CN110923207A - 一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法 - Google Patents
一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110923207A CN110923207A CN201911145999.8A CN201911145999A CN110923207A CN 110923207 A CN110923207 A CN 110923207A CN 201911145999 A CN201911145999 A CN 201911145999A CN 110923207 A CN110923207 A CN 110923207A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- culture
- incubation
- sorting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 title description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims abstract description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 156
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 3
- 206010014405 Electrocution Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，用预先温热的完全培养基稀释电穿孔转染后的细胞获得细胞悬液，然后进行细胞孵育、分选接种，再经细胞培养获得单细胞克隆。本发明在电转原代细胞转移、培养过程中，使用预热的完全培养基，将电转细胞置于培养箱中孵育，有利于载体通过电转微孔进入细胞，再配合在利用流式细胞仪分选单细胞时先在96孔培养板中添加预热的完全培养基，减少细胞微环境变化与分选喷射对细胞的损伤，提高了细胞的存活与增殖率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养，具体涉及一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，属于细胞工程技术领域。
背景技术
原代细胞是指利用胰蛋白酶或其他技术手段从活体动物或组织中分离、培养获得的细胞，因其生物性状尚未发生大的变化，仍保持原有细胞特性，在一定程度上能模拟体内状态，被广泛应用于蛋白质组学、基因组学、遗传学以及生物医药等领域。来源于同一组织的同一类型细胞，在形态特征上虽然十分相似，但其遗传物质、生理、生化却千差万别，因此构建遗传特性一致的稳定细胞系，在基因功能研究、基因表达调控、突变分析、蛋白生产以及转基因动物培育等领域中的应用越来越广泛。
构建稳定细胞系通常采用病毒侵染法和非病毒转染法。病毒侵染法是将携带外源目的片段的病毒，如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒，转导入细胞，通过抗性筛选细胞克隆，获得稳定细胞系。非病毒转染法根据转染途径的差异，可分为物理转染、化学转染和生物转染。电穿孔转染又称电转就属于物理转染，它利用高强度电脉冲击穿细胞膜，提高细胞通透性，实现外源分子进入细胞，是目前应用范围最广、频率最高的转染方法。
原代细胞在高强度脉冲电场的作用下，细胞膜受到损伤，一部分细胞发生可逆的膜构形变化，短期内细胞非常脆弱，但能通过自身的修复恢复活力与增殖能力；另一部分细胞膜发生不可逆的构形变化，细胞会老化、凋亡。目前转染细胞单克隆分离主要采用有限稀释法、显微操作法以及流式细胞分选，有限稀释法不能确保将单个细胞接种到孔中的，获得的克隆很大一部来源于多个细胞；显微操作法和流式细胞分选虽然能将单个细胞接种到孔内，但必需增强电转原代细胞修复，否则细胞无法存活与增殖。
发明内容
针对原代细胞电转后，细胞活力低，接种的单个细胞增殖困难，很难获得单细胞克隆等问题，本发明提供了一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比，所述浓度为质量百分比浓度。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，其特征在于：用预先温热的完全培养基稀释电穿孔转染后的细胞获得细胞悬液，然后进行细胞孵育、分选接种，再经细胞培养获得单细胞克隆。
根据本发明的一个实施方案，上述预先温热的完全培养基温度为35-39℃。
根据本发明的一个实施方案，上述细胞孵育为将细胞悬液放置在二氧化碳培养箱中孵育，孵育条件为35-39℃，5％二氧化碳。进一步，上述细胞孵育时间为0.5-4h。
根据本发明的一个实施方案，上述分选接种为利用流式细胞仪，将细胞分选接种至含预先温热完全培养基的96孔培养板中。进一步，所述96孔培养板所含预先温热完全培养基体积为50-200ul/孔。更进一步，所述利用流式细胞仪分选接种细胞，细胞接种量为1个/孔。
根据本发明的一个实施方案，上述细胞培养条件为35-39℃，5％二氧化碳培养箱，培养时间为12-15天。
根据本发明的一个实施方案，上述方法中，在分选接种之后细胞培养过程中，还存在细胞生长记录步骤，所述细胞生长记录步骤为利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况。进一步，所述利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况为第1，3，5，7，9，11天细胞生长状况。
具体的说，一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备细胞悬液：取适量预先温热的完全培养基加入电转杯中，稀释转染细胞获得细胞悬液；所述预先温热的培养基温度为35-39℃；2)细胞孵育：将细胞悬液转移至无菌离心管中，放置在二氧化碳培养箱中孵育；孵育条件为35-39℃，5％二氧化碳，细胞孵育时间为0.5-4h；3)分选接种：利用流式细胞仪，将细胞分选接种至含预热培养基的96孔培养板中；所述96孔培养板所含预热培养基体积为50-200ul/孔，细胞接种量为1个/孔；4)细胞生长记录：利用Cloneselect Imager记录每孔细胞生长状况；所述利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况为第1，3，5，7，9，11天细胞生长状况；5)单细胞培养：经细胞培养，结合克隆生长状况，挑选单细胞克隆；细胞培养条件为35-39℃，5％二氧化碳培养箱，培养时间为12-15天。
有益效果：
针对现有技术中原代细胞电转后细胞膜遭受破坏，活率差，单个细胞培养困难，单细胞克隆率低等问题，本发明提供了一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法。本发明在电转原代细胞转移、培养过程中，使用预热的完全培养基，将电转细胞置于培养箱中孵育，有利于载体通过电转微孔进入细胞，再配合在利用流式细胞仪分选单细胞时先在96孔培养板中添加预热的完全培养基，减少细胞微环境变化与分选喷射对细胞的损伤，提高了细胞的存活与增殖率。本发明在挑取单细胞克隆时，利用Cloneselect Imager记录，追溯克隆来源，确保克隆来源于单个细胞。本发明在从电转杯中转移转染猪胎儿成纤维细胞时，使用预热的完全培养基轻柔的吹打、稀释细胞，能减少细胞微环境的变化和机械操作对转染细胞的再次损伤；将细胞悬液放置在二氧化碳培养箱中孵育，不仅有利于外源基因片段由细胞膜上的微孔进入细胞内，提高转染效率，而且良好的温度、湿度有利于转染细胞损伤的修复，提高细胞存活率；在单细胞克隆培养过程中，利用Cloneselect Imager记录每孔细胞生长状况，当细胞培养1-2周形成克隆时，可以通过查看细胞生长记录，追溯细胞克隆来源，保证克隆来源于同一个细胞。总之，本发明提供的基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法不仅能显著提高单细胞克隆率，而且能保证克隆来源于同一个细胞，具有重要的科研与产业价值。
附图说明
图1是实施例2转染猪胎儿成纤维细胞孵育0h形态图；其中绿色圈出的是活细胞，红色圈出的是结团细胞，黄色圈出的是死细胞；
图2是实施例2转染猪胎儿成纤维细胞孵育0.5h形态图，其中绿色圈出的是活细胞，红色圈出的是结团细胞，黄色圈出的是死细胞；
图3是实施例3的Cloneselect Imager记录的单细胞克隆生长图，其中a是培养第1天细胞，b是培养第5天细胞，c是培养第9天细胞，d是培养第11天细胞。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明原料和试剂均为市售产品，其中质粒DNA为GFP质粒，由LONZA厂家提供；本发明使用的完全培养基为含10％胎牛血清、1×非必需氨基酸、1×谷氨酰胺、100UI青霉素、100ug/ml链霉素以及1mM丙酮酸钠的DMEM培养基。
实施例1猪胎儿成纤维细胞转染及有限梯度稀释
1)猪胎儿成纤维细胞生长至85-90％融合时进行电染，电转前4小时换液一次；
2)参照LONZA转染试剂说明书进行，先将转染液放置室温30分钟，将81ulsolution与19ul supplement混匀，然后加入10ul载体质粒DNA溶液(共计10ug)，混匀，室温20分钟；
3)PBS洗涤细胞2次，0.05％TE消化收集细胞，取10ul进行细胞计数；
4)取1×106个细胞，PBS洗涤2次，彻底吸干净上清，用110ul的转染混合液重悬细胞；
5)将细胞转入电转杯，LONZA电转(条件U-023)；
6)取1ml的完全培养基加入电转杯中，轻柔稀释转染细胞，将细胞悬液转移至1.5ml无菌离心管中。
7)取10ul，利用countstar细胞计数仪进行细胞计数；
8)利用有限稀释法稀释转染细胞，按1个/孔接种至96孔板；
9)将96孔培养板放置在38.5℃，5％二氧化碳培养箱，继续培养；
10)在细胞培养的第1，3，5，7，9，11，13，15天，利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况；
11)细胞培养13-15天，开始出现明显的克隆；
12)在倒置显微镜下挑选细胞克隆。
实验结果显示：接种的96孔中有22个细胞克隆，克隆率为22.92％；通过Cloneselect Imager记录结果，追溯细胞来源，确定单细胞来源的细胞克隆有1个，单细胞克隆率为1.04％。
实施例2猪胎儿成纤维细胞转染及流式细胞分选
1)猪胎儿成纤维细胞生长至85-90％融合时进行电染，电转前4小时换液一次；
2)参照LONZA转染试剂说明书进行，先将转染液放置室温30分钟，将81ulsolution与19ul supplement混匀，然后加入10ul载体质粒DNA溶液(共计10ug)，混匀，室温20分钟；
3)PBS洗涤细胞2次，0.05％TE消化收集细胞，取10ul进行细胞计数；
4)取1×106个细胞，PBS洗涤2次，彻底吸干净上清，用110ul的转染混合液重悬细胞；
5)将细胞转入电转杯，LONZA电转(条件U-023)；
6)取1ml预先温热的完全培养基加入电转杯中，轻柔稀释转染细胞，将细胞悬液转移至1.5ml无菌离心管中。
7)将细胞悬液均分为两份，一份作为对照组，另一份作为实验组；
8)从对照组细胞悬液中取10ul，利用countstar细胞计数仪进行细胞检测；
9)实验组细胞悬液先放置在38.5℃，5％二氧化碳培养箱中孵育0.5h，再进行细胞检测；转染猪胎儿成纤维细胞孵育0h形态如图1所示，转染猪胎儿成纤维细胞孵育0.5h形态如图2所示；
10)完成细胞检测后，剩余细胞立即参照FACSMelody流式细胞分选仪操作说明，进行流式单细胞分选；
11)分选的单个细胞接种在含200ul预热完全培养基的96孔培养板中；
12)对照组与实验组分别接种1块96孔培养板，将96孔培养板放置在38.5℃，5％二氧化碳培养箱，继续培养。
实验组(孵育0.5h)和对照组(孵育0h)的细胞浓度、细胞活率、细胞平均直径、细胞平均圆度以及结团率如表1所示。
表1细胞检测结果
| 检测指标 | 对照组(孵育0h) | 实验组(孵育0.5h) |
| 细胞浓度 | 8.41×10<sup>5</sup> | 6.39×10<sup>5</sup> |
| 细胞活率 | 91.78％ | 85.41％ |
| 细胞平均直径 | 14.75μm | 14.82μm |
| 细胞平均圆度 | 0.63 | 0.65 |
| 结团率 | 17.38％ | 7.95％ |
以上结果显示：转染猪胎儿成纤维细胞在38.5℃，5％二氧化碳培养箱孵育0.5h，细胞活率降低，可能是电转时高压脉冲造成细胞膜损伤，短时间内一些不可逆膜变的细胞并未死亡，但随着时间的延长，这部分细胞死亡数量增加，因此细胞活率降低；与对照组相比，实验组细胞接团率明显降低，可能是电转造成的损伤使得细胞膜表面变得粗糙，所以对照组细胞易结团，孵育0.5h后，细胞膜已开始修复，膜表面变得圆滑，因此结团率更低。
实施例1与实施例2克隆细胞数、克隆细胞率、单克隆细胞数以及单克隆细胞率等细胞克隆培养统计结果如下表2所示。
表2细胞克隆培养结果统计表
从表2中可以看出，实施例2相对于现有技术的实施例1来说，克隆细胞数、克隆细胞率、单克隆细胞数以及单克隆细胞率都明显提高。对于实施例2而言，对照组接种96个细胞，获得35个细胞克隆，其中单细胞克隆33个，单细胞克隆率为34.38％；实验组获得50个细胞克隆，其中单细胞克隆47个，单细胞克隆率为48.96％；在细胞克隆方面，实验组细胞克隆率和单细胞克隆率都明显高于对照组。
实施例3、单细胞克隆挑选
1)实施例2接种的转染猪胎儿成纤维细胞培养24h，记为培养第1天，利用Cloneselect Imager拍照记录下每孔细胞的生长状态；
2)在细胞培养的第1，3，5，7，9，11，13，15天，利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况，记录的单细胞克隆生长情况如图3所示；
3)38.5℃，5％二氧化碳培养箱细胞培养13-15天，开始出现明显的克隆；
4)在倒置显微镜下挑选细胞克隆；
5)利用Cloneselect Imager记录结果，追溯细胞来源，确定单细胞来源的细胞克隆。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，其特征在于：用预先温热的完全培养基稀释电穿孔转染后的细胞获得细胞悬液，然后进行细胞孵育、分选接种，再经细胞培养获得单细胞克隆。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预先温热的培养基温度为35-39℃。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述细胞孵育为将细胞悬液放置在二氧化碳培养箱中孵育，孵育条件为35-39℃，5％二氧化碳。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述细胞孵育时间为0.5-4h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分选接种为利用流式细胞仪，将细胞分选接种至含预热完全培养基的96孔培养板中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述96孔培养板所含预热培养基体积为50-200ul/孔；所述利用流式细胞仪分选接种细胞，细胞接种量为1个/孔。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养条件为35-39℃，5％二氧化碳培养箱，培养时间为12-15天。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在分选接种之后细胞培养之前，还存在细胞生长记录，所述细胞生长记录为利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况为第1，3，5，7，9，11天细胞生长状况。
10.一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备细胞悬液：取适量预先温热的完全培养基加入电转杯中，稀释转染细胞获得细胞悬液；所述预先温热的完全培养基温度为35-39℃；2)细胞孵育：将细胞悬液转移至无菌离心管中，放置在二氧化碳培养箱中孵育；孵育条件为35-39℃，5％二氧化碳，细胞孵育时间为0.5-4h；3)分选接种：利用流式细胞仪，将细胞分选接种至含预热培养基的96孔培养板中；所述96孔培养板所含预热培养基体积为50-200ul/孔，细胞接种量为1个/孔；4)细胞生长记录：利用Cloneselect Imager记录每孔细胞生长状况；所述利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况为第1，3，5，7，9，11天细胞生长状况；5)单细胞培养：经细胞培养，结合克隆生长状况，挑选单细胞克隆；细胞培养条件为35-39℃，5％二氧化碳培养箱，培养时间为12-15天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911145999.8A CN110923207A (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911145999.8A CN110923207A (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110923207A true CN110923207A (zh) | 2020-03-27 |
Family
ID=69850533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911145999.8A Pending CN110923207A (zh) | 2019-11-21 | 2019-11-21 | 一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110923207A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178456A (zh) * | 2013-07-03 | 2014-12-03 | 深圳市三启生物技术有限公司 | 一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用 |
| CN104561094A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种无选择标记基因的成纤维细胞阳性单克隆的制备方法 |
| CN108588023A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-09-28 | 河北森朗生物科技有限公司 | 一种生产嵌合抗原受体修饰的γδT细胞的方法 |
-
2019
- 2019-11-21 CN CN201911145999.8A patent/CN110923207A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178456A (zh) * | 2013-07-03 | 2014-12-03 | 深圳市三启生物技术有限公司 | 一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用 |
| CN104561094A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种无选择标记基因的成纤维细胞阳性单克隆的制备方法 |
| CN108588023A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-09-28 | 河北森朗生物科技有限公司 | 一种生产嵌合抗原受体修饰的γδT细胞的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JORDAN ET等: "Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells", 《J BIOMOL TECH》, vol. 19, no. 5, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 328 * |
| 庞永胜等: "hTERT基因电转染人γδT细胞建立可诱导的永生化细胞系", 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 * |
| 庞永胜等: "hTERT基因电转染人γδT细胞建立可诱导的永生化细胞系", 《内蒙古大学学报(自然科学版)》, no. 05, 15 September 2012 (2012-09-15), pages 502 - 508 * |
| 易岚等: "医学生物学", 华中科技大学出版社, pages: 233 * |
| 梁智辉等: "《流式细胞术基本原理与实用技术》", 30 June 2008, 华中科技大学出版社, pages: 4 * |
| 苗宏生等: "原代大鼠海马神经元的高效转染", 《细胞生物学杂志》 * |
| 苗宏生等: "原代大鼠海马神经元的高效转染", 《细胞生物学杂志》, no. 03, 20 June 2004 (2004-06-20), pages 305 - 308 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114292816B (zh) | 肺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| CN113604425B (zh) | 一种适应无血清培养基环境的wayne293 lvpro细胞及其应用 | |
| CN114317444B (zh) | 肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| CN113249308B (zh) | 花鲈动脉球细胞系及其应用和培养方法 | |
| CN116694574B (zh) | Hla-a和hla-b共敲除的多血系分化潜能永生化细胞及其制造方法 | |
| CN104152403B (zh) | 一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系 | |
| CN109475582A (zh) | 基因递送的改进方法 | |
| CN106987559A (zh) | 一种重组chok1细胞株的构建方法及其应用 | |
| CN111073858A (zh) | 一种yap1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法 | |
| JP6469371B2 (ja) | 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 | |
| CN108239620A (zh) | IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株及其构建方法和应用 | |
| CN108624553B (zh) | 一种青鳉肌肉细胞系 | |
| CN110923207A (zh) | 一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法 | |
| CN115807038A (zh) | 一种视网膜分化潜能细胞系CRX-Shen001及其构建方法 | |
| CN106222202B (zh) | 一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法 | |
| CN116064541A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法 | |
| CN114686522A (zh) | 类器官高效编辑方法 | |
| CN101570740B (zh) | 一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar及应用 | |
| CN115029305A (zh) | 猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途 | |
| CN103923920B (zh) | 一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法 | |
| CN104946685A (zh) | 一种利用重组蛋白体外制备猪树突状细胞的方法 | |
| CN111808880A (zh) | 一种电转染缓冲液及其应用 | |
| CN111748514B (zh) | 一种提高膜片钳实验效率的方法 | |
| CN116411022B (zh) | 一种指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞 | |
| CN112522315B (zh) | 一种鸡原始生殖细胞转染方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200327 |