特异吸附作用。

为了达到更好的发明效果，进行以下优选：

步骤(1)中，所述氧化石墨烯、2-甲基咪唑与二水合乙酸锌的质量比优选为0.4-0.5:3-3.5:1-1.1，进一步优选为0.4-0.5:3.28:1.1。在所述用量范围内，产物ZIF-8@GO粉末为均匀的灰白色粉末，无未与GO结合的白色粉末，也没有多余的GO反应物；对目标物的萃取效果更好。

所述搅拌反应的温度为20℃-30℃，在20℃-30℃环境温度下即可进行反应，反应条件简单，利于操作。

所述干燥优选为在55℃-65℃(最优选60℃)干燥8h-12h。

所述氧化石墨烯分散液中GO的毫克数与水的毫升数之比优选为4-5:1，进一步优选为4:1。

所述A液中二水合乙酸锌的克数与水的毫升数之比优选为1-1.1:10，进一步优选为1.1:10。

所述B液中2-甲基咪唑的克数与水的毫升数之比优选为3-3.5:10，进一步优选为3.28:10。

步骤(2)中，所述ZIF-8@GO粉末、聚丙烯腈粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为1：1.25-2：16-25；进一步优选为1：1.5：20。在所述用量范围内ZIF-8@GO粉末在分散液中均匀分散，并且分散液的黏度适宜涂覆均匀的涂层；黏度过大ZIF-8@GO粉末会聚团，黏度过小在后续金属片涂覆过程中分散液更容易随重力下滴，导致涂覆不均匀。

所述PAN的数均分子量优选为100000-200000，进一步优选为150000。

所述金属片最好进行清洗、去氧化层等预处理后再使用，涂层时成膜效果更好。进一步优选的，金属片的预处理包括：将金属片打磨除锈平整后，浸入浓盐酸中，超声至少1h后迅速拿出去除金属片上的黑色薄膜，水洗净后烘干，得到预处理后的金属片。

所述金属片可选用304不锈钢金属片，规格没有特别的要求，可根据需要设计合理的尺寸，例如适配于96-孔板的金属片尺寸。

步骤(3)中，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的毫升数与蜂蜜样品的克数之比至少为2:1。在保证蜂蜜样品溶解无粘性的同时，控制稀释倍数，提高检测灵敏度。

优选的，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的pH＝9.3。

本发明所用的原料、试剂等均可采用市售产品。

一种蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法，采用所述样品处理方法得到的处理后蜂蜜样品作为测试样品，直接采用现有大环内酯类抗生素药物的检测方法中的一种或者多种进行检测。所述的检测方法，具体包括：取测试样品，直接采用现有大环内酯类抗生素的液相色谱检测法或者现有大环内酯类抗生素的液相色谱-质谱联用检测法检测测试样品中大环内酯类抗生素。

所述测试样品优选采用甲醇水溶液稀释后，过滤，进样。

所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选为1:1。

所述大环内酯类抗生素的HPLC检测法可参考《中华人民共和国药典》等检测标准中大环内酯类抗生素对应的HPLC检测法。所述大环内酯类抗生素的液相色谱-质谱联用检测法可参考GB/T 23408-2009等检测标准中大环内酯类抗生素对应的液相色谱-质谱联用检测法。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备的特定薄膜微萃取涂层所使用的原料ZIF-8@GO粉末是采用本发明特定的制备方法即原料GO、二水合乙酸锌和2-甲基咪唑均选择在水中分散在水环境中制备得到的，与市售的ZIF-8@GO粉末或者现有技术制备的ZIF-8@GO粉末显著不同：本发明ZIF-8@GO粉末粒径较大，粒径在1μm-1.1μm(现有ZIF-8@GO粉末一般在几百纳米，粒径较小)，且GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或GO附着在ZIF-8晶体表面，而非ZIF-8晶体附着在GO表面；这种结构的ZIF-8@GO粉末与PAN交联成膜后对待测化合物(大环内酯类抗生素)具有特异吸附作用。

PAN在本发明中作为一种交联剂，使本发明中的材料(ZIF-8@GO粉末)能够均匀的分布在载体(金属片)上，并保留一定的小孔，使得待测化合物(大环内酯类抗生素)能通过扩散作用与交联材料发生吸附作用，同时PAN作为生物相容性材料，在本发明中与本发明特定制备方法制得的ZIF-8@GO混合后，增强了单独使用ZIF-8@GO的生物相容性，抗生物大分子干扰能力增强；PAN与本发明制备的特定ZIF-8@GO粉末具有协同增效作用。

为了降低或者避免样品中其它物质对检测结果的干扰，本发明针对蜂蜜样品的特点，基于本发明制备的特定薄膜涂层及特定的薄膜微萃取程序(例如由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液进行洗脱)高通量检测蜂蜜中的大环内酯类抗生素，方法自动化程度高，可以进行大批量样品的检测，方法更加高效。本发明制备的特定薄膜微萃取涂层与C18、聚二甲基硅氧烷(PDMS)/二乙烯基苯(DVB)等传统萃取涂层相比，对蜂蜜中大环内酯类抗生素检测的回收率更高，检测效果更好。再配合采用由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液洗脱，平均回收率>80％。

采用载有本发明特定ZIF-8@GO薄膜涂层的薄膜微萃取仪按照本发明特定薄膜微萃取程序进行萃取，步骤简单，萃取过程高效自动化，与96-孔板联用可以实现一次检测96个样品。

采用本发明样品处理方法得到的处理后蜂蜜样品能够有效的克服蜂蜜中其他物质对大环内酯类抗生素检测的干扰。

本发明操作简便、快速且检测结果准确，能够广泛的推广应用。

附图说明

图1为本发明制备的ZIF-8@GO粉末的X射线衍射(XRD)特征图，纵坐标为强度；

图2为本发明制备的ZIF-8@GO粉末的透射电镜(TEM)图；

图3为对比例8中ZIF-8@GO-8粉末的TEM图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。

ZIF-8@GO材料的合成

实施例1

取400mgGO在100mL水中超声分散30min使GO分散均匀，得到GO分散液；

1.10g二水合乙酸锌溶于10mL水得到A液，将A液倒入GO分散液中，搅拌1h混合均匀，得到混合液；

3.28g 2-甲基咪唑溶于10mL水得到B液，将B液倒入上述混合液中，20℃继续搅拌反应过夜(16h)后，离心，弃去上清液，剩余物用甲醇多次清洗，洗去未反应物，余下固体在60℃干燥8h，得到灰白色固体，研磨充分得到ZIF-8@GO粉末，记为ZIF-8@GO-1。

ZIF-8@GO-1粉末粒径在1μm-1.1μm，粒径较大。ZIF-8@GO-1的XRD特征图见图1，证明ZIF-8与GO紧密结合，成功合成了ZIF-8@GO。ZIF-8@GO-1的TEM图见图2，图中显示：GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或附着在ZIF-8晶体表面(即GO一部分镶嵌在ZIF-8晶体孔内，一部分附着在ZIF-8晶体表面)，而非ZIF-8晶体附着在GO表面。

实施例2

除了GO用量为500mg，其余操作同实施例1，得到ZIF-8@GO粉末，记为ZIF-8@GO-2。ZIF-8@GO-2粉末粒径在1μm-1.1μm，粒径较大。ZIF-8@GO-2的XRD特征图与图1相同，证明ZIF-8与GO紧密结合，成功合成了ZIF-8@GO。ZIF-8@GO-2的TEM图显示：GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或附着在ZIF-8晶体表面，而非ZIF-8晶体附着在GO表面。

实施例3

取400mgGO在100mL水中超声分散30min使GO分散均匀，得到GO分散液；

1.10g二水合乙酸锌溶于10mL水得到A液，将A液倒入GO分散液中，搅拌1h混合均匀，得到混合液；

3.5g 2-甲基咪唑溶于10mL水得到B液，将B液倒入上述混合液中，30℃继续搅拌反应过夜(20h)后，离心，弃去上清液，剩余物用甲醇多次清洗，洗去未反应物，余下固体在55℃干燥12h，得到灰白色固体，研磨充分得到ZIF-8@GO粉末，记为ZIF-8@GO-3。

ZIF-8@GO-3粉末粒径在1μm-1.1μm，粒径较大。ZIF-8@GO-3的XRD特征图与图1相同，证明ZIF-8与GO紧密结合，成功合成了ZIF-8@GO。ZIF-8@GO-3的TEM图显示：GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或附着在ZIF-8晶体表面，而非ZIF-8晶体附着在GO表面。

实施例4

取400mgGO在100mL水中超声分散30min使GO分散均匀，得到GO分散液；

1.0g二水合乙酸锌溶于10mL水得到A液，将A液倒入GO分散液中，搅拌1h混合均匀，得到混合液；

3.0g 2-甲基咪唑溶于10mL水得到B液，将B液倒入上述混合液中，25℃继续搅拌反应过夜(16h)后，离心，弃去上清液，剩余物用甲醇多次清洗，洗去未反应物，余下固体在65℃干燥10h，得到灰白色固体，研磨充分得到ZIF-8@GO粉末，记为ZIF-8@GO-4。

ZIF-8@GO-4粉末粒径在1μm-1.1μm，粒径较大。ZIF-8@GO-4的XRD特征图与图1相同，证明ZIF-8与GO紧密结合，成功合成了ZIF-8@GO。ZIF-8@GO-4的TEM图显示：GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或附着在ZIF-8晶体表面，而非ZIF-8晶体附着在GO表面。

对比例1

分别准确称取100mg、200mg、300mgGO在100mL水中超声分散30min，其余操作同实施例1，分别得到三种ZIF-8@GO粉末，依次记为ZIF-8@GO-5、ZIF-8@GO-6、ZIF-8@GO-7。

观察实施例1-4和对比例1中不同比例GO合成的材料发现，当GO加入量小于400mg时，干燥后仍能得到少量白色ZIF-8粉末，考虑为ZIF-8没有全部被GO修饰，而当GO量增加到400mg及以上时，干燥后可以得到较为均匀的灰白色粉末。最终确定GO的添加量为大于等于400mg，从节约原料的角度考虑优选400mg-500mg，因此，GO、2-甲基咪唑与二水合乙酸锌的质量比优选为0.4-0.5:3-3.5:1-1.1，进一步优选为0.4-0.5:3.28:1.1。

样品处理

实施例5

(1)金属片的预处理：将金属片(可选用与96孔板适配的304不锈钢金属片)打磨除锈平整后，浸入浓盐酸中，超声1h后迅速拿出去除金属片上的黑色薄膜，水洗净后烘干，得到预处理后的金属片；

(2)涂层的制备：称取750mgPAN(数均分子量＝150000)粉末于10g DMF溶液中，充分溶解后加入500mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-1)，将ZIF-8@GO粉末分散均匀，得到成膜分散液；吸取1g成膜分散液，执行“将预处理后的金属片缓慢浸入1g成膜分散液，停留5s后迅速拿出，130℃固化2min”步骤15次得到ZIF-8@GO薄膜涂层；

(3)称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序(见表1)：将ZIF-8@GO薄膜涂层浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入1mL水中于震动频率1000rpm洗涤5s后取出，然后将薄膜涂层浸入1mL由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液中于震动频率1000rpm洗脱30min后取出，洗脱液用氮气吹干，得到处理后蜂蜜样品。

表1薄膜微萃取程序

	提取	洗涤	洗脱
				时间	45min	5s	30min
内容物	样品	水	甲醇：乙腈：水(6:3:1)
				体积	1mL	1mL	1mL
震动频率	1000rpm	1000rpm	1000rpm

实施例6

(1)金属片的预处理同实施例5。

(2)涂层的制备：称取750mg PAN(数均分子量＝150000)粉末于10g DMF溶液中，超声1h充分溶解后加入400mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-2)，继续超声1h，使其分散均匀，得到成膜分散液。吸取1g成膜分散液，执行“将预处理后的金属片缓慢浸入成膜分散液，停留3s后迅速拿出，150℃固化1min”步骤15次得到ZIF-8@GO薄膜涂层。

步骤(3)同实施例5。

实施例7

(1)金属片的预处理同实施例5。

(2)涂层的制备：称取750mg PAN(数均分子量＝150000)粉末于10g DMF溶液中，超声1h充分溶解后加入600mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-3)，继续超声1h，使其分散均匀，得到成膜分散液。吸取1g成膜分散液，执行“将预处理后的金属片缓慢浸入1g成膜分散液，停留7s后迅速拿出，100℃固化3min”步骤15次得到ZIF-8@GO薄膜涂层。

步骤(3)同实施例5。

实施例5-7中薄膜涂层上有孔，可以使得样品溶液中被测化合物进入涂层内部，更快与薄膜涂层材料结合，同时分子较大的干扰物质无法通过PAN交联的ZIF-8@GO薄膜涂层，可以排除大分子干扰，适用于水相中化合物的吸附。

对比例2

金属片的预处理同实施例5。

称取5g硅酮密封胶溶于10mL甲苯中，得到硅酮密封胶甲苯溶液，执行“将预处理后的金属片缓慢浸入硅酮密封胶甲苯溶液，停留5s后迅速拿出，在干净的纸上蘸去多余的胶后将金属片垂直插入250mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-1)，旋转多次后取出，150℃固化30min，”步骤5次得到ZIF-8@GO硅酮密封胶薄膜涂层。

称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序：将ZIF-8@GO硅酮密封胶薄膜涂层浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入1mL水中于震动频率1000rpm洗涤5s后取出，然后将薄膜涂层浸入1mL由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液中于震动频率1000rpm洗脱30min后取出，洗脱液用氮气吹干，得到处理后蜂蜜样品。

该薄膜涂层疏水，不适合用于水相中化合物的吸附。

对比例3

金属片的预处理同实施例5。

250mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-1)，5mL甲基三甲氧基硅烷(MTMOS)和5mL CH₂Cl₂置于10mL离心管，混合5min后加入2.5mL 95％(质量百分比)三氟乙酸水溶液，涡旋，得到涂层浸渍液，执行“将预处理后的金属片浸入涂层浸渍液1min，缓慢抽出，60℃下烘干3min”步骤5次得到ZIF-8@GO-MTMOS薄膜涂层。

称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序：将ZIF-8@GO-MTMOS薄膜涂层浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入1mL水中于震动频率1000rpm洗涤5s后取出，然后将薄膜涂层浸入1mL由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液中于震动频率1000rpm洗脱30min后取出，洗脱液用氮气吹干，得到处理后蜂蜜样品。

该ZIF-8@GO-MTMOS薄膜涂层不均匀，物理稳定性差，在提取和洗脱过程中易脱落。

在相同样品处理及薄膜微萃取条件下进行实验的实施例5-7以及对比例2-3，本发明采用PAN+ZIF-8@GO+DMF为浸渍液得到的薄膜涂层效果最好，涂层物理稳定性最好，检测结果回收率最高。

对比例4

涂层浸渍液组成比例不同：

(1)金属片的预处理同实施例5。

(2)涂层的制备：称取2份750mg PAN(数均分子量＝150000)粉末各于10g DMF溶液中，均超声1h充分溶解后分别加入250mg、750mgZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-1)，继续超声1h，使其分散均匀，得到2份成膜分散液，记为成膜分散液-250mg、成膜分散液-750mg。观察2份成膜分散液成膜分散液-250mg、成膜分散液-750mg以及实施例5-7中的成膜分散液发现，750mg添加量下ZIF-8@GO粉末无法在DMF/PAN中分散完全，由于黏度过大产生聚团现象，分布不均匀，250mg与400mg、500mg、600mg添加量下ZIF-8@GO粉末均可在DMF/PAN形成均匀分散液，可进行下一步比较。

吸取1g成膜分散液-250mg，执行“将预处理后的金属片缓慢浸入成膜分散液，停留5s后迅速拿出，130℃固化2min”步骤5次得到ZIF-8@GO薄膜涂层。在制备过程中发现ZIF-8@GO粉末250mg添加量下，成膜分散液黏度不够，金属片浸入后拿出成膜分散液随重力向下滴落现象明显，制备出的涂层不均匀。

步骤(3)同实施例5。

对比例5

涂层浸渍次数不同：

(1)金属片的预处理同实施例5。

(2)涂层的制备：称取750mg PAN(数均分子量＝150000)粉末于10g DMF溶液中，超声1h充分溶解后加入500mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-1)，继续超声1h，使其分散均匀，得到分散液。吸取1g分散液，分别执行“将预处理后的金属片缓慢浸入1g分散液，停留5s后迅速拿出，130℃固化2min”步骤10次、15次、20次、25次得到ZIF-8@GO薄膜涂层-10次、ZIF-8@GO薄膜涂层-15次、ZIF-8@GO薄膜涂层-20次和ZIF-8@GO薄膜涂层-25次。

步骤(3)同实施例5。

在相同样品处理及薄膜萃取条件下进行实验，根据结果最终确定重复次数为15次。通过检测结果可以得到，浸渍5次与10次回收率明显低于15次，而15次以后，回收率没有明显的上升，为了节约原料以及简化实验过程，最终确定重复次数优选为15次。

对比例6(201710111316.1中实施例1)

将聚丙烯腈基膜浸入2mol/L的氢氧化钠溶液中，于65℃水解1h，聚丙烯腈中发生水解反应，腈基转化为羧基，使膜表面带负电，得到水解后的聚丙烯腈(HPAN)；将HPAN用去离子水反复冲洗，然后将所得HPAN膜浸入去离子水中浸泡24h得到HPAN膜；配置0.2mol/L的硝酸锌水溶液，以及0.4wt.％的聚乙烯亚胺(PEI)水溶液，并将二者等体积混合配成水相溶液；配置0.2mol/L的2-甲基咪唑/正己烷溶液为油相溶液；将HPAN膜浸入水相溶液中1h，Zn²⁺和阳离子聚合物(PEI)通过Zn-N键发生螯合作用，并通过静电作用组装在带负电的HPAN膜表面；倒掉水相溶液，用滤纸将膜表面残余水分擦干，在所得膜的上方倒入油相溶液，界面反应30min，使得膜表面的Zn²⁺和2-甲基咪唑在水油两相的界面接触，原位生长形成ZIF-8/PEI杂化分离层，反应后，将膜表面的正己烷溶液倒掉，并用乙醇清洗膜表面残余溶剂和配体，再用去离子水冲洗膜表面，所制备的膜置于密闭无尘通风柜中，室温干燥2h，得到MOFs杂化膜纳滤膜。

称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序：将到MOFs杂化膜纳滤膜浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出MOFs杂化膜纳滤膜，再将MOFs杂化膜纳滤膜浸入1mL水中于震动频率1000rpm洗涤5s后取出，然后将MOFs杂化膜纳滤膜浸入1mL由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液中于震动频率1000rpm洗脱30min后取出，洗脱液用氮气吹干，得到处理后蜂蜜样品。

MOFs杂化膜纳滤膜不适用与蜂蜜中大环内酯类样品的检测，无法对大环内酯类抗生素进行有效的吸附和洗脱。

对比例7

金属片的预处理同实施例5。

提取膜的制备：称取500mg ZIF-8@GO粉末(ZIF-8@GO-1)在10g DMF溶液分散均匀，得到分散液；取膜厚100μm PAN膜(北京赛普瑞特设备有限公司)，利用真空抽滤技术将分散液中的ZIF-8@GO-1与PAN膜结合形成ZIF-8@GO-PAN复合膜，膜层厚度为200μm。

称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序：将到ZIF-8@GO-PAN复合膜浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出薄膜涂层，复合膜上ZIF-8/GO层脱落且分散成细小的粉末，完成后续洗涤和洗脱过程困难。

ZIF-8@GO-PAN复合膜是采用抽滤的方式使得ZIF-8/GO物理附着在滤膜(PAN膜)上面，ZIF-8/GO与滤膜未发生交联作用，此外，ZIF-8/GO在滤膜上为单面修饰，只能通过重复抽滤形式吸附目标物，洗脱困难，通过简单洗脱得到含待测目标物的样品，局限性较大。

实施例8

分别取实施例5、实施例6、实施例7以及对比例2-7中处理后蜂蜜样品作为测试样品，将测试样品用甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为1:1)稀释定容至1mL，过滤膜后进样，按GB/T 23408-2009中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、北里霉素、红霉素、交沙霉素、罗红霉素的HPLC-MS/MS检测法进行测定，具体为：

液相色谱条件：

色谱柱：C18,5μm，150mm×2.1mm(内径)或相当的C18柱

流动相：0.1％(质量百分比)甲酸水溶液+甲醇，梯度参见表2；

流速：0.25mL/min；

柱温：室温

进样量：25μL

质谱条件：

串联四级杆质谱条件参见表3。

检测结果见表4，分析检测结果发现，实施例5、实施例6与实施例7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率均在70％-90％；其中，实施例5、实施例6与实施例7方法处理后蜂蜜样品中螺旋霉素的回收率依次为75％、72％、79％，替米考星的回收率依次为90％、84％、82％，竹桃霉素的回收率依次为75％、80％、76％，泰乐菌素的回收率依次为76％、72％、70％，北里霉素的回收率依次为85％、86％、77％，红霉素的回收率依次为83％、82％、88％，交沙霉素的回收率依次为73％、81％、77％，罗红霉素的回收率依次为80％、75％、81％。对比例2-7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率均低于70％，部分药物(替米考星、竹桃霉素、北里霉素)不能达到检测要求。

表2液相色谱梯度洗脱程序

表3八种大环内酯定性离子对、定量离子对

表4

对比例8

取400mgGO在100mL甲醇中超声分散30min使GO分散均匀，得到GO分散液：

1.10g二水合乙酸锌溶于10mL甲醇得到A液，将A液倒入GO分散液中，搅拌1h混合均匀，得到混合液；

3.28g 2-甲基咪唑溶于10mL甲醇得到B液，将B液倒入上述混合液中，20℃继续搅拌反应过夜(16h)后，离心，弃去上清液，剩余物用甲醇多次清洗，洗去未反应物，余下固体在60℃干燥8h，得到灰白色固体，研磨充分得到ZIF-8@GO粉末，记为ZIF-8@GO-8。

ZIF-8@GO-8粉末粒径在0.3μm-0.4μm，粒径较小。ZIF-8@GO-8的TEM图见图3，图中显示：ZIF-8晶体附着在GO表面；与本发明制备的ZIF-8@GO粉末中GO镶嵌在ZIF-8晶体孔内和/或附着在ZIF-8晶体表面的结构明显不同。

除涂层制备中加入ZIF-8@GO(ZIF-8@GO-8)粉末外，样品处理步骤(1)(2)(3)与实施例5相同，样品检测条件与实施例8相同。

分析检测结果发现，采用对比例8ZIF-8@GO-8交联PAN薄膜处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素(螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、北里霉素、红霉素、交沙霉素、罗红霉素)的回收率均低于70％，对应单个药物的回收率均低于实施例5-7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率。以竹桃霉素为例：对比例8方法处理后蜂蜜样品中竹桃霉素抗生素的回收率低于15％，实施例5-7方法处理后蜂蜜样品中竹桃霉素抗生素的回收率依次为75％、80％、76％。

说明由于ZIF-8@GO粉末制备基质不同，得到ZIF-8@GO粉末的粒径、ZIF-8与GO的组合方式不同，导致对8种大环内酯类抗生素的吸附能力不同。

对比例9 PAN+DMF成膜

除了“(2)涂层的制备：称取750mgPAN(数均分子量＝150000)粉末于10g DMF溶液中，充分溶解得到成膜分散液；吸取1g成膜分散液，执行“将预处理后的金属片缓慢浸入1g成膜分散液，停留5s后迅速拿出，130℃固化2min”步骤15次得到薄膜涂层；”之外，其余操作同实施例5。样品检测条件与实施例8相同。

处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率均低于3％，对应单个药物的回收率均低于实施例5-7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率。对比例9方法处理后蜂蜜样品中竹桃霉素抗生素的回收率为0.3％，螺旋霉素的回收率为1％、替米考星的回收率为0.4％、泰乐菌素的回收率为0.9％、北里霉素的回收率为2％、红霉素的回收率为0.8％、交沙霉素的回收率为0.6％、罗红霉素的回收率为2％；RSD为10％～15％(n＝5)。

实验结果证明：单独使用PAN+DMF成膜无法有效萃取蜂蜜样品中的竹桃霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素、红霉素、交沙霉素、罗红霉素抗生素。

对比例10

除了“(3)称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序(见表1)：将ZIF-8@GO薄膜涂层浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入1mL水中于震动频率1000rpm洗涤5s后取出，然后将薄膜涂层浸入1mL乙腈中于震动频率1000rpm洗脱30min后取出，洗脱液用氮气吹干，得到处理后蜂蜜样品。”，之外，其余操作同实施例5。样品检测条件与实施例8相同。

处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率均低于75％，且有3种抗生素回收率低于60％，对应单个药物的回收率均低于实施例5-7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率。对比例10方法处理后蜂蜜样品中竹桃霉素抗生素的回收率为71％，螺旋霉素的回收率为53％、替米考星的回收率为48％、泰乐菌素的回收率为57％、北里霉素的回收率为67％、红霉素的回收率为66％、交沙霉素的回收率为69％、罗红霉素的回收率为72％；RSD为10％～15％(n＝5)。

对比例11

除了“(3)称取5g蜂蜜样品，加入10mL pH＝9.3碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋混匀，得到样品液；吸取1mL样品液进行薄膜微萃取程序(见表1)：将ZIF-8@GO薄膜涂层浸入1mL样品液中，震动频率1000rpm提取45min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入1mL水中于震动频率1000rpm洗涤5s后取出，然后将薄膜涂层浸入1mL甲醇中于震动频率1000rpm洗脱30min后取出，洗脱液用氮气吹干，得到处理后蜂蜜样品。”，之外，其余操作同实施例5。样品检测条件与实施例8相同。

处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率大部分低于70％，对应单个药物的回收率均低于实施例5-7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率。对比例11方法处理后蜂蜜样品中竹桃霉素抗生素的回收率为66％，螺旋霉素的回收率为51％、替米考星的回收率为54％、泰乐菌素的回收率为61％、北里霉素的回收率为61％、红霉素的回收率为66％、交沙霉素的回收率为70％、罗红霉素的回收率为75％；RSD为10％～15％(n＝5)。

对比例12

除了“取400mgGO在100mL含氨的水中超声分散30min使GO分散均匀，得到GO分散液”外，其余步骤与实施例1相同。

通过控制水中氨水加入量，使Zn²⁺:NH₃＝1:5，1：10，1:50，1:100，1:150(摩尔比)，分别得到ZIF-8@GO-9粉末、ZIF-8@GO-10粉末、ZIF-8@GO-11粉末、ZIF-8@GO-12粉末、ZIF-8@GO-13粉末。

按照实施例5步骤处理样品，按照实施例8步骤进行样品检测。

处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率均低于70％，且回收率随ZIF-8@GO合成过程中NH₃比例增大而降低，对应单个药物的回收率均低于实施例5-7方法处理后蜂蜜样品中8种大环内酯类抗生素的回收率。对比例12采用ZIF-8@GO-9粉末、ZIF-8@GO-10粉末、ZIF-8@GO-11粉末、ZIF-8@GO-12粉末、ZIF-8@GO-13粉末制备的薄膜处理后蜂蜜样品中竹桃霉素抗生素的回收率依次为63％、54％、32％、23％、19％，螺旋霉素的回收率依次为54％、42％、36％、22％、12％，替米考星的回收率依次为67％、48％、32％、19％、8％，泰乐菌素的回收率依次为58％、53％、40％、33％、26％，北里霉素的回收率依次为65％、60％、52％、40％、32％，红霉素的回收率依次为70％、62％、49％、38％、33％，交沙霉素的回收率依次为63％、55％、50％、41％、29％，罗红霉素的回收率依次为61％、44％、30％、22％、9％；RSD为10％～15％(n＝5)。

本发明限定范围内任意参数的组合均可实现本发明的效果。在此不再赘述。

Claims (10)

1.一种蜂蜜中大环内酯类抗生素检测的样品处理方法，其特征在于，包括步骤：

(1)ZIF-8@GO粉末的合成：将氧化石墨烯在水中超声分散均匀，得到氧化石墨烯分散液；将二水合乙酸锌溶于水得到A液，将A液倒入氧化石墨烯分散液中，混合均匀，得到混合液；将2-甲基咪唑溶于水得到B液，将B液倒入上述混合液中，搅拌反应至少16h，离心，弃去上清液，剩余物用甲醇多次清洗，洗去未反应物，余下固体经干燥得到灰白色固体，研磨充分得到ZIF-8@GO粉末；

(2)涂层的制备：将聚丙烯腈粉末于N,N-二甲基甲酰胺溶液中充分溶解后加入ZIF-8@GO粉末，将ZIF-8@GO粉末分散均匀，得到成膜分散液；吸取成膜分散液，执行“将金属片缓慢浸入成膜分散液，停留3秒-7秒后迅速拿出，100℃-150℃固化1分钟-3分钟”步骤至少15次得到ZIF-8@GO薄膜涂层；

(3)称取蜂蜜样品，加入pH＝9.0-9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，混匀，得到样品液；吸取样品液进行薄膜微萃取程序：将ZIF-8@GO薄膜涂层浸入样品液中，震动频率800rpm-1000rpm提取45min-60min后取出薄膜涂层，再将薄膜涂层浸入水中于震动频率800rpm-1000rpm洗涤3秒-7秒后取出，然后将薄膜涂层浸入由甲醇、乙腈和水按体积比6:3:1组成的溶液中于震动频率800rpm-1000rpm洗脱30min-45min后取出，洗脱液吹干，得到处理后蜂蜜样品。

2.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氧化石墨烯、2-甲基咪唑与二水合乙酸锌的质量比为0.4-0.5:3-3.5:1-1.1。

3.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述搅拌反应的温度为20℃-30℃。

4.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述干燥为在55℃-65℃干燥8h-12h。

5.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(2)中，所述ZIF-8@GO粉末、聚丙烯腈粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为1：1.25-2：16-25。

6.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚丙烯腈的数均分子量为100000-200000。

7.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的毫升数与蜂蜜样品的克数之比至少为2:1。

8.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的pH＝9.3。

9.一种蜂蜜中大环内酯类抗生素的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述样品处理方法得到的处理后蜂蜜样品作为测试样品。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，取测试样品，直接采用大环内酯类抗生素的液相色谱检测法或者大环内酯类抗生素的液相色谱-质谱联用检测法检测测试样品中大环内酯类抗生素。

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