CN111279196B

CN111279196B - 用于神经变性疾病和神经炎性疾病的诊断和预后的方法

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Publication number: CN111279196B
Application number: CN201880069312.4A
Authority: CN
Inventors: A·切尔驰亚; F·比安寇
Original assignee: Brand Technology Co ltd
Current assignee: Brand Technology Co ltd
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2038-09-20
Also published as: CN111279196A; IT201700105483A1; WO2019058303A1; US11359243B2; US20200216902A1; EP3685167B1; CA3076316A1; EP3685167A1; ES2905144T3; PL3685167T3

Abstract

本发明涉及用于由神经学疾病、神经变性疾病和/或衰老疾病引起的脑炎症状态的早期诊断和预后的方法。所述方法基于定性‑定量评价在受试者血浆中的小神经胶质微囊泡。

Description

用于神经变性疾病和神经炎性疾病的诊断和预后的方法

技术领域

本发明涉及用于由神经学疾病、神经变性疾病和/或衰老疾病引起的脑炎症状态的早期诊断和预后的方法。所述方法基于定性-定量评价在受试者血浆中的小神经胶质微囊泡。

现有技术

用于阿尔茨海默病(AD)和其他形式的与神经炎症和/或神经变性和衰老相关的痴呆和疾病(例如，帕金森病、多发性硬化、神经性疼痛)的诊断和预后的生物标志物的鉴定和验证越来越重要。

迄今为止，通过ELISA测定法来定量测量在脑脊液(CSF)中的β-淀粉状蛋白(1-42)、总tau和磷酸化tau-181是最先进的和公认的用于诊断AD的发病概率的方法。

在CSF中，已证明了与神经炎症和与AD相关的小神经胶质微囊泡的增加(Agosta F等人,Myeloid microvesicles in cerebrospinal fluid are associated with myelindamage and neuronal loss in mild cognitive impairment and Alzheimerdisease.Ann Neurol.2014 76(6):813-25)。

最近已经鉴定出一种能够选择性地鉴定小神经胶质从而将其与骨髓系统中的其他细胞区分开的标志物。所述标志物为跨膜蛋白119(Tmem119)(Bennett ML等人,Newtools for studying microglia in the mouse and human CNS.Proc Natl Acad SciUSA 2016113(12):E1738-46)。Bennett等人描述了能够识别Tmem119的细胞内结构域和细胞外结构域的单克隆抗体，其允许在脑的组织学切片中的小神经胶质的免疫染色。

新的生物标志物(其测量是可重复的，和优选地在血液样品中是可能的)的鉴定仍然是主要挑战。

发明描述

本发明的作者令人惊讶地显示，在受神经炎性疾病、神经变性疾病和/或衰老疾病(例如，AD和额颞叶痴呆(FTD))侵袭的患者的血液样品中存在小神经胶质微囊泡，但在健康个体中不存在。

因此，本发明涉及一种用于由神经学疾病、神经变性疾病、炎性疾病和/或衰老疾病引起的脑炎症状态的早期诊断的方法，其中所述方法包括在血浆样品中定性-定量测量小神经胶质微囊泡。

所述方法包括：

-对血浆样品进行分级分离以分离出微囊泡级分，其中所述分级分离通过将所述血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟(优选地，大约30分钟或20分钟)的时间来进行；

-分析所述微囊泡级分以鉴定小神经胶质微囊泡；

其中在所述样品中所述小神经胶质微囊泡的存在指示了神经炎性疾病、神经变性疾病和/或神经学疾病和/或衰老疾病。

所述小神经胶质微囊泡的鉴定通过本领域技术人员已知的方法来进行。在一个优选的实施方案中，所述方法包括在从所述血浆样品中分离出的小神经胶质微囊泡级分中测量一种或多种特异性小神经胶质微囊泡标志物。在一个优选的实施方案中，所述至少一种标志物为Tmem119。

与Tmem119相关的优点与下述事实有关：在本文中令人惊讶地观察到其在血浆中的延长的稳定性。

在一个实施方案中，所述一种或多种标志物通过免疫学方法来进行测量。在一个进一步的实施方案中，所述测量通过分子分析来进行。

根据本发明的方法令人惊讶地在神经变性疾病和神经学疾病的早期诊断中是有利的。

在一个实施方案中，所述小神经胶质微囊泡的分析是定量分析，其中在血浆中所述小神经胶质微囊泡的浓度与神经炎性疾病、神经变性疾病和/或神经学疾病的严重性程度相关。

附图说明

图1：对于对照血液样品和来自具有AD或FTD的患者的血液样品的Tmem119分子分析。

图2：对于对照血液样品和来自具有AD的患者的血液样品的Tmem119的免疫学分析。

图3：在根据本发明的方法(A)或用比较方法(B)进行处理的样品中的miRNA 1表达。

图4：通过FACS的小神经胶质微囊泡分离的代表性图像。

图5：TMEM119氨基酸序列。细胞外部分29-96以灰色突出显示。

对于对照受试者和罹患神经炎性疾病和/或神经变性疾病的受试者的血浆样品(从其中通过本领域技术人员已知的方法分离出微囊泡)进行的分子和免疫学测定法显示，仅在受到神经炎性疾病和/或神经变性疾病侵袭的样品中，在所述血浆中存在的微囊泡群体包含小神经胶质微囊泡。令人惊讶的是，本发明的作者已经显示，在对照受试者的血浆中不存在小神经胶质微囊泡，其中所述对照受试者相比于所分析的病理学受试者而言是年龄均一的受试者，所有受试者的年龄都在72岁和80岁之间。

在血浆中小神经胶质微囊泡还随着疾病进展而增加，这使得其测量成为用于监测所述疾病的可选方法。

Tmem119作为特异性的且稳定的小神经胶质微囊泡标志物的可得性使得根据本发明的诊断和预后方法成为用于神经炎性疾病和/或神经变性疾病和/或神经学疾病的诊断和/或预后的可选方法。

在一个优选的实施方案中，通过将血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟(优选地，20分钟或2分钟)的时间来分离所述小神经胶质微囊泡。

备选地，通过FACS分选或者通过用珠粒的免疫亲和测定法或者通过排阻层析来分离所述微囊泡。

实施例1：通过分子分析来鉴定在血浆样品中的Tmem119。

从被分类为对照受试者、罹患AD的受试者、罹患FTD的受试者的受试者中收集500μl的血浆。受试者选自72岁至80岁的均一年龄。通过本领域技术人员已知的方法来分离所述微囊泡。具体而言，如下来分离所述微囊泡：

1.在+4℃下将所述血浆以300g离心5分钟；

2.将上清液转移到新的1.5ml管中；

3.在+4℃下将所述上清液以14000g离心30分钟，从而沉淀出所述微囊泡；

4.将所述上清液转移到新的1.5ml管中；

5.从通过在步骤4中提到的离心而获得的粒状沉淀中进行总RNA提取。

使用miRCURY RNA分离试剂盒(CELL&PLANT#588711,Exiqon)来提取总RNA，其中使用下述程序：将350μl的包含10μl/mlβ-巯基乙醇的裂解缓冲液添加至沉淀物，然后将其涡旋振荡10秒钟。将200μl的纯乙醇添加至所得的裂解物，并且涡旋振荡10秒钟。将所述裂解物加载到柱子上，其然后以3500g离心1分钟。去除洗脱物，并且重新装配柱子，其中重复所述离心步骤直至将所述裂解物完全洗脱。

为了DNA去除，将35μl的DNA消化缓冲液和5μL的DNA酶I(Zymo Research DNase I#ZYE1010)相混合，并且直接添加至柱基质并在室温下温育15分钟。然后，施加400μl的洗涤溶液，并且以14000g离心1分钟。在去除洗脱物后，重新装配柱子，并且施加400μl的洗涤溶液并以14000g离心1分钟。通过以14000g离心2分钟来重复该操作，以便彻底干燥树脂。去除洗脱物，并且将柱子放置在新的1.7ml洗脱管中。然后，添加5μl的洗脱缓冲液，并且将柱子以200g离心2分钟和然后以14000g离心1分钟。

用Nanodrop ND-1000分光光度计来评价总RNA浓度。

使用NanoDrop ND-1000分光光度计来测量所分离出的RNA的纯度、A260/280比例和A260/230比例以及浓度。

根据制造商的实验方案，将100ng的总RNA提取物用具有ezDNase的SuperscriptIV VILO Master MIX(#11766050,Invitrogen)进行逆转录。用20ng cDNA来进行qRT-PCR，其中使用TaqMan Gene Expression Master Mix(#1611275,Applied Biosystems,ThermoFisher Scientific)和关于TMEM119(Hs01938722_u1,174bp Thermo Fisher Scientific)和GAPDH(Hs02758991_g1,93bp；Thermo Fisher Scientific)的TaqMan基因表达测定法。所有样品均在实时ABI PRISM 7500PCR系统上一式两份地进行测试。

在图1中所显示的结果清楚地显示了在从AD受试者和从FTD受试者中获得的样品中的TMEM119的表达。在对照受试者中未检测到信号。

实施例2：用免疫荧光来进行Tmem119分析

从被分类为对照受试者和罹患AD的受试者中收集500μl的血浆。如在实施例1中所描述的，获得包含微囊泡的粒状沉淀。将所述粒状沉淀重悬浮在Krebs Ringer溶液中，然后将其加载到微通道中，在所述微通道中，囊泡自由向上流动从而到达包被有膜联蛋白V的珠粒。所述微囊泡将磷脂酰丝氨酸暴露于质膜的外层并且结合膜联蛋白V，从而被所述膜联蛋白V珠粒捕获。然后，将所述珠粒在4％低聚甲醛中固定10-15分钟，然后用包含0.1％Triton-X-100的磷酸缓冲盐水(PBST)进行洗涤。

随后，将所述微囊泡用TMEM119抗体(sc244341,Santa Cruz)进行标记，用荧光二抗(Molecular Probes)进行显示。使用倒置Motic AE31E显微镜来获取图像。

在图2的图中所显示的数据指明了对于每一个所测试的样品在6个视野中进行的计数。正如从该图中可以看出的，在AD样品中存在Tmem119染色，而在对照样品中不存在。

实施例3：用于小神经胶质微囊泡分离的样品处理

从7名受AD侵袭的受试者中收集血浆，然后分成两个等分试样。

按照在实施例1中所详述的实验方案来处理500μl的第一个等分试样以分离微囊泡。

根据在WO2015/061634中所描述的实验方案来处理500μl的第二个等分试样。简而言之，将100μl的促凝血酶原激酶D(Fisher Scientific,Inc.,Hanover Park,IL)添加至500μl的血浆，并且将所述样品在室温下温育30分钟。然后，使所述样品经历以1500g离心5分钟，并且收集上清液。在将其与外泌体(exosome)沉淀溶液(ExoQuick,SystemBiosciences,Inc.,Mountainview,CA)相混合并且于4℃温育1小时后，悬浮液经历以1500g进一步离心30分钟。将如此获得的粒状沉淀用于随后的分析。

然后，就特异性miRNA的存在来测试用根据本发明的实验方案或者用比较实验方案而获得的样品，在该实施例中，报道了miRNA hsa-miR-4662a-5p(miRNA1)的定量评价。所获得的数据显示在图3中，并且显示了在从7名AD患者检查的7个血浆样品中miRNA1表达水平与疾病发病年龄的相关性。在左侧的图(其显示了涉及通过根据本发明的实验方案而获得的小神经胶质微囊泡含量的分析的数据)中，可以意识到miRNA 1表达水平与疾病发病年龄之间的间接相关性，其中表达水平随着疾病发病年龄增加而降低。在右侧的图(其显示了涉及按照在WO2015/061634中所描述的实验方案来进行的分析的数据)中，未观察到相关性。此外，只有来自4名患者的数据存在，因为并非所有通过WO2015/061634的程序而分离的样品都显示出miRNA1的表达。这表明，根据本发明的程序，而不是根据所引用的现有技术的方法，令人惊讶地成功从血浆中分离出目标级分。

实施例4：通过FACS来进行小神经胶质微囊泡的鉴定和计数

按照仪器手册的程序来进行用于小神经胶质微囊泡的鉴定和计数的仪器(CitoFlex Beckman Culter)的准备和校准；特别地，制备具有不同尺寸(100、160、200、240、300、500、900nm)的用于FACS的荧光珠粒的混合物(“Gigamix溶液”混合物)。

在使所述Gigamix珠粒适当地涡旋振荡后，记录它们的通过，以便能够创建关于目标微囊泡的尺寸的校准曲线，其中设置增益和阈值参数。

将包含根据实施例1的程序而分离的小神经胶质微囊泡的样品用细胞质染料(CSFE 2uM)进行染色，并随后通过FACS分析来进行定量。

在图4中所显示的图显示了用珠粒进行的校准(左图)，以及包含小神经胶质微囊泡(中间图)但不含外泌体(右图)的样品，这证明了相对于外泌体而言区分和收集微囊泡样品的能力。

实施例5：发展出TEM119-特异性抗体，细胞外部分

所述TMEM119蛋白是一种跨膜蛋白。氨基酸序列(SEQ ID No.1)显示在图5中。为了分离抗体，使用了两个能够识别TMEM119的细胞外部分的序列。第一个序列(SEQ ID No.2)为VAGSGEAEGSSASS，第二个序列(SEQ ID No.3)为MGPQPITLGGPSPPTN。

序列表

<110> BrainDTech

<120> 用于神经变性疾病和神经炎性疾病的诊断和预后的方法

<130> E0116408

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 283

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Val Ser Ala Ala Ala Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Gly Ser Val Pro Ala Thr Asp Ala Arg Ser Val Pro Leu Lys Ala

20 25 30

Thr Phe Leu Glu Asp Val Ala Gly Ser Gly Glu Ala Glu Gly Ser Ser

35 40 45

Ala Ser Ser Pro Ser Leu Pro Pro Pro Trp Thr Pro Ala Leu Ser Pro

50 55 60

Thr Ser Met Gly Pro Gln Pro Ile Thr Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro

65 70 75 80

Thr Asn Phe Leu Asp Gly Ile Val Asp Phe Phe Arg Gln Tyr Val Met

85 90 95

Leu Ile Ala Val Val Gly Ser Leu Ala Phe Leu Leu Met Phe Ile Val

100 105 110

Cys Ala Ala Val Ile Thr Arg Gln Lys Gln Lys Ala Ser Ala Tyr Tyr

115 120 125

Pro Ser Ser Phe Pro Lys Lys Lys Tyr Val Asp Gln Ser Asp Arg Ala

130 135 140

Gly Gly Pro Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Asp Arg Ala Pro Asp Ser

145 150 155 160

Arg Pro Glu Glu Ala Leu Asp Ser Ser Arg Gln Leu Gln Ala Asp Ile

165 170 175

Leu Ala Ala Thr Gln Asn Leu Lys Ser Pro Thr Arg Ala Ala Leu Gly

180 185 190

Gly Gly Asp Gly Ala Arg Met Val Glu Gly Arg Gly Ala Glu Glu Glu

195 200 205

Glu Lys Gly Ser Gln Glu Gly Asp Gln Glu Val Gln Gly His Gly Val

210 215 220

Pro Val Glu Thr Pro Glu Ala Gln Glu Glu Pro Cys Ser Gly Val Leu

225 230 235 240

Glu Gly Ala Val Val Ala Gly Glu Gly Gln Gly Glu Leu Glu Gly Ser

245 250 255

Leu Leu Leu Ala Gln Glu Ala Gln Gly Pro Val Gly Pro Pro Glu Ser

260 265 270

Pro Cys Ala Cys Ser Ser Val His Pro Ser Val

275 280

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Val Ala Gly Ser Gly Glu Ala Glu Gly Ser Ser Ala Ser Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Gly Pro Gln Pro Ile Thr Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Thr Asn

1 5 10 15

Claims

1.能够检测小神经胶质微囊泡的试剂在制备诊断试剂中的用途，所述诊断试剂用于在用于阿尔茨海默病(AD)和/或额颞叶痴呆(FTD)的诊断的方法中使用，其中所述方法包括：

-将血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟的时间段，从而沉淀出微囊泡级分；

-分离所述微囊泡级分并对其进行分析以鉴定小神经胶质微囊泡，

其中在所述血浆样品中小神经胶质微囊泡的存在指示了AD和/或FTD。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分析是定量类型的，并且在所述血浆中所述小神经胶质微囊泡的更高的浓度相应于所述AD和/或FTD的更大的严重性程度。

3.根据权利要求1或2之一所述的用途，其中所述分析包括在所述微囊泡级分中测量至少一种特异性小神经胶质微囊泡标志物。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述至少一种特异性小神经胶质微囊泡标志物为Tmem119。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述至少一种特异性小神经胶质微囊泡标志物通过免疫学方法或通过分子方法来进行测量。