CN111187801A - 检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基及制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，所述培养基包括如下重量份的原料：葡糖糖40份、蛋白胨10份、琼脂粉18份、硫酸链霉素0.1g/L、青霉素钾0.1g/L、CuSO4•5H2O粉末1份和水1000ml，通过葡糖糖、蛋白胨和琼脂粉制作的培养基，为环链棒束孢提供了碳源、氮源和生长因子等营养物质和充足的能量来源，利用（硫酸链霉素和青霉素钾）双抗对细菌的杀伤作用、以及CuSO4•5H2O粉末中环链棒束孢对Cu2+的耐受性及Cu2+对非目标真菌的抑制，实现培养基抗杂菌能力强，对目标真菌环链棒束孢分离效率达到了100%，避免了杂菌的干扰导致检测数据的偏差性大的缺点，实现快速检测土壤中环链棒束孢种群数量，使其能够精准施菌在田间，提高害虫的防控效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基及其制备使用方法，属于农田微生物检测领域。
背景技术
长期以来，在农业生产中，由于过度使用化学农药，导致严重的“3R问题”（Residue残留、Resistance 抗药性、Resurgence 再猖獗），而绿色防控技术由于不污染环境，可持续性强、对人和动物安全等诸多优点备受植保工作者的青睐。其中，利用昆虫病原真菌防治农业害虫由来已久，在这些对害虫具有杀伤作用的真菌中，环链棒束孢就是一种重要的昆虫病原真菌，据报道，环链棒束孢广泛存在于森林、土壤等生态系统中，更有报道在空气中也能分离到该菌，且对多种鳞翅目害虫、螨类、线虫等均具有明显的杀伤效果，显示出了较大的生防潜力。
目前环链棒束孢在田间的防治运用上，由于复杂多变的环境影响，不能够清楚的了解环链棒束孢在田间的数量动态变化，防治效果不佳；给精准施菌、精准防控带来了困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，能够快速简单地检测到施菌后环链棒束孢在田间的种群数量，使其能够精准施菌在田间，提高害虫的防控效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，所述培养基包括如下重量份的原料：
葡糖糖35-45份、蛋白胨9-11份、琼脂粉15-20份、硫酸链霉素0.1份、青霉素钾0.1份、CuSO4•5H2O粉末1份和水939.8-922.8份。
本发明对上述原料的特定选择，PH自然，其中葡糖糖能够为环链棒束孢提供充足的能量来源，蛋白胨能够提供碳源、氮源和生长因子等营养物质，其中加入硫酸链霉素、青霉素钾和CuSO4•5H2O，利用双抗对细菌的杀伤作用、环链棒束孢对Cu2+的耐受性及Cu2+对非目标真菌的抑制，使得培养基抗杂菌能力强，对目标真菌环链棒束孢分离效率达到了100%；并通过各原料用量的限定，能够提高环链棒束孢对各物质的吸收，达到快速的检测出土壤中环链棒束孢种群数量。
述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，所述培养基包括如下重量份的原料：葡糖糖40份、蛋白胨10份、琼脂粉18份、硫酸链霉素0.1份、青霉素钾0.1份、CuSO4•5H2O粉末1份和水930.8份。
通过对各原料的进一步限定，能够更好促进环链棒束孢对各营养物质的吸收，便于快速检测土壤中的环链棒束孢种群数量。
快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基的制备方法，包括以下步骤：
1）原料混合：将规定重量葡糖糖、蛋白胨、琼脂粉加入200ml水混匀，定容至1000ml,PH自然、作为基础培养基；
2）灭菌：将混匀后的基础培养基放置于121℃的环境下灭菌25-35min,取出冷却至40℃；
3）再在步骤2）中加入规定重量的硫酸链霉素、青霉素钾和CuSO4•5H2O粉末，充分混匀趁热倒入培养皿，倒入量以铺满整个培养皿底部为宜，待凝固即可得环链棒束孢种群快速检测培养皿。
所述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，其特征在于：所述未使用完的环链棒束孢种群快速检测培养皿用保鲜膜将其密封，放入4℃、相对湿度RH为60-70%的培养箱里储藏备用。
所述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量培养基的使用方法，其特征在于：该方法是在环链棒束孢种群快速检测培养皿中加入300uL所测土壤悬液，5d平皿上观察到77-266个目标真菌菌落，则该土壤悬液带菌量为104cfu/mL；5d平皿上可观察到16-35个目标真菌菌落则该土壤悬液带菌量为103cfu/mL；d平皿上观察到2-9个目标真菌菌落，则该当土壤悬液带菌量为102cfu/mL；所述的土壤悬液的制备方法是取所测土壤，稍微风干，过20目筛去除根系和石块，称取土壤5g放入已灭菌的250ml三角瓶，加入无菌0.05%吐温80溶液定容至100ml，加塞后用力摇动使其混合均匀，再将三角瓶置于震荡仪中260r/min处理20min所得土壤悬液。
本发明的有益效果是：
1.本发明的通过采用葡糖糖、蛋白胨和琼脂粉制作培养基，为环链棒束孢提供了碳源、氮源和生长因子等营养物质和充足的能量来源，利用（硫酸链霉素和青霉素钾）双抗对细菌的杀伤作用、以及CuSO4•5H2O粉末中环链棒束孢对Cu2+的耐受性及Cu2+对非目标真菌的抑制，实现培养基抗杂菌能力强，对目标真菌环链棒束孢分离效率达到了100%，避免了杂菌的干扰导致检测数据的偏差性大的缺点。
2.该培养基制作过程简单，基础培养基要提前灭菌，待冷却至40℃及以下时方可加入细菌和真菌抑制剂，对细菌和非目标真菌抑制率达到100%。
3.该培养基检测速度快、灵敏度高，2d-5d即可检测到数量≥30cfu/mL土壤中目标真菌。
4.该培养基容易保存、使用方便，将塑料袋密封后于4℃保鲜1个月左右几乎不长杂菌，可现配现用亦可提前制作后在适宜的条件下储藏备用。
5.环链棒束孢对Cu2+较强的耐受程度，加大3倍用量的CuSO4•5H2O粉末,环链棒束孢也能较好的在平皿上生长，说明环链棒束孢对重金属铜有较高的耐受性，可用于修复被重金属Cu污染的土壤。
附图说明
图1为本发明不同浓度带菌土壤悬液在CuSO4培养基上的菌落图（ACF分别为104、103、102cfu/ml带菌土壤悬液接种在培养基上检测到的正面菌落图，BDF分别为104、103、102cfu/ml带菌土壤悬液接种在培养基上检测到的反面菌落图）。
图2为接种稀释103倍未带菌的土壤液的平皿图（无菌落生长）。
图3为环链棒束孢的显微结构图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
一、快速检测土壤中环链棒束孢种群数量培养基的制作
方案1：培养基的制作将如下重量份的原料：取葡糖糖40g、蛋白胨10g和琼脂粉18g放入容器，加水200mL溶解，定容至1000ml,PH自然，放入121℃的高压灭菌锅进行灭菌30min，待冷却至40℃以下时，加入硫酸链霉素0.1g/L和青霉素钾0.1g/L，以及磨成粉的CuSO4•5H2O粉末1g，轻微摇晃使抑菌剂与培养基充分混匀，趁热前倒入培养皿，倒入量以铺满整个培养皿底部为宜，凝固即可得所需培养基。
方案2：培养基的制作将如下重量份的原料：取葡糖糖35g、蛋白胨9g和琼脂粉15g放入容器，和加水200mL溶解，定容至1000ml,PH自然，放入121℃的高压灭菌锅进行灭菌25min，待冷却至40℃以下时，加入硫酸链霉素0.1g/L和青霉素钾0.1g/L，以及磨成粉的CuSO4•5H2O粉末1g，轻微摇晃使抑菌剂与培养基充分混匀，趁热前倒入培养皿，倒入量以铺满整个培养皿底部为宜，凝固即可得所需培养基。
方案3：培养基的制作将如下重量份的原料：取葡糖糖45g、蛋白胨11g、琼脂粉20g放入容器，水1000ml混匀，PH自然，放入121℃的高压灭菌锅进行灭菌35min，待冷却至40℃以下时，加入硫酸链霉素0.1g/L和青霉素钾0.1g/L，以及磨成粉的CuSO4•5H2O粉末1g，轻微摇晃使抑菌剂与培养基充分混匀，趁热前倒入培养皿，倒入量以铺满整个培养皿底部为宜，凝固即可得所需培养基。
二、为了验证上述方案1-3制作的培养基能快速检测土壤中环链棒束孢种群数量，申请人进行了以下试验进行验证。
1.环链棒束孢孢悬液的制备
将环链棒束孢接种于平皿PDA固体培养基，25℃，RH为65%-75%条件下培养14d，15d时取出放入超净台用消毒酒精对其表面消毒后在每个平皿内分别加入10ml0.05%的吐温80，用接种铲轻轻刮取孢子，收集孢子液于已灭菌250mL底部带脊的三角瓶内，然后继续加10ml0.05%的吐温80到各平板内，重复以上操作次。将收集好孢子悬液的离心管加塞密封后用力摇勾，放置于旋转振荡器260r/min处理10min使孢子充分打散。然后重新放回超净工作台内，用酒精棉球对其外表面进行擦拭消毒后，用已灭菌的玻璃丝绵过滤后备用。
2. 田间土壤的获取及处理：
取新鲜土壤，稍微风干，过20目筛去除根系和石块，称取土壤5g放入已灭菌的250ml三角瓶，加塞后置于超净工作台内。
3. 菌土混合成及稀释：
打幵装有土壤的三角瓶塞，用移液枪加入1mL1×107/mL环链棒束孢孢子悬液，然后用无菌0.05%吐温80溶液定容至100ml。加塞后用力摇动使其混合均匀，再将三角瓶置于震荡仪中260r/min处理20min，然后放回超净工作台。剧烈摇动三角瓶使悬液均匀，迅速打开盖子并用移液枪取10ml混合液液转入90ml0.05%吐温80吐温溶液中得到稀释10-3倍的土壤悬浊液，使用上述相同的方法稀释得到10-4、10-5倍土壤悬浮液。
4.采用方案1制作培养基
5.接种及培养
在超净台中，打开平皿盖，加入300ul的10-3、10-4、10-5倍带孢子土壤悬浊液，用涂布棒涂布均匀。放入培养箱，25±1℃下培养。每个浓度8个重复。
6. 镜检确认及菌落计数：
当土壤悬液带菌量为104cfu/mL时，接种300uL，5d平皿上观察到77-266个目标真菌菌落（见图1AB），当土壤悬液带菌量为103cfu/mL时，接种300uL，5d平皿上可观察到16-35个目标真菌菌落（见图1CD），当土壤悬液带菌量为102cfu/mL时，接种300uL，5d平皿上观察到2-9个目标真菌菌落（见图1EF）。各个浓度的土壤菌悬液中，均没有观察到非目标真菌菌落（见图2），表明以1.0g/L剂量的CuSO4•5H2O为主的培养基对环链棒束孢具有100%的检测效率。
同时培养3-5d后统计菌落数目，8d后取菌丝少许用棉蓝染色，然后在显微镜下观察到以下产孢结构；分生孢子梗轮生，2-4个分支，10.1μm-15.5μm，瓶梗基部膨大椭圆形或柱形，向上突然变细成瓶颈，6.9-11.2μm×1.2-3.1μm，颈长2μm左右，分生孢子光滑、透明，椭圆形或球形，1.8-4.9μm×1.2-2.1μm，叠瓦状排列成环或斜链（环链棒束孢最典型产孢结构见图3），据以上形态特征确认为环链棒束孢。
Claims (5)
1.一种快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，其特征在于：所述培养基包括如下重量份的原料：
葡糖糖35-45份、蛋白胨9-11份、琼脂粉15-20份、硫酸链霉素0.1份、青霉素钾0.1份、CuSO4•5H2O粉末1份和水939.8-922.8份。
2.根据权利要求1所述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，其特征在于：所述培养基包括如下重量份的原料：
葡糖糖40份、蛋白胨10份、琼脂粉18份、硫酸链霉素0.1份、青霉素钾0.1份、CuSO4•5H2O粉末1份和水930.8份。
3.如权利要求1或2所述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）原料混合：将规定重量葡糖糖、蛋白胨、琼脂粉加入200ml水混匀，定容至1000ml,PH自然、作为基础培养基；
2）灭菌：将混匀后的基础培养基放置于121℃的环境下灭菌25-35min,取出冷却至40℃；
3）再在步骤2）中加入规定重量的硫酸链霉素、青霉素钾和CuSO4•5H2O粉末，充分混匀趁热倒入培养皿，倒入量以铺满整个培养皿底部为宜，待凝固即可得环链棒束孢种群快速检测培养皿。
4.根据权利要求1所述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量的培养基，其特征在于：所述未使用完的环链棒束孢种群快速检测培养皿用保鲜膜将其密封，放入4℃、相对湿度RH为60-70%的培养箱里储藏备用。
5.如权利要求3所述的快速检测土壤中环链棒束孢种群数量培养基的使用方法，其特征在于：该方法是在环链棒束孢种群快速检测培养皿中加入300uL所测土壤悬液，5d平皿上观察到77-266个目标真菌菌落，则该土壤悬液带菌量为104cfu/mL；5d平皿上可观察到16-35个目标真菌菌落，则该土壤悬液带菌量为103cfu/mL；d平皿上观察到2-9个目标真菌菌落，则该当土壤悬液带菌量为102cfu/mL；所述的土壤悬液的制备方法是取所测土壤，稍微风干，过20目筛去除根系和石块，称取土壤5g放入已灭菌的250ml三角瓶，加入无菌0.05%吐温80溶液定容至100ml，加塞后用力摇动使其混合均匀，再将三角瓶置于震荡仪中260r/min处理20min所得土壤悬液。
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