CN111196845A - 一种Gal4蛋白突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Gal4蛋白突变体及其应用，所述Gal4蛋白突变体包含如下氨基酸突变中的一种或几种组合：S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A。本发明通过将野生型的GAL4基因经易错PCR，经定向进化、定点突变和多轮迭代重组获得了Gal4突变体；利用Gal4蛋白激活番茄红素途径基因表达，以类胡萝卜素的产量表征Gal4蛋白活性的变化，较野生型Gal4，突变体活性得到了不同程度提高，其中T406A/V413A双点组合突变的调控活性最佳，将总类胡萝卜素的产量提高了48%。

Description

一种Gal4蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种Gal4蛋白突变体及其应用，尤其涉及酿酒酵母Gal4激活蛋白活性提高的突变体，并利用该突变体构建高效的葡萄糖响应基因表达调控系统及其在天然化学品生物合成途径中基因表达调控的应用。

背景技术

随着合成生物学技术的高速发展，利用微生物作为底盘细胞，通过代谢工程手段改造来生产天然化学物已成为可能。酿酒酵母作为生物安全菌株，近年来被越来越多地应用于合成各种有价值的天然产品研究。在天然产物的异源合成中，途径中多基因表达调控是目标产品高效合成的关键。

半乳糖诱导型GAL调控系统是酿酒酵母最常用并且有效的表达调控系统之一，已经被大量用于萜类、黄酮类物质的异源合成研究中。在这个调控系统中，通过敲除GAL80基因解除了对诱导剂半乳糖的依赖，使与半乳糖代谢相关的GAL1，GAL7，GAL10启动子只受Gal4激活蛋白的调控，在葡萄糖存在下，GAL4基因不表达，使GAL启动子控制下的生物合成途径基因的转录受到抑制，在低葡糖糖下，GAL4基因开始表达，从而激活GAL启动子。

因此Gal4激活蛋白的活性与基因表达强度密切相关。由于很多天然化合物的合成涉及多个酶的催化，当用多个GAL启动子表达途径中基因时，由于调控蛋白Gal4表达量和激活能力的限制，会严重影响GAL启动子的转录强度，因此通过改造Gal4蛋白的活性，提高Gal4蛋白的激活能力是重要的选项。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种Gal4蛋白突变体。

本发明还要解决的技术问题是提供上述一种GAL4突变型基因或核酸。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述的Gal4蛋白突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、包含所述突变体构建的重组菌。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种Gal4蛋白突变体，所述Gal4蛋白突变体包含如下氨基酸突变中的一种或几种组合：S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A。其中S6P代表Gal4蛋白突变体的氨基酸序列的第六位氨基酸由S突变为P、T406A代表Gal4蛋白突变体的氨基酸序列的第406位氨基酸由T突变为A、I407V代表Gal4蛋白突变体的氨基酸序列的第407位氨基酸由I突变为V、V413A代表Gal4蛋白突变体的氨基酸序列的第413位氨基酸由V突变为A、K459R代表Gal4蛋白突变体的氨基酸序列的第459位氨基酸由K突变为R、V586A代表Gal4蛋白突变体的氨基酸序列的第86位氨基酸由V突变为A。

其中，作为优选，所述Gal4蛋白突变体为T406A和V413A的双突变体；即该双突变体的氨基酸序列中的第406位氨基酸由T突变为A，同时第413位氨基酸由V突变为A。

本发明内容还包括一种GAL4突变型基因或核酸，其编码所述的Gal4蛋白突变体。

其中，所述GAL4突变型基因或核酸的第16位核苷酸由T突变为C、和/或第18位核苷酸由T突变为A，和/或第1216位核苷酸由A突变为G，和/或第1218位核苷酸由A突变为T，和/或第1219位核苷酸由A突变为G、和/或第1238位核苷酸由T突变为C、和/或第1376位核苷酸由A突变为G、和/或第1757位核苷酸由T突变为C、和/或第1758位核苷酸由C突变为T。

其中，作为优选，所述GAL4突变型基因或核酸的第1216位核苷酸由A突变为G，第1218位核苷酸由A突变为T，第1238位核苷酸由T突变为C。

本发明内容还包括含有所述的蛋白突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌。

其中，所述重组载体为PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V413A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6e/T406A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/T406A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/^I407V、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/V413A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/I407V、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/V413A、UMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{I407V /V413A}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V413A/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V413A/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^K459R/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{S6P/T406A/V413A}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{T406A/I407V/V413A}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{T406A/V413A/K459R}或PUMRI-P_ERG9-GAL4^{T406AV413AV586A}。

本发明内容还包括一种高活性Gal4蛋白突变体的获得方法，所述获得方法包括如下步骤：

1)首先将GAL4野生型基因片段分成上下游两个片段，分别通过易错PCR获得易错PCR产物片段一和易错PCR产物片段二，并分别建立GAL4的突变体文库；

2)利用番茄红素的颜色变化作为指示对GAL4的突变体文库进行初步筛选并测序获得GAL4突变型基因；

3)将初筛得到的GAL4突变型基因或GAL4突变型基因的组合与PUMRI-P_ERG9质粒相连在酿酒酵母中通过发酵后提取类胡萝卜素并分析产量筛选得到高活性Gal4蛋白突变体。

其中，所述步骤1)中上游片段中易错PCR产物片段一中的易错PCR采用的上游引物为PCYC1F2，下游引物为GAL4D-R1，所述步骤1)中易错PCR产物片段二中易错PCR采用的上游引物为Gal4-DF2，下游引物为TPGK1R2。

其中，所述步骤3)中的PUMRI-P_ERG9质粒获得方法为：以酿酒酵母BY4741基因组为模板，PCR扩增出ERG9启动子，将ERG9启动子与PUMRI-15质粒进行连接，构建得到PUMRI-P_ERG9质粒。

其中，所述步骤3)中的酿酒酵母为Ylyc-TS0。

在酿酒酵母BY4741中，用GAL1-10启动子表达番茄红素合成途径中的基因tHMG1、crtE03M、crtI、crtYB11M，同时敲除菌株本身GAL80基因，使菌株番茄红素的产量与Gal4的表达量和活性密切相关。在上述菌株的基础上，继续敲除染色体上GAL4基因后，将无法激活GAL启动子下基因的转录。将GAL4突变体文库随机置于酵母弱启动子CYCl下表达，如果Gal4突变体激活能力增强，则会促进GAL启动子控制下的番茄红素合成途径中基因的表达，番茄红素的积累可以通过菌落颜色直观辨别，因此挑出平板中颜色加深的菌株进行进一步测序验证。

针对目前酵母中的Gal4引导的调控系统对长代谢途径基因表达调控强度有限的问题，本发明的目的是提供一种通过定向进化获得激活能力增强的Gal4蛋白突变体及其在基因表达调控当中的应用。本发明还提供了Gal4高活性蛋白突变体引导的调控系统在类胡萝卜素合成途径中的应用。

将天然产物合成途径中的基因置于GAL启动子下，敲除GAL80基因，并利用CRISPR-Cas9系统对酿酒酵母染色体上GAL4基因进行如表2的点突变修饰，即可构建葡萄糖响应的基因表达调控增强的天然产物合成系统，因此也在本发明的保护范围；

其中所述的天然产物包括但不仅限于萜类如番茄红素、虾青素以及黄酮类如水飞蓟素等。

本发明中使用的野生型的GAL4基因来源于酿酒酵母BY4741(ATCC201388)(GenBank：NM_001184062.1)及氨基酸序列的NCBI号为DAA11189.1。本发明的酿酒酵母GAL4野生型基因序列为如SEQ ID NO：1所示。Gal4野生型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

有益效果：本发明通过将野生型的GAL4基因经易错PCR，经定向进化、定点突变和多轮迭代重组获得了Gal4突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含了氨基酸突变S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A以及上述氨基酸两个、三个突变的组合；利用Gal4蛋白激活番茄红素途径基因表达，以类胡萝卜素的产量表征Gal4蛋白活性的变化，较野生型Gal4，突变体活性得到了不同程度提高，其中T406A/V413A双点组合突变的调控活性最佳，将总类胡萝卜素的产量提高了48％。

附图说明

图1为用于GAL4突变型基因表达的PUMRI-PERG9-GAL4质粒图谱；

图2为定向进化GAL4基因的流程图；

图3为定向进化筛选的GAL4突变体调控的类胡萝卜素产量与野生型GAL4调控的类胡萝卜素产量比较图；

图4为GAL4单点突变体调控的类胡萝卜素产量与野生型GAL4调控的类胡萝卜素产量比较图；

图5为GAL4双点组合突变体调控的类胡萝卜素产量与野生型GAL4调控的类胡萝卜素产量比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例所用培养基、储存液：

Luria-Bertani(LB)培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/LNaCl，用NaOH调节pH≈7.2，固体LB培养基添加1.5-2％的琼脂粉，121℃灭菌15min。

Yeast Extract Peptone Dextrose(YPD)培养基：10g/L酵母浸出粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，固体YPD培养基添加1.5-2％的琼脂粉，115℃灭菌21min。

卡那霉素储存液(50mg/m1)：取0.5g卡那霉素溶于10ml ddH₂O中，过滤除菌，于-20℃保存，使用时稀释1000倍使终浓度为50μg/ml。

氨苄青霉素储存液(100mg/ml)：取1g氨苄青霉素溶于10ml ddH₂O中，过滤除菌，于-20℃保存。使用时稀释1000倍使终浓度为100μg/ml。

遗传霉素(G418)储存液(20mg/ml)：取0.2g G418溶于10ml ddH₂O中，过滤除菌，于-20℃保存，使用时稀释100倍使终浓度为200μg/ml。

5-氟乳清酸(FOA)储存液(100mg/ml)：取0.1g 5-FOA溶于1ml二甲基亚砜中，现配现用，无需灭菌，使用时直接取1ml母液加到100ml SD固体培养基中，用于制作SD-FOA平板。

10×YNB储存液：称取1.7％YNB和5％(NH₄)₂SO₄溶于ddH₂O中，用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱保存，使用时稀释10倍。

10×氨基酸混合储存液：按以下配方称取各种氨基酸混合并溶于ddH₂O中，浓度为：L-腺嘌呤硫酸盐200mg/L，L-精氨酸200mg/L，L-组氨酸200mg/L，L-异亮氨酸300mg/L，L-亮氨酸1000mg/L，L-赖氨酸300mg/L，L-蛋氨酸200mg/L，L-苯丙氨酸500mg/L，L-苏氨酸2000mg/L，L-色氨酸200mg/L，L-酪氨酸300mg/L，L-尿嘧啶200mg/L，L-缬氨酸1500mg/L(注：配制上述氨基酸母液时，根据营养筛选的不同，缺失相应的氨基酸)。用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱存放。使用时稀释10倍。

Synthetic Defined(SD)培养基：2％葡萄糖，10％(V/V)的10×YNB母液，10％(V/V)的10×氨基酸混合母液。配置100ml SD培养基具体流程如下：取2g葡萄糖溶于80ml水中，115℃高压灭菌21min中，待培养基冷却到60℃以下，加入10ml的10×YNB母液和10ml的10×氨基酸混合母液。固体SD培养基添加1.5-2％的琼脂粉。其中SD-URA-表示缺尿嘧啶的SD培养基。

实施例所用试剂：

高保真酶DNA聚合酶(Prime STARTM HS DNApolymeras)、DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶均购于大连宝生物公司(Takara，大连)；Easy Taq DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司；DNA marker(1kb DNA ladder)购于Thermo Scientific；核酸电泳相关试剂和酵母基因组抽提试剂盒购买与上海生物工程有限公司；细菌质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒购于杭州Axygen公司；无氨基酵母氮碱(Yeast nitrogenbase without amino acids，YNB)购于上海生物工程有限公司用于合成培养基的制备；PCR引物合成及测序服务由上海生物工程有限公司或者上海博尚生物技术有限公司提供。

实施例所用常规的技术方法：

大肠杆菌感受态制备：

(1)将E.coli DH5α在LB固体平板上划线，37℃过夜培养15h左右；然后挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养，取1ml接菌液转接至100ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.35-0.40。

(2)每管分装25ml菌液至预冷的50ml离心管中，冰浴10min后，用3000rpm 4℃离心10min，收集菌体，弃上清；

(3)每管菌体中加入30ml预冷的CaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂，20mmol/LCaCl₂)，重悬菌体(冰上操作)，用3000rpm低温离心10min收集菌体，弃上清；

(4)用2ml预冷的0.1M CaCl₂-甘油溶液(含0.1mol/L的CaCl₂和15％的甘油)重悬菌体，混匀后按每管100μl分装于预冷的1.5ml离心管，-80℃保存备用。

酿酒酵母醋酸锂转化法：

(1)挑取单克隆接种到5ml YPD试管，30℃，220rpm培养15h，按1％的接种量转接到含有50ml YPD的250ml三角瓶中，30℃，220rpm培养5h左右，OD₆₀₀约为2。

(2)将菌液转移到50ml灭过菌的离心管中，3000×g，离心5min后去上清。

(3)加30ml灭菌水洗涤菌体，3000×g离心5min后去上清，重复一次。

(4)加1ml灭菌水重悬菌体，混匀后按每管100μl分装于1.5ml离心管，10000×g离心1min后去上清，备用。

(5)在上述1.5ml离心管的菌体中依次加入240μl PEG MW3350(50％w/v)，36μl的1.0M醋酸锂，50μl的单链载体DNA(Single-stranded carrier DNA，2.0mg/ml)，质粒或者线性化片段2-4μl，剩余加灭菌水至总体积360μl，重悬菌体，充分混匀。

(6)将1.5ml离心管放置42℃水浴锅中热击40min。

(7)热击结束后，10000×g离心1min钟，去上清。

(8)加入1ml YPD培养基，混匀细胞后放置于30℃，220rpm摇床复苏1.5-2h。

(9)复苏后的细胞，12000×g离心1min，去上清培养基，再用1ml灭菌纯净水水洗沉淀，12000×g离心1min，去上清，最后加入1ml灭菌纯净水重选细胞，取适量涂到相应的遗传霉素抗性或者营养缺陷平板，于30℃培养箱培养3天。

酿酒酵母培养方法：

从琼脂平板上挑取单个克隆，接种到5ml新鲜的YPD试管中，于30℃、220rpm的恒温摇床中过夜培养15h左右。然后转接到含有50ml YPD培养基的250ml三角瓶中，使摇瓶中的初始OD₆₀₀为0.05，放置30℃，220rpm的恒温摇床中培养84h。

总类胡萝卜素抽提及分析：

采用盐酸加热法抽提酿酒酵母发酵液中的类胡萝卜素，具体步骤如下：

(1)取1ml发酵液至15ml尖头离心管，常温下4000×g离心3min后去上清。

(2)加5ml纯净水洗涤菌体，常温下4000×g离心3min去上清。

(3)加1ml 3M HCl重悬细胞，放入沸水浴破胞3min后，立即放到冰上3min，4000×g离心3min去上清。

(4)加5ml纯净水洗涤细胞，4℃下4000×g离心3min，去除上清。

(5)破胞后的沉淀用4ml丙酮进行抽提，超声使细胞分散，使类胡萝卜素溶于丙酮。

(6)4℃，4000×g离心3min后，用0.22μm的有机系针式滤头过滤，将上清置于新的2ml离心管，滤液放置于4℃准备用于类胡萝卜素测定。

干重测量：取2ml发酵液置于2ml圆头离心管，12000×g离心1分钟，去上清，加入2ml纯净水清洗细胞，12000×g离心1分钟，去上清后，将离心管放置100℃烘箱烘至恒重。

总类胡萝卜素测量：总类胡萝卜素采用紫外分光光度计进行测量，所用的公式如下：测定波长为450nm，A^1％为2500。

C-----总类胡萝卜素浓度，mg/ml；

N----稀释倍数；

A1-----稀释后的总类胡萝卜素在450nm波长下，1cm光程比色皿中的吸光值。

实施例1：通过易错PCR获得GAL4基因突变体文库

GAL4基因的定向进化改造流程如图1所示。首先将酿酒酵母BY4741来源的野生型GAL4基因用NotI/SalI酶切，并连接到载体p416XWP-P_cycl-obkt(Enzyme and MicrobialTechnology，2017，100：28-36)中构建p416XWP-P_cycl-GAL4质粒。将GAL4基因分成上下两片段进行分别定向进化。首先用PCYC1F2(ACACACACTAAATTAATAGAATTCAAC)和GAL4D-R1(TTGTGAAAACTTGTAAGAGC)为上下游引物，p416XW-P_cycl-GAL4为模板对GAL4基因前半段进行易错PCR扩增得到片段一。用Gal4-DF2(CCAGCTTTCTCAGAATACAAT)和TPGK1R2(AAAGAAAAAAATTGATCTATCGATT)为上下游引物，以p416XW-P_cyc1-GAL4为模板对GAL4基因后半段进行易错PCR扩增得到片段二。

由于Mn²⁺可以增加PCR过程的碱基错配率，在利用Taq酶进行易错PCR时，在体系中加入一定量的MnCl₂以增加PCR过程中的基因突变率。易错PCR体系为：

然后p416XWP-P_cyc1-GAL4用Not I/Sal I酶切，得到的载体骨架与易错PCR产物片段一两端各具有约50bp的同源区段，将其共转化到敲除了GAL80和GAL4及过表达了tHMG1、crtE03M、crtYB11M、crtI的YlyC-TS0宿主菌(Journal of Agricultural and FoodChemistry 2019，67(4)：1072-1080)中，涂布在SD-URA^-营养缺陷型平板中，培养三天，可以建立GAL4的突变体文库一；将p416XW-P_cyc1-GAL4用Sal I/Sac I酶切，得到的载体骨架与易错PCR产物片段二两端也各具有约50bp的同源区段，将其共转化到上述的YlyC-TS0宿主菌中，可以建立GAL4的突变体文库二；将p416XW-P_cyc1-GAL4用Not I/Sac I酶切，得到的载体骨架与易错PCR产物片段一和二的两端各具有约50bp的同源区段，将三个片段共转化到上述的YlyC-TS0宿主菌中，可以建立GAL4的突变体文库三(图2所示)，涂布在SD-URA-营养缺陷型平板中，培养三天，用于实施例2中高激活能力的Gal4蛋白突变体的筛选。

实施例2高激活能力的Gal4蛋白突变体筛选

当蛋白突变体Gal4活性增强时，番茄红素途径基因的表达会增强，相对于表达野生型Gal4，菌株在平板上颜色加深；当蛋白突变体Gal4无活性或者活性低的时候，菌落呈现白色或者浅色。因此利用菌株番茄红素的颜色变化作为指示对Gal4突变体库进行筛选。用牙签挑出实施例1中颜色加深的菌落即为所需的Gal4活性增强的菌落，为了进一步验证确认Gal4突变位点，需要将酵母中的质粒抽提，转化到大肠杆菌中扩增，测序。初步筛选获得的突变体测序结果请参见表1。

重组质粒构建：以pERG9F(GCGGGATCCGCTCTAACTCCGCAGGAAC TAC)和pERG9R(GCGGAATTCTGTGTGTGTGTGATATGTGACGTG)为上下游引物，酿酒酵母BY4741(ATCC201388)基因组为模板，PCR扩增出ERG9启动子，PCR片段用BamH I和EcoR I双酶切后与同样双酶切的PUMRI-15质粒(Applied Microbiology andBiotechnology 2015，99：8419-8428)进行连接，构建PUMRI-P_ERG9质粒。然后将初筛得到的有突变的GAL4突变体基因(如表1列出的突变位点)用NotI和SacI双酶切后与同样NotI和SacI双酶切后的PUMRI-P_ERG9质粒连接转化，分别构建出含有表1中的GAL4突变位点的酿酒酵母表达载体得到了酿酒酵母整合质粒PUMRI-P_ERG9-GAL4MA-1、PUMRI-P_ERG9-GAL4MA-2、PUMRI-P_ERG9-GAL4MA-5、PUMRI-P_ERG9-GAL4MB-2、PUMRI-P_ERG9-GAL4MC-3。其中，pUMRI-P_ERG9-GAL4质粒图谱如图1所示。

分别将上述含有突变位点的酿酒酵母整合质粒重新整合到酿酒酵母Ylyc-TS0菌株中，并通过摇瓶发酵实验进行进一步的验证，结果如图3所示，5株突变体Gal4MA-1Gal4MA-1，Gal4MA-2，Gal4MA-5，Gal4MB-2和Gal4MC-3调控的类胡萝卜素产量相比与野生型Gal4调控的类胡萝卜素产量分别提高了19.7％，25.9％，23.0％，10.4％，13.7％。

实施例3利用定点突变技术构建Gal4突变体的单点突变

为了考察实施例2中各突变位点对Gal4调控蛋白活力的影响，将实施例2中获得的突变体进行了单点突变，得到了包含有氨基酸突变位点S6P、K43R、I294M、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A、S801P的9个Gal4突变体。然后将9个单点突变的GAL4突变体基因用NotI和SacI双酶切后与同样NotI和SacI双酶切后的PUMRI-P_ERG9质粒连接转化，分别构建出酿酒酵母整合质粒PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P、PUMRI-P_ERG9-GAL4^K43R、PUMRI-P_ERG9-GAL4I^294M、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V413A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S801P，分别将上述含有突变位点的酿酒酵母整合质粒重新整合到酿酒酵母Ylyc-TS0菌株中，并通过摇瓶发酵实验进行验证，结果如图4，通过上述单点突变，确认了S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A这6个位点可以提高Gal4的调控活性。

实施例4利用定点突变技术构建Gal4突变体的基因组合突变

经过实施例3单点突变，得到了包含有氨基酸突变位点S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A的6个Gal4突变体。为了考察各突变位点的组合对Gal4调控蛋白活力的影响，对这6个突变位点分别进行了定点组合突变，获得了15个Gal4双点组合突变体和4个Gal4三点组合突变体(表2)，将上述突变位点组合的基因与实施例2中的PUMRI-P_ERG9连接，得到了酿酒酵母整合质粒：PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/T406A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/T406A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/I407V、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/V413A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^S6P/V5864、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/I407V、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/V413A、UMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^T406A/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V/V413A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^I407V/V586A、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V413A/K459R、PUMRI-P_ERG9-GAL4^V413A/V5864、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{K459R /V586A}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{S6P/T406A/V413A}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{T406A/I407V/V413A}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{T406A /V413A/K459R}、PUMRI-P_ERG9-GAL4^{T406A/V413A/V586A}，将重组质粒转化到酿酒酵母Ylyc-TS0菌株中，各突变点的双点组合突变如图5所示，其中T406A/V413A双点组合突变的调控活性最佳，将总类胡萝卜素的产量提高了48％。在T406A/V413A双点突变的基础上，进一步构建S6P/T406A/V413A，T406A/I407V/V413A，T406A/V413A/K459R，T406A/V413A/V586A四株三点突变体，并整合到酿酒酵母Ylyc-TS0染色体中进行验证，但结果显示，含三点突变的Gal4活性并没有进一步提高(表2)，因此没有再进一步进行四点突变组合研究。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种Gal4蛋白突变体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2646

<212> DNA

<213> 野生型的GAL4基因(Saccharomyces cerevisiae BY4741)

<400> 1

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180

ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420

caaagacagt tgactgtatc gattgactcg gcagctcatc atgataactc cacaattccg 480

ttggatttta tgcccaggga tgctcttcat ggatttgatt ggtctgaaga ggatgacatg 540

tcggatggct tgcccttcct gaaaacggac cccaacaata atgggttctt tggcgacggt 600

tctctcttat gtattcttcg atctattggc tttaaaccgg aaaattacac gaactctaac 660

gttaacaggc tcccgaccat gattacggat agatacacgt tggcttctag atccacaaca 720

tcccgtttac ttcaaagtta tctcaataat tttcacccct actgccctat cgtgcactca 780

ccgacgctaa tgatgttgta taataaccag attgaaatcg cgtcgaagga tcaatggcaa 840

atccttttta actgcatatt agccattgga gcctggtgta tagaggggga atctactgat 900

atagatgttt tttactatca aaatgctaaa tctcatttga cgagcaaggt cttcgagtca 960

ggttccataa ttttggtgac agccctacat cttctgtcgc gatatacaca gtggaggcag 1020

aaaacaaata ctagctataa ttttcacagc ttttccataa gaatggccat atcattgggc 1080

ttgaataggg acctcccctc gtccttcagt gatagcagca ttctggaaca aagacgccga 1140

atttggtggt ctgtctactc ttgggagatc caattgtccc tgctttatgg tcgatccatc 1200

cagctttctc agaatacaat ctccttccct tcttctgtcg acgatgtgca gcgtaccaca 1260

acaggtccca ccatatatca tggcatcatt gaaacagcaa ggctcttaca agttttcaca 1320

aaaatctatg aactagacaa aacagtaact gcagaaaaaa gtcctatatg tgcaaaaaaa 1380

tgcttgatga tttgtaatga gattgaggag gtttcgagac aggcaccaaa gtttttacaa 1440

atggatattt ccaccaccgc tctaaccaat ttgttgaagg aacacccttg gctatccttt 1500

acaagattcg aactgaagtg gaaacagttg tctcttatca tttatgtatt aagagatttt 1560

ttcactaatt ttacccagaa aaagtcacaa ctagaacagg atcaaaatga tcatcaaagt 1620

tatgaagtta aacgatgctc catcatgtta agcgatgcag cacaaagaac tgttatgtct 1680

gtaagtagct atatggacaa tcataatgtc accccatatt ttgcctggaa ttgttcttat 1740

tacttgttca atgcagtcct agtacccata aagactctac tctcaaactc aaaatcgaat 1800

gctgagaata acgagaccgc acaattatta caacaaatta acactgttct gatgctatta 1860

aaaaaactgg ccacttttaa aatccagact tgtgaaaaat acattcaagt actggaagag 1920

gtatgtgcgc cgtttctgtt atcacagtgt gcaatcccat taccgcatat cagttataac 1980

aatagtaatg gtagcgccat taaaaatatt gtcggttctg caactatcgc ccaataccct 2040

actcttccgg aggaaaatgt caacaatatc agtgttaaat atgtttctcc tggctcagta 2100

gggccttcac ctgtgccatt gaaatcagga gcaagtttca gtgatctagt caagctgtta 2160

tctaaccgtc caccctctcg taactctcca gtgacaatac caagaagcac accttcgcat 2220

cgctcagtca cgccttttct agggcaacag caacagctgc aatcattagt gccactgacc 2280

ccgtctgctt tgtttggtgg cgccaatttt aatcaaagtg ggaatattgc tgatagctca 2340

ttgtccttca ctttcactaa cagtagcaac ggtccgaacc tcataacaac tcaaacaaat 2400

tctcaagcgc tttcacaacc aattgcctcc tctaacgttc atgataactt catgaataat 2460

gaaatcacgg ctagtaaaat tgatgatggt aataattcaa aaccactgtc acctggttgg 2520

acggaccaaa ctgcgtataa cgcgtttgga atcactacag ggatgtttaa taccactaca 2580

atggatgatg tatataacta tctattcgat gatgaagata ccccaccaaa cccaaaaaaa 2640

gagtaa 2646

<210> 2

<211> 881

<212> PRT

<213> 野生型的GAL4蛋白(Saccharomyces cerevisiae BY4741)

<400> 2

Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu

1 5 10 15

Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu

20 25 30

Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro

35 40 45

Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu

50 55 60

Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile

65 70 75 80

Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu

85 90 95

Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala

100 105 110

Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser

115 120 125

Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu

130 135 140

Thr Val Ser Ile Asp Ser Ala Ala His His Asp Asn Ser Thr Ile Pro

145 150 155 160

Leu Asp Phe Met Pro Arg Asp Ala Leu His Gly Phe Asp Trp Ser Glu

165 170 175

Glu Asp Asp Met Ser Asp Gly Leu Pro Phe Leu Lys Thr Asp Pro Asn

180 185 190

Asn Asn Gly Phe Phe Gly Asp Gly Ser Leu Leu Cys Ile Leu Arg Ser

195 200 205

Ile Gly Phe Lys Pro Glu Asn Tyr Thr Asn Ser Asn Val Asn Arg Leu

210 215 220

Pro Thr Met Ile Thr Asp Arg Tyr Thr Leu Ala Ser Arg Ser Thr Thr

225 230 235 240

Ser Arg Leu Leu Gln Ser Tyr Leu Asn Asn Phe His Pro Tyr Cys Pro

245 250 255

Ile Val His Ser Pro Thr Leu Met Met Leu Tyr Asn Asn Gln Ile Glu

260 265 270

Ile Ala Ser Lys Asp Gln Trp Gln Ile Leu Phe Asn Cys Ile Leu Ala

275 280 285

Ile Gly Ala Trp Cys Ile Glu Gly Glu Ser Thr Asp Ile Asp Val Phe

290 295 300

Tyr Tyr Gln Asn Ala Lys Ser His Leu Thr Ser Lys Val Phe Glu Ser

305 310 315 320

Gly Ser Ile Ile Leu Val Thr Ala Leu His Leu Leu Ser Arg Tyr Thr

325 330 335

Gln Trp Arg Gln Lys Thr Asn Thr Ser Tyr Asn Phe His Ser Phe Ser

340 345 350

Ile Arg Met Ala Ile Ser Leu Gly Leu Asn Arg Asp Leu Pro Ser Ser

355 360 365

Phe Ser Asp Ser Ser Ile Leu Glu Gln Arg Arg Arg Ile Trp Trp Ser

370 375 380

Val Tyr Ser Trp Glu Ile Gln Leu Ser Leu Leu Tyr Gly Arg Ser Ile

385 390 395 400

Gln Leu Ser Gln Asn Thr Ile Ser Phe Pro Ser Ser Val Asp Asp Val

405 410 415

Gln Arg Thr Thr Thr Gly Pro Thr Ile Tyr His Gly Ile Ile Glu Thr

420 425 430

Ala Arg Leu Leu Gln Val Phe Thr Lys Ile Tyr Glu Leu Asp Lys Thr

435 440 445

Val Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ile Cys Ala Lys Lys Cys Leu Met Ile

450 455 460

Cys Asn Glu Ile Glu Glu Val Ser Arg Gln Ala Pro Lys Phe Leu Gln

465 470 475 480

Met Asp Ile Ser Thr Thr Ala Leu Thr Asn Leu Leu Lys Glu His Pro

485 490 495

Trp Leu Ser Phe Thr Arg Phe Glu Leu Lys Trp Lys Gln Leu Ser Leu

500 505 510

Ile Ile Tyr Val Leu Arg Asp Phe Phe Thr Asn Phe Thr Gln Lys Lys

515 520 525

Ser Gln Leu Glu Gln Asp Gln Asn Asp His Gln Ser Tyr Glu Val Lys

530 535 540

Arg Cys Ser Ile Met Leu Ser Asp Ala Ala Gln Arg Thr Val Met Ser

545 550 555 560

Val Ser Ser Tyr Met Asp Asn His Asn Val Thr Pro Tyr Phe Ala Trp

565 570 575

Asn Cys Ser Tyr Tyr Leu Phe Asn Ala Val Leu Val Pro Ile Lys Thr

580 585 590

Leu Leu Ser Asn Ser Lys Ser Asn Ala Glu Asn Asn Glu Thr Ala Gln

595 600 605

Leu Leu Gln Gln Ile Asn Thr Val Leu Met Leu Leu Lys Lys Leu Ala

610 615 620

Thr Phe Lys Ile Gln Thr Cys Glu Lys Tyr Ile Gln Val Leu Glu Glu

625 630 635 640

Val Cys Ala Pro Phe Leu Leu Ser Gln Cys Ala Ile Pro Leu Pro His

645 650 655

Ile Ser Tyr Asn Asn Ser Asn Gly Ser Ala Ile Lys Asn Ile Val Gly

660 665 670

Ser Ala Thr Ile Ala Gln Tyr Pro Thr Leu Pro Glu Glu Asn Val Asn

675 680 685

Asn Ile Ser Val Lys Tyr Val Ser Pro Gly Ser Val Gly Pro Ser Pro

690 695 700

Val Pro Leu Lys Ser Gly Ala Ser Phe Ser Asp Leu Val Lys Leu Leu

705 710 715 720

Ser Asn Arg Pro Pro Ser Arg Asn Ser Pro Val Thr Ile Pro Arg Ser

725 730 735

Thr Pro Ser His Arg Ser Val Thr Pro Phe Leu Gly Gln Gln Gln Gln

740 745 750

Leu Gln Ser Leu Val Pro Leu Thr Pro Ser Ala Leu Phe Gly Gly Ala

755 760 765

Asn Phe Asn Gln Ser Gly Asn Ile Ala Asp Ser Ser Leu Ser Phe Thr

770 775 780

Phe Thr Asn Ser Ser Asn Gly Pro Asn Leu Ile Thr Thr Gln Thr Asn

785 790 795 800

Ser Gln Ala Leu Ser Gln Pro Ile Ala Ser Ser Asn Val His Asp Asn

805 810 815

Phe Met Asn Asn Glu Ile Thr Ala Ser Lys Ile Asp Asp Gly Asn Asn

820 825 830

Ser Lys Pro Leu Ser Pro Gly Trp Thr Asp Gln Thr Ala Tyr Asn Ala

835 840 845

Phe Gly Ile Thr Thr Gly Met Phe Asn Thr Thr Thr Met Asp Asp Val

850 855 860

Tyr Asn Tyr Leu Phe Asp Asp Glu Asp Thr Pro Pro Asn Pro Lys Lys

865 870 875 880

Glu

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> PCYC1F2(Artificial Sequence)

<400> 3

acacacacta aattaataga attcaac 27

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> GAL4D-R1 (Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtgaaaac ttgtaagagc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Gal4-DF2(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagctttct cagaatacaa t 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> TPGK1R2(Artificial Sequence)

<400> 6

aaagaaaaaa attgatctat cgatt 25

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> pERG9F(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgggatccg ctctaactcc gcaggaacta c 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> pERG9R(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggaattct gtgtgtgtgt gatatgtgac gtg 33

Claims (10)

1.一种Gal4蛋白突变体，其特征在于，所述Gal4蛋白突变体包含如下氨基酸突变中的一种或几种组合：S6P、T406A、I407V、V413A、K459R、V586A。

2.根据权利要求1所述的Gal4蛋白突变体，其特征在于，所述Gal4蛋白突变体为T406A和V413A的双突变体。

3.一种GAL4突变型基因或核酸，其编码权利要求1或2所述的Gal4蛋白突变体。

4.根据权利要求3所述的GAL4突变型基因或核酸，其特征在于，所述GAL4突变型基因或核酸的第16位核苷酸由T突变为C、和/或第18位核苷酸由T突变为A，和/或第1216位核苷酸由A突变为G，和/或第1218位核苷酸由A突变为T，和/或第1219位核苷酸由A突变为G、和/或第1238位核苷酸由T突变为C、和/或第1376位核苷酸由A突变为G、和/或第1757位核苷酸由T突变为C、和/或第1758位核苷酸由C突变为T。

5.根据权利要求3~4任一项所述的GAL4突变型基因或核酸，其特征在于，所述GAL4突变型基因或核酸的第1216位核苷酸由A突变为G，第1218位核苷酸由A突变为T，第1238位核苷酸由T突变为C。

6.含有权利要求1或2所述的蛋白突变体、权利要求3~5任一项所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^S6P 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^T406A 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^I407V 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^V413A 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^K459R 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^V586A 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^S6P/T406A 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^S6P/T406A 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{S6P/ I407V} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{S6P/ V413A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^S6P/K459R 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{S6P /V586A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A/ I407V} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A/ V413A} 、UMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A /K459R} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A /V586A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{I407V /V413A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{I407V/ K459R} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^I407V/V586A 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{V413A/ K459R} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{V413A/ V586A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{K459R/ V586A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{S6P/T406A/V413A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A/I407V/V413A} 、PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A/V413A/K459R} 或PUMRI-P _ERG9 -GAL4 ^{T406A/V413A/V586A} 。

8.一种高活性Gal4蛋白突变体的获得方法，其特征在于，所述获得方法包括如下步骤：

1）首先将GAL4野生型基因片段分成上下游两个片段，分别通过易错PCR获得易错PCR产物片段一和易错PCR产物片段二，并分别建立GAL4的突变体文库；

2）利用番茄红素的颜色变化作为指示对GAL4的突变体文库进行初步筛选并测序获得GAL4突变型基因；

3）将初筛得到的GAL4突变型基因或GAL4突变型基因的组合与PUMRI-P _ERG9 质粒相连在酿酒酵母中通过发酵后提取类胡萝卜素并分析产量筛选得到高活性Gal4蛋白突变体。

9.根据权利要求8所述的高活性Gal4蛋白突变体的获得方法，其特征在于，所述步骤1）中上游片段中易错PCR产物片段一中的易错PCR采用的上游引物为PCYC1F2，下游引物为GAL4D-R1，所述步骤1）中易错PCR产物片段二中易错PCR采用的上游引物为Gal4-DF2，下游引物为TPGK1R2。

10.权利要求8所述的高活性Gal4蛋白突变体的获得方法，其特征在于，所述步骤3）中所述PUMRI-P _ERG9 质粒获得方法为：以酿酒酵母BY4741基因组为模板，PCR扩增出ERG9启动子，将ERG9启动子与PUMRI-15质粒进行连接，构建得到 PUMRI-P _ERG9 质粒。

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