CN110799186A - 治疗炎性疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法。所述方法包括对所述受试者施用一大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，所述液相色谱馏分的治疗有效量包括至少75％的四氢大麻酚酸，其中所述馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分。

Description

治疗炎性疾病的组合物和方法
技术领域和背景技术
在其一些实施例中，本发明涉及用于治疗炎性疾病的组合物和方法。
几种人类疾病本质上都是炎性疾病、包括哮喘、克罗恩病、类风湿性关节炎、风湿性多肌痛、肌腱炎、滑囊炎、喉炎、牙龈炎、胃炎、中耳炎、乳糜泻、憩室炎和炎性肠病。另外许多慢性疾病具有炎性成分，例如动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、癌症、甚至阿尔茨海默氏病。
炎性肠病(Inflammatory bowel diseases，IBDs)，克罗恩氏病(Crohn'sdisease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)的特征是慢性肠道炎症。两种疾病都是慢性疾病，会复发且与不同的遗传易感性背景有关。它们的发作和再激活是由环境因素触发的，这些环境因素暂时破坏了粘膜屏障。这可能会改变有益性和病原性的肠细菌之间的平衡，从而刺激免疫反应。CD和UC患者均已激活先天性巨噬细胞或嗜中性粒细胞并获得了(T和B细胞)免疫反应(例如[1])。
胃肠道(GI)中的上皮细胞可作为屏障，阻止可能有害的腔内物质和微生物从肠腔侵入，并在炎症反应中发挥重要作用。它们表达多种促炎细胞因子(pro-inflammatorycytokines)，在IBD患者中被向上调控[2]。旨在向下调控肠道炎症的疗法同时利用了介体特异性和非特异性(mediator-specific and nonspecific)的免疫抑制，但可能具有相当大的副作用[3]。
大麻(marijuna,Cannabis sativa)的不同制剂已用于治疗胃肠道问题，如胃肠道疼痛、胃肠炎和腹泻[4,5]。大麻含有60多种被称为植物大麻素(phytocannabinoids)的萜酚类化合物(terpenophenolic compounds，[6]综述)。其中约50年前被发现的Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和大麻二酚(cannabidiol，CBD)被定义为活性最高的化合物[7-9]。大麻素(Cannabinoids)先前已被证明是免疫调节剂。它们改变了促炎和抗炎细胞因子的平衡，并在不同的生理系统中起到抑制细胞介导的免疫的作用[10]。例如，已证明Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabivarin，THCV)抑制巨噬细胞中亚硝酸盐的产生，从而发挥免疫调节作用[11]。
已经显示，源自大麻的大麻素(Cannabinoids，Phytocannabinoids)主要通过激活两种与G蛋白偶联的大麻素受体类型来发挥其生物学功能：大麻素1型(CB1)和大麻素2型(CB2)[4，12]。后来鉴定出第三种大麻素受体GPR55[13]。这些受体是胃肠道中内源性大麻素系统的一部分[13,14]。
大麻素已显示在结肠炎的小鼠模型中有效[15]。在人类结肠上皮细胞品系HT29中，已显示许多大麻素受体激动剂和拮抗剂(包括植物来源的THC)可抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的白介素8(interleukin-8，IL-8)释放[12]。这种抑制作用被CB2受体拮抗剂所拮抗。大麻素还被证明可通过CB1受体激活来促进胃肠道伤口愈合[4,16]。另外，我们最近报导了IBD患者的临床数据。在一项回顾性研究中，我们采访了30名获准使用医用大麻的CD患者[17]，而在一项前瞻性试验中，我们将20名CD患者随机分配以接受大麻或安慰剂来治疗IBD[18]。两者都显示出有益的作用。
大麻提取物包含数百种不同的化合物。许多合成或分离的大麻素及其受体的激动剂或拮抗剂的活性已被研究和验证。但是在IBD中与分离的化合物相比，未精制的花序似乎具有优势。例如在胃肠道炎症的动物模型中显示出，一旦炎性损伤后给予含有高含量大麻二酚(cannabidiol，CBD)的标准化大麻提取物，能够减轻损伤和移动性，可以进一步维持将CBD与其他次要大麻成分结合的原理[19]。另外大麻衍生的植物药在三种癫痫发作模型中均发挥显着的抗惊厥(anticonvulsant)作用，并且与纯的次大麻二酚(cannabidivarin，CBDV)具有可比拟的功效[20]。
其他背景技术包括：美国专利申请号20160106705、20100249223、20130059018、20140221469。
www.theleafonline.com/c/science/2014/07/cannabinoid-profile-crash-course-thca/
发明内容
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，包括对所述受试者施用一大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，所述液相色谱馏分的治疗有效量包括至少75％的四氢大麻酚酸(tetrahydrocannabinolicacid，THCA)，其中所述馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，包括至少75％四氢大麻酚酸，其中所述液相色谱馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分，用于治疗一受试者中的一炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，包括对所述受试者施用一物质组合物，所述物质组合物包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效量，所述多个液相色谱合并馏分的治疗有效量包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效量，包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸，从而治疗一受试者的一炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，包括对所述受试者施用一组合物的一治疗有效量，所述组合物的治疗有效量包括四氢大麻酚酸，其中所述四氢大麻酚酸组成所述组合物中30％的多个有效成分，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的的四氢大麻酚酸的治疗有效量，其中所述述四氢大麻酚酸组成所述组合物中30％的多个有效成分。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述大麻提取物的多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种组合物，包括液相色谱纯化的大麻馏分，所述液相色谱纯化的大麻馏分可通过对大麻提取物进行液相色谱，并通过收集在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个馏分而获得。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种组合物，包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述大麻提取物的多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，所述组合物的特征在于：(1)对癌细胞具有一细胞毒活性；(2)降低细胞中促炎性细胞因子的分泌水平；和/或(3)降低细胞中MMP9和COX2表达的水平。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种包含四氢大麻酚酸和大麻二酚的组合物，其中所述组合物不含大麻环萜酚(Cannabichromene，CBC)、大麻萜酚酸(cannabigerolic acid，CBGA)、大麻二酚酸(cannabidiolic acid，CBDA)、大麻萜酚(cannabigerol,CBG)和/或大麻酚(cannabinol，CBN)中的至少一者。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用如本发明的一些实施例所述的组合物的一治疗有效量，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种如本发明的一些实施例所述的组合物的治疗有效量，所述治疗有效量用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种产生一抗炎组合物的方法，所述方法包括：(1)对一干燥的大麻花序中加入一极性溶剂，以获得一粗提取物；(2)过滤所述粗提取物，以获得一过滤的提取物；(3)在一高压液相色谱上分馏所述过滤的提取物；(4)收集至少一馏分，所述馏分包括在220纳米操作下可被一检测器检测的多个活性成分。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种抗炎组合物，所述抗炎组合物可通过如本发明的一些实施例所述方法获得的。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用如本发明的一些实施例所述的组合物的一治疗有效量，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种如本发明的一些实施例所述的组合物的治疗有效量，所述治疗有效量用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种测定如本发明的一些实施例所述的组合物的一抗炎活性的方法，所述方法包括使一受试者的一发炎组织与所述组合物离体接触，其中所述发炎组织的抗炎反应增加高于一预定阈值表明所述组合物的抗炎活性。
根据本发明的一些实施例，所述组合物包括四氢大麻酚酸(tetrahydrocannabinolic acid，THCA)。
根据本发明的一些实施例，所述组合物包含至少75％的四氢大麻酚酸。
根据本发明的一些实施例，所述组合物包括D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法尼烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者。
根据本发明的一些实施例，所述组合物包括D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法尼烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)。
根据本发明的一些实施例，所述组合物包括表6中所列的至少一种组分。
根据本发明的一些实施例，所述的组合物，其特征在于：(1)对癌细胞具有一细胞毒活性；(2)降低细胞中促炎性细胞因子的分泌水平；和/或(3)降低细胞中MMP9和COX2表达的水平。
根据本发明的一些实施例，所述组合物包括大麻二酚。
根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括对所述受试者施用大麻二酚的一治疗有效量。
根据本发明的一些实施例，所述馏分、四氢大麻酚酸或组合物进一步包括使用大麻二酚的一治疗有效量。
根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括对所述受试者施用CB1受体、CB2受体和/或GPR55的一激动剂。
根据本发明的一些实施例，使用所述馏分、四氢大麻酚酸或组合物进一步包括使用CB1受体、CB2受体和/或GPR55的一激动剂。
根据本发明的一些实施例，所述四氢大麻酚酸包括具有一抗炎活性的一合成四氢大麻酚酸或其类似物。
根据本发明的一些实施例，所述四氢大麻酚酸包括一大麻提取物的一液相色谱馏分，所述馏分包括至少75％的四氢大麻酚酸，其中所述馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分。
根据本发明的一些实施例，所述大麻提取物包括约80至95％的四氢大麻酚酸。
根据本发明的一些实施例，所述一或多个馏分包含D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法尼烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者。
根据本发明的一些实施例，所述馏分或多个馏分包含D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法尼烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)的至少两者。
根据本发明的一些实施例，所述一或多个馏分包括表6中所列的多个组分。
根据本发明的一些实施例，所述大麻二酚包括具有一抗炎活性的一合成大麻二酚或其类似物。
根据本发明的一些实施例，所述炎性疾病是一炎性肠病。
根据本发明的一些实施例，所述液相色谱包括高压液相色谱。
根据本发明的一些实施例，所述液相色谱法在一相反的固定相上进行。
根据本发明的一些实施例，所述液相色谱使用包括10至30％的酸性水溶液和90至70％的醇的一流动相来进行。
根据本发明的一些实施例，所述高压液相色谱包括一固定相，所述固定相包含RP-18封端管柱；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
根据本发明的一些实施例，所述高压液相色谱的多个条件包括一UltiMate3000高压液相色谱系统，结合WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器、一Purospher RP-18封端管柱、一流动相具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
根据本发明的一些实施例，所述检测器是一二极管阵列检测器。
根据本发明的一些实施例，所述至少一馏分包括四氢大麻酚酸。
根据本发明的一些实施例，所述至少一馏分包括至少75％的四氢大麻酚酸。
根据本发明的一些实施例，所述至少一馏分包括D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法尼烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者。
根据本发明的一些实施例，所述至少一馏分包含如表6中所列的多个组分。
根据本发明的一些实施例，所述高压液相色谱包括一固定相，所述固定相包含RP-18封端管柱；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
根据本发明的一些实施例，所述高压液相色谱的多个条件包括一UltiMate3000高压液相色谱系统，结合WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器、一Purospher RP-18封端管柱、一流动相具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
根据本发明的一些实施例，所述检测器是一二极管阵列检测器。
根据本发明的一些实施例，所述发炎组织是一胃肠组织活检体。
根据本发明的一些实施例，所述组合物的抗炎活性包括一抗炎因子的一分泌向上调控和/或一促炎因子的分泌减少。
根据本发明的一些实施例，所述组合物的抗炎活性包括降低与所述炎症相关的一基因的表达。
除非另有定义，否则所有本文使用的技术和/或科学术语与本发明所属领域的通常技术人员所理解的具有相同含义。尽管与本文所描述的类似或相同的方法或材料可以用于实践或测试本发明的实施例，但是仍将示例性的方法和/或材料描述如下。在冲突的情况下，以专利说明书所包含的定义为主。此外材料、方法和实施例仅是用于说明，而非旨在必然性地限制各自实施例。
附图说明
在本文中本发明的一些实施例仅以示例的方式描述，请参考附图。现在详细具体参考附图，需要强调的是所示的细节是以举例的方式，用于说明性地讨论本发明的实施例。在这点上，描述结合附图可使得本领域的技术人员更明了本发明的实施例如何被实施。
图1A至图1D描绘(图1A)通过Alamar Blue荧光(刃天青分析Resazurin assay)测定细胞生存力与细胞数目的关系。将HCT116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞用50纳克/毫升的TNF-α和新鲜的(C2F，0.2毫克/毫升)或烘烤的(C2B，0.2毫克/毫升)大麻花醇提取物、20微摩尔浓度的地塞米松(dexamethasone)处理16小时。接着将细胞与Alamar Blue一起温育4小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的AlamarBlue的自发荧光(n＝3)后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比(图1B)。以HCT116细胞上IL-8的水平测量大麻乙醇提取物0.2毫克/毫升的C2F、0.2毫克/毫升的C2B和20μM的地塞米松的抗炎活性。如图1A中所述接种细胞并进行处理，并使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个值。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。通过Alamar Blue荧光(刃天青分析Resazurin assay)测定(图1C至图1D)新鲜(C2F)花序和烘烤(C2B)花序的大麻乙醇提取物在1毫克/毫升至0.07毫克/毫升的不同稀释范围内对HCT-116结肠癌细胞生存力的剂量效应曲线。将HCT116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞用50纳克/毫升的TNF-α和C2F、C2B处理16小时。接着将细胞与Alamar Blue一起温育4小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的Alamar Blue的自发荧光(n＝3)后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。对于剂量反应测定，数据点通过S形的剂量-反应关系的非线性回归线连接。GraphPad Prism用于产生C2F和C2B的剂量-反应曲线和IC50剂量。
图1E至图1F描绘(图1E)以HCT116细胞上IL-8(纳克/毫升)的水平测量在不同浓度的大麻乙醇鲜花提取物(C2F；114至207微克/毫升)、烘焙花提取物(C2B；114–207微克/毫升)、来自鲜花提取物的F7(HPLC分离的C2F馏分，浓度为114–207微克/毫升)以及200和400μM的地塞米松(Dex)的抗炎活性。将HCT116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞300纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F的大麻乙醇提取物或多个馏分处理4小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。(图1F)使用Alamar Blue荧光(刃天青测定法resazurin assay)测定HCT116细胞的生存力，作为活细胞数的一函数。如图1E中所述接种细胞并进行处理。接下来将细胞与Alamar Blue一起孵育2小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的Alamar Blue的自发荧光(n＝3)后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。值得注意的是HPLC代表高效液相色谱法；HSD代表诚实的显着差异；Dex代表地塞米松；IL代表白介素；TNF-α代表肿瘤坏死因子α；SE代表标准误差；F7代表馏分7。
图1G至图1H描绘(图1G)以HT29细胞上IL-8(纳克/毫升)的水平测量在不同浓度的大麻乙醇鲜花提取物(C2F；114至207微克/毫升)、烘焙花提取物(C2B；114至207微克/毫升)、来自鲜花提取物的F7(HPLC分离的C2F馏分，浓度为114至207微克/毫升)以及200和400μM的地塞米松(Dex)的抗炎活性。将HT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞300纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F的大麻乙醇提取物或多个馏分处理4小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。(图1H)使用Alamar Blue荧光(刃天青测定法resazurin assay)测定HCT116细胞的生存力，作为活细胞数的一函数。如图1G中所述接种细胞并进行处理。接下来将细胞与Alamar Blue一起孵育2小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的Alamar Blue的自发荧光(n＝3)后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图1I至图1J描绘(图1I)以CaCO2细胞上IL-8(纳克/毫升)的水平测量在不同浓度的大麻乙醇鲜花提取物(C2F；114至207微克/毫升)、烘焙花提取物(C2B；114至207微克/毫升)、来自鲜花提取物的F7(HPLC分离的C2F馏分，浓度为114至207微克/毫升)以及200和400μM的地塞米松(Dex)的抗炎活性。将CaCO2细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞300纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F的大麻乙醇提取物或多个馏分处理4小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。(图1J)使用Alamar Blue荧光(刃天青测定法resazurin assay)测定CaCO2细胞的生存力，作为活细胞数的一函数。如图1G中所述接种细胞并进行处理。接下来将细胞与Alamar Blue一起孵育2小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的Alamar Blue的自发荧光(n＝3)后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图2A至图2B描绘C.sativa乙醇提取物的HPLC色谱图。新鲜大麻提取物(图2B，C2F，0.1毫克/毫升)和烘烤过(即在150℃下烘烤3小时的鲜花)的大麻提取物(C2B，0.1毫克/毫升)的色谱图，所述大麻提取物是从等度洗脱(isocratic elution)获得，以含有0.1％乙酸(溶剂A)和85％MeOH(溶剂B)的15％水的混合物，在220纳米下总运行时间为35分钟。以0.58毫克/毫升的浓度注射体积20微升的C2B样品，以0.33毫克/毫升注射20微升体积的C2F样品。
图3A至图3D描绘(图3A)C.sativa乙醇提取物的馏分的HPLC图谱。以含有0.1％乙酸(溶剂A)和85％MeOH(溶剂B)的15％水的混合物等度洗脱得到HPLC曲线，在220纳米下总运行时间为40分钟。以每次循环以0.1毫克粗干燥提取物/每毫升的浓度注射50微升体积的样品。每2分钟收集一次馏分。F1-F9代表九个馏分，其被分离成多个峰值。(图3B)分别来自于大麻新鲜花序的乙醇提取物的馏份F1至F9合并在一起、馏份F1至F9合并在一起-不包括F7、各别的馏份F1至F9(C2F,0.9毫克/毫升)的抗炎活性，在HCT116细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。(图3C)分别来自于大麻新鲜花序的乙醇提取物的馏份F1至F9合并在一起、馏份F1至F9合并在一起-不包括F7、馏份F7(C2F,0.9毫克/毫升)的抗炎活性，于不同的稀释度(a)0.14,(b)0.15以及(c)0.16毫克/毫升，在HCT116细胞上以IL-8水平来测量(ng/mL)。将HCT116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞300纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F的大麻乙醇提取物或多个馏分处理16小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。(图3D)新鲜的大麻花序的乙醇提取物(C2F,0.2毫克/毫升)以及烘烤的大麻花序的乙醇提取物(C2B,0.2毫克/毫升)、25μM的大麻二酚(CBD)和20μM的地塞米松的抗炎活性，在HT29细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将HT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F、C2B的大麻乙醇提取物、CBD或地塞米松处理。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图3E至图3F描绘(图3E)大麻乙醇提取物(C2F；163微克/毫升)、馏份F1至F9合并在一起(浓度为163微克/毫升的C2F的HPLC馏分)、馏份F1至F9合并在一起-不包括F7(浓度为163微克/毫升的C2F的HPLC馏分)、馏份F1至F9(各者浓度为163微克/毫升的C2F的HPLC馏分))的抗炎活性，在HCT 116细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将HCT 116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以300纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F的大麻乙醇提取物或多个馏份处理4小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。(图3F)使用Alamar Blue荧光(刃天青测定法resazurin assay)测定HCT116细胞的生存力，作为活细胞数的一函数。如图3E中所述接种细胞并进行处理。接下来将细胞与Alamar Blue一起孵育2小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的Alamar Blue的自发荧光后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。误差条表示±SEM(n＝3)。*，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.01、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图3G至图3H描绘(图3G)大麻乙醇提取物(C2F；163微克/毫升)、馏份F7于三种不同的浓度(C2F的HPLC馏分在142、163和190微克/毫升的浓度)、馏份F1至F9-不包括F7于两种浓度(C2F的HPLC馏分在163和190微克/毫升的浓度)、馏份F1至F9-不包括F7结合添加各浓度F7的组合的抗炎活性，在HCT 116细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将HCT 116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以300纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F的大麻乙醇提取物或多个馏份处理4小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。(图3H)使用Alamar Blue荧光(刃天青测定法resazurin assay)测定HCT116细胞的生存力，作为活细胞数的一函数。如图3H中所述接种细胞并进行处理。接下来将细胞与Alamar Blue一起孵育2小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的AlamarBlue的自发荧光后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。误差条表示±SEM(n＝3)。*，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图3I至图3J描绘(图3I)不同浓度(16微克/毫克至252微克/毫克)的大麻二酚(CBD)和地塞米松(Dex；200和400μM)的抗炎活性，在HCT 116、HT29或CaCO2细胞上以IL-8水平来测量。将HCT116、HT29或CaCO2细胞以三重复接种在500微升的生长培养基中(每孔50,000个)，并在5％CO2–95％空气中于37℃孵育24小时。将细胞用300纳克/毫升TNF-α和CBD和地塞米松处理4小时，并使用市售试剂盒从上清液中测量IL-8值。相对于TNF-α处理的对照计算多个值(纳克/毫升)。未处理的是未经TNF-α处理的细胞。(图3J)使用Alamar蓝荧光(刃天青测定法resazurin assay)测定HCT116，HT29和CaCO2细胞的生存力与活细胞数量的关系。如(图3I)中所述接种细胞并进行处理。之后将细胞与Alamar Blue一起温育2小时。在544/590纳米的激发/发射下测量相对荧光。在减少无细胞的Alamar Blue的自发荧光后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的细胞对照组(没有TNF-α和处理的细胞)的百分比。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在pdifferent≤0.01，p≤0.001，p≤0.0001上有统计学差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图4描绘C2F、F7和THCA的HPLC图谱。THCA标准品在40ppm(标记为蓝色)，整个C.sativa提取物在0.1毫克/毫升(标记为绿色)，F7在0.04毫克/毫升(标记为红色)的色谱图。所有样品均以20微升的体积注射，并从含有0.1％乙酸(溶剂A)和85％MeOH(溶剂B)的15％水的混合物中等度洗脱而获得，在220纳米下总运行时间为40分钟。
图5描绘来自大麻鲜花乙醇提取物的馏份F7(0.07毫克/毫升)的抗炎活性(所述提取物相应稀释至0.2mM THCA的浓度)、0.2mM THCA和20μM地塞米松，在HCT 116细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将HCT 116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和馏份F7、THCA、地塞米松处理16小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图6描绘纯CBD或20μM地塞米松的抗炎活性，在HCT 116细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将HCT 116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和纯CBD在不同浓度下(2.5、5、7.5、10以及25μM)或地塞米松处理16小时。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图7描绘大麻馏分F7的三种不同浓度(C2F的HPLC馏分，浓度为190微克/毫升)、馏份F1至F9馏分-不包括F7(F1至F9-不包括F7；C2F的HPLC馏分在163微克/毫升的浓度下)、馏份F1至F9-不包括F7结合添加F7的组合的抗炎活性，其具有或没有CB1、CB2和GPR55受体的拮抗剂(浓度为20μM的拮抗剂；CB1、CB1受体拮抗剂rimonabant；CB2、CB2受体拮抗剂SR144528；GPR55、GPR55拮抗剂CID16020046)，在HCT 116细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将HCT 116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和50微升的C2F大麻乙醇提取物的多个馏份处理4小时。可用F7、F1-F9和不含拮抗剂的馏分组合处理作为阳性对照组。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(ng/mL)。
图8描绘大麻新鲜花序乙醇提取物(C2F,0.2毫克/毫升)和馏分F7(0.08毫克/毫升)的抗炎活性，从肠道病(Intestine Bowel Disease，IBD)病人的活检体样品中以IL-6和IL-8水平测量。收取发炎和正常组织的活检体样本并在组织培养基中进行处理，然后用C2F(n＝29)、F7(n＝9)和未处理的对照组(n＝29)处理16小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8和IL-6的多个水平。误差条表示±SEM。*，**，***表示与对照组(TNF-α处理的细胞)相比，数据分别在p≤0.05、p≤0.001、p≤0.0001时具有统计学显着差异。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图9A至图9B描绘COX2和MMP9基因表达。(图9A)HCT116细胞系。将细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α处理隔夜，并在RNA提取之前5小时添加大麻C2F或馏分F7进行处理。(图9B)活检体。将C2F和F7分别以0.2毫克/毫升和0.07毫克/毫升的浓度添加到4例UC患者和1例CD患者活检体中隔夜。提取RNA并进行反转录，然后将基因转录本(gene transcript)的稳态水平值决定为目标基因(COX2或MMP9)与参考基因(GAPDH)之间的比率，以及处理与未处理(NT)的比率，其使用2-ΔΔCT方法。实验以三个生物学重复进行，对于每个重复进行三个技术重复(n＝3)。对于每个检查的处哩，计算三个生物重复的SE。柱状条上方的不同字母表示均值之间存在统计学差异(P<0.01)，其是通过Tukey–Kramer多重比较检验进行的单向方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)。
图10描绘在HT29细胞上以不同浓度的大麻新鲜花序提取物的馏分F7处理的抗炎分析(ELISA)，在HT29细胞上以IL-8水平来测量(纳克/毫升)。将来自大麻新鲜花序的乙醇提取物的馏分F7稀释至80、60、40、30、20、15、10和5微克/毫升。将HCT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和馏分F7处理16小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图11描绘用不同浓度的CBD处理HT29细胞的抗炎分析(ELISA)，以HT29细胞上的IL-8水平测量。将溶解在甲醇中的CBD(浓度为-5mM)稀释至80、60、40、30、20、15、10和5微克/毫升。将HCT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和CBD处理16小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图12描绘用不同浓度的THC处理HT29细胞的抗炎分析(ELISA)，以HT29细胞上的IL-8水平测量。将溶解在甲醇中的THC(浓度为-5mM)稀释至75、50、25和12.5μM/毫升。将HT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和THC处理16小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。误差条表示±SEM(n＝3)。不同字母的级别表示与Tukey的HSD的所有组合显着差异。
图13A至图13C描绘HCT116细胞上的馏分的EC50剂量。(图13A)馏分7(F7)、(图13B)CBD和(图13C)THC。F7、CBD或THC对HCT116结肠癌细胞的IL-8水平的剂量效应曲线。将HCT116细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以50纳克/毫升的TNF-α和F7、CBD或THC处理16小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。对于剂量反应测定，数据点通过S形剂量反应关系的非线性回归线连接。使用GraphPad Prism产生剂量反应曲线和EC50剂量。
图14描绘具有和不具有CBD的F7的EC50剂量，在其对HT29细胞的EC50剂量下。有和没有CBD的F7对HT29结肠癌细胞的IL-8水平的剂量效应曲线。将HT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以300纳克/毫升的TNF-α和F7(以其EC50浓度)具有及不具有多种不同浓度的CBD处理4小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。对于剂量反应测定，数据点通过S形剂量反应关系的非线性回归线连接。使用GraphPad Prism产生剂量反应曲线和EC50剂量。
图15描绘具有和不具有F7的CBD的EC50剂量，在其对HT29细胞的EC50剂量下。有和没有F7的CBD对HT29结肠癌细胞的IL-8水平的剂量效应曲线。将HT29细胞在500微升的生长培养基中以三重复方式接种(每孔50,000个)，并在37℃潮湿的5％CO2-95％空气环境下孵育24小时。将细胞以300纳克/毫升的TNF-α和CBD(以其EC50浓度)具有及不具有多种不同浓度的F7处理4小时。使用商业试剂盒从上清液中测量IL-8的多个水平。相对于TNF-α处理的对照组来计算多个数值(纳克/毫升)。未经处理的是指没有TNF-α和处理的细胞。对于剂量反应测定，数据点通过S形剂量反应关系的非线性回归线连接。使用GraphPad Prism产生剂量反应曲线和EC50剂量。
具体实施方式
在某些实施例中，本发明涉及用于治疗炎性疾病的组合物和方法。
在详细解释本发明的至少一实施例之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于在以下描述中阐述或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例，或者能够以各种方式被实践或执行。
炎性肠病(inflammatory bowel diseases，IBDs)、克罗恩氏病(Crohn'sdisease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)的特征是慢性肠道炎症。大麻的不同制剂已显示出对IBD患者有益的作用。但是大麻提取物包含数百种化合物。
本发明人现已发现大麻花序提取物的液相色谱馏分可有效减轻炎症。
具体地在上皮细胞、结肠细胞和结肠组织上测试大麻花序提取物的抗炎活性。结果表明大麻花序提取物的抗炎活性源自Δ9-四氢大麻酚酸(Δ9-tetrahydrocannabinolicacid，THCA)。大麻极性提取物具有显着的抗炎活性(参见下面实施例部分的实施例1)。对于主要包含THCA的馏分F7也观察到所述活性(参见以下实施例部分的实施例3、5和12)。然而大麻全提取物只有比THCA具有增加的活性(参见以下实施例部分的实施例6)。同样尽管大麻二酚(cannabidiol，CBD)在所检查的测定中仅表现出较小的抗炎活性(参见以下实施例部分的实施例4)，但是当与馏分F7和CBD，或与THCA和CBD联合治疗时，协同活性是明显的(参见以下实施例部分的实施例10)。在取自IBD患者的结肠组织上验证了提取物和活性馏分的活性(馏分F7)(参见以下实施例部分的实施例8)，并显示出其在细胞培养和结肠组织中均抑制了COX2和MMP9基因的表达(参见以下实施例部分的实施9)。因此本发明人提出大麻提取物可以用于治疗炎性疾病。
因此根据本发明的一方面，提供一种产生抗炎组合物的方法，所述方法包括：(1)对一干燥的大麻花序中加入一极性溶剂，以获得一粗提取物；(2)过滤所述粗提取物，以获得一过滤的提取物；(3)在一高压液相色谱上分馏所述过滤的提取物；(4)收集至少一馏分，所述馏分包括在220纳米操作下可被一检测器检测的多个活性成分。
大麻(Cannabis)是大麻科(Cannabaceae)中开花植物的一属，其中包括三种不同的品种：Cannabis sativa,Cannabis indica和Cannabis ruderalis。术语“大麻(Cannabis)”涵盖野生型大麻及其变体，包括大麻化学物质(cannabis chemovars)，其天然地包含不同量的各种大麻素。例如，已经对某些大麻品系进行了选育，以产生高水平或低水平的四氢大麻酚和其他大麻素。因此可以根据本教示使用富含THCA的大麻栽培种(Cannabis cultivars)。
根据一个实施例，所述大麻植物是野生型植物。
根据一个实施例，所述大麻植物是转基因植物。
根据一个实施例，所述大麻植物是基因组编辑的植物。
根据一个实施例，所述大麻植物是C.sativa(C.sativa)。
所述提取物可以来自栽培的大麻植物(即不在其自然栖息地中生长)或可以来自在野外生长的大麻植物。
通常获得提取物的大麻植物组织是花序。因此提取物可以从植物的完整花序获得，包括茎、杆、苞和花。然而应当理解，本发明的大麻提取物可以仅从花序的一部分获得，例如从苞和/或花中获得。
根据一实施例，所述提取物获自新鲜植物(即在提取过程之前未加热的植物)。新鲜植物包括在收获后立即采集的植物(例如最长达一小时或几小时)，以用于提取，以及在收获后立即冷冻的植物(例如在约-70℃至-90℃，例如在-80℃，在提取之前持续任何所需的时间长度)。
根据一个实施例，所述提取物从新鲜花序获得。
根据一个实施例，所述提取物从冷冻花序获得(例如在约-70℃至-90℃，例如在-80℃下收获后立即冷冻任何所需的时间长度)。因此例如所述提取物可以从冷冻保存的花序中获得，或者从在液氮中或在干冰中冷冻的花序获得。
根据一个实施例，所述提取物从未经受加热的花序获得(例如在例如120℃至180℃，例如在150℃下加热，持续任何时间长度，例如1至5个小时)。
根据一个实施例，所述提取物从干燥的大麻花序获得。将所述花序干燥可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过用液氮或用干冰/醇混合物粉碎。
在一些实施例中，极性溶剂包含极性质子溶剂(例如乙醇或甲醇)。在一些实施例中，极性溶剂包含极性非质子溶剂(例如丙酮)。适用于本发明的极性溶剂包括但不限于乙醇、甲醇、正丙醇(n-propanol)、异丙醇(iso-propanol,)、丁醇、戊醇、丙酮、甲乙酮(methylethylketone)、乙酸乙酯(ethylacetate)、乙腈(acetonitrile)、四氢呋喃(tetrahydrofuran)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide)、水及其组合。
在一具体实施例中，极性溶剂是乙醇(例如无水乙醇，即高于99.8％，或在水中为99-70％)。
用于将大麻花序干燥的极性溶剂的浓度或量可以变化。通常干燥的大麻花序与极性溶剂(重量与体积)的比率是足以提取约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％，或约99％以上的具有细胞毒活性的组合物的量。在一些实施例中，极性溶剂与干燥大麻花序的比率为约1：2至约1:20(w/v)，例如约1：4至约1:10(w/v)。
在特定的实施例中，所述提取物是一乙醇提取物。
在特定的实施例中，以1：4(w/v)的样品与无水乙醇的比例将无水乙醇加入干燥的花序中。
在一些实施例中，使干燥的大麻花序与极性溶剂(例如乙醇)接触约15分钟以上的时间、约30分钟以上的时间、约1小时以上的时间、约2小时以上的时间、或约5小时以上的时间。
在接触期间也可以控制温度。在一些实施例中，干燥的大麻花序与极性溶剂在约15℃至约35℃，或约20℃至约25℃的温度下接触。
根据一具体实施例，使干燥的大麻花序与极性溶剂(例如乙醇)接触，同时恒定地混合，例如在一振动器上。
在一些实施例中，本发明的方法包括从所述混合物(即粗提取物)中分离一液体提取物(即过滤的提取物)，所述混合物包括一液体提取物和多种固体。用于将所述液体提取物分离出来(即过滤的提取物)的合适方法包括有机合成领域中已知的方法，包括但不限于重力过滤、抽吸和/或真空过滤，离心，凝固和倾析等。在一些实施例中，所述分离方法包括通过孔径为约1至5微米、约0.5至5微米、约0.1至5微米的多孔膜、注射器、海绵、沸石、纸等过滤液体提取物，约1至2微米、约0.5至2微米、约0.1至2微米、约0.5至1微米、约0.1至1微米、约0.25至0.45微米、或约0.1至0.5微米(例如约2微米、约1微米、约0.45微米或约0.25微米)。
根据一具体实施例，所述粗提取物通过0.45微米注射过滤器来过滤，例如可从德国Darmstadt的Merck商购获得。
本发明人考虑在产物产生后，干燥(即除去极性溶剂)和/或冷冻被过滤的提取物。
将被过滤的提取物干燥(即除去极性溶剂)的方法没有特别限制，可包括在减压(例如低于大气压)和/或高温(例如高于约25℃)下的溶剂蒸发。在一些实施例中，可能难以通过标准溶剂去除程序(例如蒸发)从一液体提取物中完全除去一极性溶剂。在一些实施例中，可以使用诸如共蒸发、冻干等的方法从液体级分中完全除去极性溶剂，以形成干粉、干燥颗粒(dry pellet,dry granulate)、糊状物等。根据具体实施例，用一真空蒸发器蒸发极性溶剂。
在产生过滤的提取物之后，本发明人进一步考虑另外的纯化步骤，以便从所述提取物中进一步纯化多种活性剂。
因此例如本发明人进一步提出分馏所述过滤的提取物。分馏可以通过例如但不限于：管柱色谱、制备高效液相色谱(“HPLC”)、减压蒸馏及其组合的方法进行。根据具体实施例，通过HPLC进行分馏。
在一些实施例中，分馏包括将所述过滤的提取物重新悬浮于一极性溶剂(例如甲醇，如上所述)中，将所述极性提取物应用于一分离管柱，并通过管柱色谱法分离具有细胞毒活性的大麻提取物。
用所述极性提取物将一洗脱溶剂施加到分离管柱上以洗脱来自极性提取物的馏分。适合使用的洗脱溶剂包括但不限于甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、丙酮(acetone)、乙酸(acetic acid)、二氧化碳(carbon dioxide)、甲乙酮(methylethylketone)、乙腈(acetonitrile)、丁腈(butyronitrile)、二氧化碳、乙酸乙酯(ethylacetate)、四氢呋喃(tetrahydrofuran)、二异丙醚(di-iso-propylether)、氨(ammonia)、三乙胺(triethylamine)、N，N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide)、N，N-二甲基乙酰胺(N,N-dimethylacetamide)等以及其组合。
根据替代或另外的实施例，液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。
根据替代或另外的实施例，液相色谱法在相反的固定相上进行。
根据替代或另外的实施例，使用包含10至30％酸性水溶液和90至70％醇的流动相进行液相色谱。
根据具体实施例，一洗脱溶剂包含15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)。
根据替代或另外的实施例，在一HPLC上进行馏分分离，所述HPLC包括一固定相，所述固定相包含RP-18封端管柱(例如250mm×4.6mm，例如从Merck KGaA，Darmstadt，Germany获得)和一保护柱(例如4mm×4mm)；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
根据替代或另外的实施例，收集包含多个组分(活性成分)的级分，通过在220纳米操作的检测器进行检测。
根据替代或另外的实施例，所述检测器是一二极管阵列检测器。
根据替代或另外的实施例，所述检测器是一DAD-300检测器。
根据具体实施例，高压液相色谱(HPLC)的多个条件例如包括一UltiMate3000高压液相色谱系统，结合WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器、PurospherRP-18封端管柱(例如250mm×4.6mm，例如从Merck KGaA，Darmstadt，Germany获得)和一保护柱(例如4mm×4mm)；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
可以测试所述获得的多个提取物和/或馏分的细胞毒活性。
用于测试细胞毒活性的示例性方法在下文以及随后的实施例部分中描述。
为了测试提取物和/或馏分对炎症的作用，可以使用本领域已知的用于测试抗炎活性的任何体内(in-vivo)、体外(in-vitro)或离体(ex-vivo)测定。例如可以使用体外和离体分析，其分析提取物和/或馏分对细胞衍生因子如，IL-8、IL-6、IFN-γ、白三烯B4(leukotriene B4)、一氧化氮、前列腺素、TNF-α和IL-1的影响。对此可以使用普通的ELISA测定法。另外地或替代地，可以使用体外或离体分析，其分析提取物和/或馏分对与细胞中炎症相关的基因表达的影响。此类基因包括但不限于COX2表达(由[24]评述)和MMP9(由[25]评述)。
为了测试提取物和/或馏分对细胞毒活性的影响，可以使用本领域已知的用于测试细胞毒活性的任何体内(in-vivo)、体外(in-vitro)或离体(ex-vitro)分析。例如使用Alamar Blue、XTT生存力测定、细胞分选(例如用于膜联蛋V annexin V)对癌细胞(例如结肠癌细胞)的细胞生存力分析，如下面实施例部分中详细讨论。
本发明的提取物和/或馏分还可以通过多种分析方法表征，例如但不限于光谱方法，例如但不限于紫外-可见光谱(UV-Vis)、红外光谱(IR)等；质谱法(“MS”)，例如但不限于飞行时间质谱法、四极杆质谱法、电喷雾质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离(“MALDI”)等；色谱方法，例如但不限于气相色谱(“GC”)、液相色谱(“LC”)、高效液相色谱(“HPLC”)等；及其组合(例如GC/MS、LC/MS、HPLC/UV-Vis等)，以及本领域普通技术人员已知的其他分析方法。
根据替代或另外的实施例，通过本发明的一些实施例的方法获得的提取物和/或馏分保持冷冻，例如在冰箱中，直至进一步使用(例如在约-20℃至-90℃，在约-70℃至-90℃，例如在-80℃)，持续任何所需的时间长度。
根据替代或另外的实施例，立即使用通过本发明的一些实施例的方法所获得的提取物和/或馏分(例如在几分钟内，例如最高达30分钟)。
通过本发明的一些实施例的方法获得的提取物和/或馏分可以单独使用。可替代地，可以将不同的提取物(例如来自不同植物或来自各自的提取程序)合并在一起。同样地，可以将不同的馏分(来自相同的提取物，来自不同的提取物，来自不同的植物和/或来自单独的提取程序)合并在一起。
如本文所用的术语“合并(pooled)”是指从液相色谱(例如HPLC)收集的单个馏分或多个馏分。
根据一具体实施例，从大麻花序的单一提取物获得多个不同的馏分，其可通过使所述大麻提取物经受液相色谱并收集多个馏分而获得，所述多个馏分包括多种成份在220纳米操作下可被一检测器检测(如上文详细讨论的)。因此例如当使用以下条件时，可以在以下保留时间获得多个馏分：HPLC包括一UltiMate 3000高压液相色谱系统，结合WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器、Purospher RP-18封端管柱；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟：F1-保留时间0至5分钟，F2-保留时间5至9分钟，F3-保留时间9至12分钟，F4-保留时间12至14.5分钟，F5-保留时间18至20，F6-保留时间24至26，F7-保留时间28至35分钟，F8-保留时间35至37，F9-保留时间37至40。
根据替代或另外的实施例，可以将至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或更多个馏分的任何组合汇集在一起，如下面进一步详细讨论。
根据一实施例，一些实施例的馏分包含THCA。
如本文所用，术语“THCA”是指Δ9-四氢大麻酚酸(tetrahydrocannabinolicacid，THCA)，是四氢大麻酚(tetrahydro-cannabinol)(THC)的前体(precursor)。本文所用的术语THCA包括天然THCA(即源自大麻植物)，或其合成类似物或衍生物。可以根据本教导使用任何THCA类似物，只要其包含细胞毒活性(单独或作为本文讨论的组合物的一部分)。
术语“类似物(analog)”是指具有至少相同细胞毒活性的结构衍生物。所述类似物可以是合成的或天然存在的。
示例性THCA类似物包括但不限于11-OH-delta9-THCA-A和11-Nor-delta9-THCA-Acarboxylic acid[详见Guillermo Moreno-Sanzn所著的，四氢大麻酚酸的重要回顾与新型治疗观点Critical Review and Novel Therapeutic Perspectives of D9-tetrahydrocannabinolic acid A，Cannabis and Cannabinoid Research Volume 1.1，(2016)]。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包含至少约75至95％的THCA、至少约80至90％的THCA、至少约80至95％的THCA、至少约约80至100％的THCA或至少约90至100％的THCA。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包含至少约60％的THCA、至少约65％的THCA、至少约70％的THCA、至少约75％的THCA、至少约80％的THCA、至少约81％的THCA、至少约82％的THCA、至少约83％的THCA、至少约84％的THCA、至少约85％的THCA、至少约86％的THCA、至少约87％的THCA、至少约88％的THCA、至少约89％的THCA、至少约90％的THCA、至少约91％的THCA、至少约92％的THCA、至少约93％的THCA、至少约94％的THCA、至少约95％的THCA、至少约96％的THCA、至少约97％的THCA、至少约98％的THCA、至少约99％的THCA、或约100％的THCA。
根据一具体实施例，大麻提取物或馏分包含75％或更多的THCA。
根据一具体实施例，大麻提取物或馏分包含80％或更多的THCA。
根据一具体实施例，大麻提取物或馏分包含85％或更多的THCA。
根据一具体实施例，大麻提取物或馏分包含95％或更多的THCA。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包括除THCA之外的大麻衍生的活性成分。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包括D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包括D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少二者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和大麻萜酚(cannabigerol,CBG)。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包括THCA以及D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的任何一者、二者、三者、四者、五者、六者或七者。
根据替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包括THCA、D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和大麻萜酚(cannabigerol,CBG)。
根据替代或另外的实施例，D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)的任一者可以一合成类似物提供。
根据一替代或另外的实施例，提取物和/或馏分包括下表6中列出的多个组分。
根据替代或另外的实施例，本发明的一些实施例的提取物和/或馏分包括表6中列出的至少何一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或更多组分。
本发明还涉及通过本发明的方法制备的产品。在某些实施例中，提供可通过本发明的某些实施例的方法获得的抗炎组合物。
根据本发明的一方面，提供一种组合物，包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸(处于如上所述的水平)。
根据本发明的一方面，提供一种组合物，包括液相色谱纯化的大麻馏分，所述液相色谱纯化的大麻馏分可通过对大麻提取物进行液相色谱，并通过收集在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个馏分而获得。
根据一种实施例，所述组合物的特征在于：(1)对癌细胞具有一细胞毒活性；(2)降低细胞中促炎性细胞因子的分泌水平；和/或(3)降低细胞(例如发炎的细胞)中MMP9和COX2表达的水平。
根据本发明的一方面，提供一种组合物，包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述大麻提取物的多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，所述组合物的特征在于：(1)对癌细胞具有一细胞毒活性；(2)降低细胞中促炎性细胞因子的分泌水平；和/或(3)降低细胞(例如发炎的细胞)中MMP9和COX2表达的水平。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含THCA(例如作为一活性成分)。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含至少约75至95％THCA，至少约80至90％THCA，至少约80至95％THCA，约80至100％THCA，或至少约90至100％THCA。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含至少约60％THCA，至少约65％THCA，至少约70％THCA，至少约75％THCA，至少约80％THCA，至少约81％THCA，至少约82％THCA，至少约83％THCA，至少约84％THCA，至少约85％THCA，至少约86％THCA，至少约87％THCA，至少约88％THCA，至少约89％THCA，至少约90％THCA，至少约91％THCA，至少约92％THCA，至少约93％THCA，至少约94％THCA，至少约95％THCA，至少约96％THCA，至少约97％THCA，至少约98％THCA，至少大约99％THCA，或大约100％THCA。
根据一具体实施例，所述组合物包含75％或更多的THCA。
根据一具体实施例，所述组合物包含80％或更多的THCA。
根据一具体实施例，所述组合物包含85％或更多的THCA。
根据一具体实施例，所述组合物包含95％或更多的THCA。
在所述组合物本质上不包含所需水平的THCA的情况下，可以向组合物补充THCA(例如如上所述来自合并的馏分、来自THCA合成类似物)。
根据替代或另外的实施例，包含THCA(作为活性成分)的组合物可包含0.1至1000毫克/毫升，0.1至100毫克/毫升，0.1至50毫克/毫升，0.1至10毫克/毫升，0.1至5毫克/毫升，0.1至2.5毫克/毫升，0.1至1毫克/毫升，0.2至2000毫克/毫升，0.2至200毫克/毫升，0.2至20毫克/毫升，0.2至2毫克/毫升，1至1000毫克/毫升，10至100毫克/毫升，10至50毫克/毫升，2至2000毫克/毫升，20至200毫克/毫升，20至100毫克/毫升，例如20至30毫克/毫升或例如0.2至0.7毫克/毫升的一THCA剂量范围。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包括5至100毫克/毫升/克新鲜大麻的THCA，例如20至30毫克/毫升毫克/毫升/克的新鲜大麻。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包括除THCA以外的大麻衍生的活性成分。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者或更多组分。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含THCA以及D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者或更多组分。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含THCA、D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含下表6中所列的组分。
根据替代或另外的实施例，本发明的一些实施例的组合物包含表6中所列的至少一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或更多组分。
根据替代或另外的实施例，本发明的一些实施例的组合物包含THCA以及表6中所列的至少一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或更多组分。
根据替代或另外的实施例，所述组分或组合物中组分的总含量不超过约30％、约20％、约10％或约5％。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含除THCA以外的大麻衍生的多种活性成分。
根据替代或另外的实施例，通过本发明的某些实施例的方法获得的提取物和/或馏分可以补充在提取物/馏分中不存在或在提取物/馏分中不存在的组分(例如增加特定组件的级别)。
根据替代或附加的实施例，所述组合物包含CBD。
如本文所用，术语“CBD”是指大麻二酚(cannabidiol)。本文所用的术语CBD涵盖天然CBD(即源自大麻植物)或其合成类似物或衍生物。根据本发明的教示，可以使用任何CBD类似物，只要它具有抗炎活性(单独或作为本文讨论的组合物的一部分)即可。
示例性的CBD类似物包括但不限于(-)-DMH-CBD-11-oic acid,HU-308(可从Tocris Bioscience，3088商购)、O-1602(可从Tocris Bioscience 2797/10商购)、DMH-CBD(例如可从Tocris Bioscience，1481商购)[如在Burstein S所著的,Bioorg Med Chem.(2015)23(7):1377-85中详细描述]Abn-CBD、HUF-101.CBDV、CBDM、CBND-C5、CBND-C3、6-羟基-CBD-三乙酸酯或CBD-醛-二乙酸酯(6-Hydroxy-CBD-triacetate or CBD-aldehyde-diacetate)[如《大麻二酚的合成和天然衍生物的药物化学概述》An Overview onMedicinal Chemistry of Synthetic and Natural Derivatives of Cannabidiol,Frontiers in Pharmacology,June 2017|Volume 8|Article 422中详细讨论]。
根据本发明的方面，提供了一种包含THCA和CBD的组合物，其中所述组合物不含大麻环萜酚(CBC)。
根据替代或另外的实施例，提供了一种包含THCA和CBD的组合物，其中所述组合物不含大麻环萜酚(Cannabichromene，CBC)、大麻萜酚酸(cannabigerolic acid，CBGA)、大麻二酚酸(cannabidiolic acid，CBDA)、大麻萜酚(cannabigerol，CBG)和/或大麻酚(cannabinol，CBN)中的至少一种。
根据替代或另外的实施例，提供了一种包含THCA和CBD的组合物，其中所述组合物不含大麻环萜酚(Cannabichromene，CBC)、大麻萜酚酸(cannabigerolic acid，CBGA)、大麻二酚酸(cannabidiolic acid，CBDA)、大麻萜酚(cannabigerol，CBG)和/或大麻酚(cannabinol，CBN)。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含THCA、CBD以及D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)中的至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者或更多组分。
根据替代或另外的实施例，所述组合物包含THCA、CBD、D-柠檬烯(D-Limonene)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、α-石竹烯(Humulene)、苹果酸(malic acid)、α-法呢烯(α-Farnesene)、大麻酚(cannabinol，CBN)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC)和/或大麻萜酚(cannabigerol,CBG)。
根据替代或另外的实施例，本发明的一些实施例的所述多种组合物包括THCA、CBD以及表6中列出的至少何一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或更多组分。
根据替代或另外的实施例，所述多种不同组分(例如THCA和CBD)是分散的，即不包含在同一馏分中。
根据替代或另外的实施例，将所述多个馏分合并为一单一组合物。
根据替代或另外的实施例，所述多个馏分包含在多个不同的制剂/组合物中。
根据替代或另外的实施例，包含THCA和CBD(作为活性成分)的组合物可以包含如上所述的THCA的剂量范围。
根据替代或另外的实施例，包含THCA和CBD(作为活性成分)的组合物可以包含0.01至1000mM、0.01至100mM、0.01至10mM、0.01至1mM、0.1至1000mM、0.1至500mM、0.1至100mM、0.1至50mM、0.1至10mM、0.1至5mM、0.1至2.5mM、0.1至1mM、0.5至50mM、0.5至10mM、0.5至5mM，0.5至1mM，例如0.22至0.45mM或0.01至0.03的CBD剂量范围。
由于本发明的提取物、由其衍生的活性馏分和包含其的组合物具有抗炎活性，因此它们可以用于治疗与之有关的疾病或病症。
因此根据本发明的一方面，提供一种在有需要的一受试者中治疗一炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的一些实施例的所述组合物的一治疗有效量，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一方面，提供本发明的一些实施例的所述组合物一治疗有效量，用于治疗有此需要的一受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，包括对所述受试者施用一大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，所述液相色谱馏分的治疗有效量包括至少75％的四氢大麻酚酸，其中所述馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，包括至少75％四氢大麻酚酸，其中所述液相色谱馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分，用于治疗一受试者中的一炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，包括对所述受试者施用一物质组合物，所述物质组合物包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效量，所述多个液相色谱合并馏分的治疗有效量包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效量，包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸，从而治疗一受试者的一炎性疾病。
如本发明人所说明，THCA本身俱有抗炎活性，因此提出可以将THCA直接用于治疗需要它的一受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，包括对所述受试者施用一组合物的一治疗有效量，所述组合物的治疗有效量包括四氢大麻酚酸，其中所述四氢大麻酚酸组成所述组合物中30％的多个有效成分，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的的四氢大麻酚酸的治疗有效量，其中所述述四氢大麻酚酸组成所述组合物中30％的多个有效成分。
根据替代或另外的实施例，THCA构成至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％，约99％或约100％的所述组合物中活性成分。
如本文所用，术语“受试者(subject)”或“需要它的受试者”是指患有炎性疾病的任何年龄或性别的哺乳动物，例如人类受试者。
如本文所用，术语“治疗(treating)”包括消除、本质上地抑制、减慢或逆转病情的进展、本质上改善病情的临床或美学症状、或本质上防止病情的临床或美学症状的出现。
可以使用上文描述的方法来治疗涉及炎症反应的多种疾病和病症。下文总结了此类疾病和状况的例子。
炎性疾病：包括但不限于慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
与超敏反应有关的炎性疾病：
超敏反应的例子包括但不限于I型超敏反应、II型超敏反应、III型超敏反应、IV型超敏反应、立即超敏反应、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。
I型或即刻超敏反应，例如哮喘。
II型超敏反应包括但不限于类风湿性疾病，类风湿性自身免疫性疾病，类风湿性关节炎(Krenn V.等人所著,组织学组织病理Histol Histopathol 2000 Jul；15(3):791)、脊柱炎、强直性脊柱炎(spondylitis,ankylosing spondylitis，Jan Voswinkel等人所著,Arthritis Res 2001；3(3):189)、系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(Erikson J.等人所著,关节炎研究Immunol Res 1998；17(1-2):49)、硬化、全身性硬化(sclerosis,systemic sclerosis，Renaudineau Y.等人所著,临床诊断实验免疫学ClinDiagn Lab Immunol.1999 Mar；6(2):156)；Chan OT.等人所著,免疫回顾Immunol Rev1999 Jun；169:107)、腺体疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺自身免疫性疾病、糖尿病、I型糖尿病(Zimmet P.所著糖尿病研究临床实施Diabetes Res Clin Pract1996 Oct；34Suppl:S125)、甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Graves’disease，Orgiazzi J.所著内分泌代谢临床北美期刊Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun；29(2):339)甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H.和Yu S,J Immunol 2000 Dec 15；165(12):7262)桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，Toyoda N.等人所著,NipponRinsho 1999 Aug；57(8):1810)、粘液水肿、特发性粘液水肿(myxedema、idiopathicmyxedema，Mitsuma T.Nippon Rinsho.所著1999 Aug；57(8):1759)、自身免疫性生殖疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫(Garza KM.等人所著,J Reprod Immunol 1998 Feb；37(2):87)、自身免疫抗精子不育(Diekman AB.等人所著,Am J Reprod Immunol.2000 Mar；43(3):134)、反复胎儿流产(Tincani A.等人所著,Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)、神经退行性疾病、神经退行性疾病、神经系统疾病、神经系统自身免疫性疾病、多发性硬化症(CrossAH.等人所著,J Neuroimmunol 2001 Jan 1；112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病(Oron L.等人所著,J Neural Transm Suppl.1997；49:77)、重症肌无力(myasthenia gravis，InfanteAJ.And Kraig E所著Int Rev Immunol 1999；18(1-2):83)、运动神经病(motorneuropathies，Kornberg AJ.所著，临床神经科学期刊J Clin Neurosci.2000 May；7(3):191)、格林巴利综合征、神经病变和自身免疫性神经病变(Guillain-Barre syndrome,neuropathies and autoimmune neuropathies，Kusunoki S.所著，美国临床医学科学期刊Am J Med Sci.2000 Apr；319(4):234)、肌无力疾病，朗伯-伊顿肌无力综合征(myasthenicdiseases,Lambert-Eaton myasthenic syndrome，Takamori M.所著美国临床医学科学期刊Am J Med Sci.2000 Apr；319(4):204),副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩、非副肿瘤性硬汉综合征、小脑萎缩症、进行性小脑萎缩症、脑炎、拉斯穆森氏脑炎、肌萎缩性侧索硬化症、赛德汉姆氏菌病、多发性多发性硬化症、吉尔斯·德·拉图雷特病(paraneoplastic neurological diseases,cerebellar atrophy,paraneoplasticcerebellar atrophy,non-paraneoplastic stiff man syndrome,cerebellaratrophies,progressive cerebellar atrophies,encephalitis,Rasmussen’sencephalitis,amyotrophic lateral sclerosis,Sydeham chorea,Gilles de laTourette syndrome,polyendocrinopathies,autoimmune polyendocrinopathies，Antoine JC.and Honnorat所著神经学回顾期刊J.Rev Neurol(Paris)2000 Jan；156(1):23)、神经病变、免疫异常神经病变(neuropathies,dysimmune neuropathies，Nobile-Orazio E.等人所著,脑电图临床神经生理素补充Electroencephalogr ClinNeurophysiol Suppl 1999；50:419)、神经性肌强直、获得性神经性肌强直、多发性先天性关节炎(neuromyotonia,acquired neuromyotonia,arthrogryposis multiplexcongenita，Vincent A.等人所著,Ann N Y Acad Sci.1998 May 13；841:482)、心血管疾病、心血管自身免疫性疾病、动脉粥样硬化(cardiovascular diseases,cardiovascularautoimmune diseases,atherosclerosis，Matsuura E.等人所著,Lupus.1998；7 Suppl 2:S135)、心肌梗塞(Vaarala O.Lupus.所著1998；7 Suppl 2:S132)、血栓形成(Tincani A.等人所著,Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)、肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病、动脉炎、高津动脉炎和川崎综合征(granulomatosis,Wegener’s granulomatosis,arteritis,Takayasu’sarteritis and Kawasaki syndrome，Praprotnik S.等人所著,Wien Klin Wochenschr2000 Aug 25；112(15-16):660)；抗VIII因子自身免疫病anti-factor VIII autoimmunedisease，Lacroix-Desmazes S.等人所著,Semin Thromb Hemost.2000；26(2):157)、血管炎、坏死性小血管性血管炎、微观多发性血管炎、Churg和Strauss综合征、肾小球肾炎、低免疫性局灶性坏死性肾小球肾炎、新月型肾小球肾炎(vasculitises,necrotizing smallvessel vasculitises,microscopic polyangiitis,Churg and Strauss syndrome,glomerulonephritis,pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis,crescentic glomerulonephritis，Noel LH.Ann Med Interne(Paris).2000 May；151(3):178)、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，Flamholz R.等人所著,J ClinApheresis 1999；14(4):171)、心力衰竭、心力衰竭中激动剂样β-肾上腺素受体抗体(heartfailure,agonist-like-beta-adrenoceptor antibodies in heart failure，WallukatG.等人所著,Am J Cardiol.1999 Jun 17；83(12A):75H)、血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura，Moccia F.Ann Ital Med Int.1999 Apr-Jun；14(2):114)、溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血(hemolytic anemia,autoimmune hemolytic anemia，Efremov DG.等人所著,白细胞淋巴瘤Leuk Lymphoma 1998 Jan；28(3-4):285)、胃肠道疾病、胃肠道自身免疫性疾病、肠道疾病、慢性炎性肠道疾病(gastrointestinal diseases,autoimmune diseases of the gastrointestinal tract,intestinal diseases,chronicinflammatory intestinal disease，Garcia Herola A.等人所著,胃肠肝病学Gastroenterol Hepatol.2000 Jan；23(1):16),乳糜泻(celiac disease，Landau YE.andShoenfeld Y.Harefuah 2000 Jan 16；138(2):122)、肌肉组织自身免疫性疾病、肌炎、自身免疫性肌炎、干燥综合征(autoimmune diseases of the musculature,myositis,autoimmune myositis,Sjogren’s syndrome，Feist E.等人所著，国际过敏免疫学IntArch Allergy Immunol 2000 Sep；123(1):92)、平滑肌自身免疫病(smooth muscleautoimmune disease，Zauli D.等人所著,生物医学药剂学Biomed Pharmacother 1999Jun；53(5-6):234)、肝病、肝自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎(hepatic diseases,hepatic autoimmune diseases,autoimmune hepatitis，Manns MP.J Hepatol 2000 Aug；33(2):326)以及原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，Strassburg CP.等人所著,Eur J Gastroenterol Hepatol.1999 Jun；11(6):595)。
IV型或T细胞介导的超敏反应包括但不限类风湿疾病、类风湿关节炎(rheumatoiddiseases,rheumatoid arthritis，Tisch R,McDevitt HO.Proc Natl Acad Sci U S A1994 Jan 18；91(2):437)、系统性疾病，系统性自身免疫性疾病，系统性红斑狼疮(systemic diseases,systemic autoimmune diseases,systemic lupus erythematosus，Datta SK.,Lupus所著1998；7(9):591)、腺体疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺疾病、胰腺自身免疫性疾病、1型糖尿病(glandular diseases,glandular autoimmune diseases,pancreatic diseases,pancreatic autoimmune diseases,Type 1 diabetes，CastanoL.and Eisenbarth GS.所著，免疫学回顾年刊Ann.Rev.Immunol.8:647)、甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(thyroid diseases,autoimmune thyroid diseases,Graves’disease，Sakata S.等人所著,Mol Cell Endocrinol 1993 Mar；92(1):77)；ovarian diseases(Garza KM.等人所著,J Reprod Immunol 1998 Feb；37(2):87)、前列腺炎、自身免疫性前列腺炎(prostatitis,autoimmune prostatitis，Alexander RB.等人所著,Urology 1997 Dec；50(6):893)、多腺综合征、自身免疫性多腺综合征、I型自身免疫性多腺综合征(polyglandular syndrome,autoimmune polyglandular syndrome,Type Iautoimmune polyglandular syndrome，Hara T.等人所著,Blood.1991 Mar 1；77(5):1127)、神经系统疾病、自身免疫性神经系统疾病、多发性硬化症、神经炎、视神经炎(neurological diseases,autoimmune neurological diseases,multiple sclerosis,neuritis,optic neuritis，Soderstrom M.等人所著,J Neurol Neurosurg Psychiatry1994 May；57(5):544)、重症肌无力(myasthenia gravis，Oshima M.等人所著,Eur JImmunol 1990 Dec；20(12):2563)、僵人综合征(stiff-man syndrome，Hiemstra HS.等人所著,Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Mar 27；98(7):3988)、心血管疾病、恰加斯病的心脏自身免疫(cardiovascular diseases,cardiac autoimmunity in Chagas’disease，Cunha-Neto E.等人所著,J Clin Invest 1996 Oct 15；98(8):1709),自身免疫性血小板减少性紫癜(autoimmune thrombocytopenic purpura，Semple JW.等人所著,Blood 1996May 15；87(10):4245)、抗辅助性T淋巴细胞自身免疫(anti-helper T lymphocyteautoimmunity，Caporossi AP.等人所著,Viral Immunol 1998；11(1):9)、溶血性贫血(hemolytic anemia，Sallah S.等人所著,Ann Hematol 1997 Mar；74(3):139)、肝病、肝自身免疫性疾病、肝炎、慢性活动性肝炎(hepatic diseases,hepatic autoimmunediseases,hepatitis,chronic active hepatitis，Franco A.等人所著,Clin ImmunolImmunopathol 1990 Mar；54(3):382)、胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(biliarycirrhosis,primary biliary cirrhosis，Jones DE.Clin Sci(Colch)1996 Nov；91(5):551)、肾病、肾自身免疫病、肾炎、间质性肾炎(nephric diseases,nephric autoimmunediseases,nephritis,interstitial nephritis，Kelly CJ.J Am Soc Nephrol 1990 Aug；1(2):140)、缔组织疾病、耳部疾病、自身免疫性结缔组织疾病、自身免疫性耳部疾病(connective tissue diseases,ear diseases,autoimmune connective tissuediseases,autoimmune ear disease，Yoo TJ.等人所著,Cell Immunol 1994 Aug；157(1):249)、内耳疾病(disease of the inner ear，Gloddek B.等人所著,Ann N Y Acad Sci1997 Dec 29；830:266)、皮肤病、皮肤病、皮肤病、大疱性皮肤病、寻常型天疱疮、大疱性天疱疮和叶天疱疮(skin diseases,cutaneous diseases,dermal diseases,bullous skindiseases,pemphigus vulgaris,bullous pemphigoid and pemphigus foliaceus)。
迟发型超敏反应的例子包括但不限于接触性皮炎和药疹。
介导超敏反应的T淋巴细胞类型的实例包括但不限于辅助T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞。
辅助T淋巴细胞介导的超敏反应的例子包括但不限于Th1淋巴细胞介导的超敏反应和Th2淋巴细胞介导的超敏反应。
自身免疫性疾病：
包括但不限于心血管疾病、类风湿性疾病、腺体疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、肝病、神经病、肌肉疾病、肾病、与生殖有关的疾病、结缔组织疾病和全身性疾病。
自身免疫性心血管疾病的例子包括但不限于动脉粥样硬化，atherosclerosis，Matsuura E.等人所著,Lupus.1998；7 Suppl 2:S135)、心肌梗塞(myocardialinfarction，Vaarala O.Lupus.1998；7 Suppl 2:S132)、血栓形成(thrombosis，TincaniA.等人所著,Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)、韦格纳肉芽肿病、高安动脉炎、川崎综合征(Wegener’s granulomatosis,Takayasu’s arteritis,Kawasaki syndrome，PraprotnikS.等人所著,Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25；112，15-16):660)、抗VIII因子自身免疫病(anti-factor VIII autoimmune disease，Lacroix-Desmazes S.等人所著,SeminThromb Hemost.2000；26(2):157)、坏死性小血管血管炎、显微多发性血管炎、Churg和Strauss综合征、免疫性局部坏死性坏死和新月型肾小球肾(necrotizing small vesselvasculitis,microscopic polyangiitis,Churg and Strauss syndrome,pauci-immunefocal necrotizing and crescentic glomerulonephritis，Noel LH.Ann Med Interne(Paris).2000 May；151(3):178)、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，FlamholzR.等人所著,J Clin Apheresis 1999；14(4):171)、抗体诱发的心力衰竭(antibody-induced heart failure，Wallukat G.等人所著,Am J Cardiol.1999 Jun 17；83，12A):75H)、血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura，Moccia F.Ann Ital Med Int.1999Apr-Jun；14(2):114；Semple JW.等人所著,Blood 1996 May 15；87(10):4245)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia，Efremov DG.等人所著,Leuk Lymphoma1998 Jan；28(3-4):285；Sallah S.等人所著,Ann Hematol 1997 Mar；74(3):139)、恰加斯病的心脏自身免疫(cardiac autoimmunity in Chagas’disease，Cunha-Neto E.等人所著,J Clin Invest 1996 Oct 15；98(8):1709)、抗辅助性T淋巴细胞自身免疫(anti-helper T lymphocyte autoimmunity，Caporossi AP.等人所著,Viral Immunol 1998；11(1):9)。
自身免疫性风湿性疾病的例子包括但不限于类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，Krenn V.等人所著,Histol Histopathol 2000 Jul；15(3):791；Tisch R,McDevitt HO.Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18；91，2):437)以及强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，Jan Voswinkel等人所著,Arthritis Res 2001；3(3):189)。
自身免疫性腺疾病的例子包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯病(Graves’disease)、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、特发性粘液水肿(idiopathic myxedema)、卵巢自身免疫性疾病(ovarian autoimmunity)、自身免疫性抗精子不育症(autoimmune anti-sperminfertility)、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺综合征。疾病包括但不限于胰腺自身免疫性疾病(autoimmune diseases of the pancreas,Type 1 diabetes，CastanoL.and Eisenbarth GS.Ann.Rev.Immunol.8:647；Zimmet P.Diabetes Res Clin Pract1996 Oct；34 Suppl:S125)、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(autoimmune thyroiddiseases,Graves’disease，Orgiazzi J.Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun；29，2):339；Sakata S.等人所著,Mol Cell Endocrinol 1993 Mar；92(1):77)、自发性自身免疫性甲状腺炎(spontaneous autoimmune thyroiditis，Braley-Mullen H.and Yu S,JImmunol 2000 Dec 15；165(12):7262)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，ToyodaN.等人所著,Nippon Rinsho 1999 Aug；57(8):1810),idiopathic myxedema，MitsumaT.Nippon Rinsho.1999 Aug；57(8):1759)、卵巢自身免疫(ovarian autoimmunity，GarzaKM.等人所著,J Reprod Immunol 1998 Feb；37(2):87)、自身免疫抗精子不育(autoimmuneanti-sperm infertility，Diekman AB.等人所著,Am J Reprod Immunol.2000 Mar；43(3):134)、自身免疫性前列腺炎(autoimmune prostatitis，Alexander RB.等人所著,Urology 1997 Dec；50(6):893)、I型自身免疫性多腺综合征(Type I autoimmunepolyglandular syndrome，Hara T.等人所著,Blood.1991 Mar 1；77(5):1127)。
自身免疫性胃肠疾病的实例包括但不限于慢性炎性肠疾病(chronicinflammatory intestinal diseases，Garcia Herola A.等人所著,GastroenterolHepatol.2000 Jan；23(1):16)、腹腔疾病(celiac disease，Landau YE.and ShoenfeldY.Harefuah 2000 Jan 16；138(2):122)、结肠炎、回肠炎和克罗恩氏病(colitis,ileitisand Crohn’s disease)。
自身免疫性皮肤病的例子包括但不限于自身免疫性大疱性皮肤病(autoimmunebullous skin diseases)，例如但不限于寻常性天疱疮、大疱性天疱疮和叶天疱疮(pemphigus vulgaris,bullous pemphigoid and pemphigus foliaceus)。
自身免疫性肝病的例子包括但不限于肝炎，自身免疫性慢性活动性肝炎(hepatitis,autoimmune chronic active hepatitis，Franco A.等人所著,Clin ImmunolImmunopathol 1990 Mar；54(3):382)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis(Jones DE.Clin Sci(Colch)1996 Nov；91(5):551；Strassburg CP.等人所著,Eur JGastroenterol Hepatol.1999 Jun；11(6):595)以及自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis，Manns MP.J Hepatol 2000 Aug；33(2):326)。
自身免疫性神经疾病的例子包括但不限于多发性硬化症(multiple sclerosis，Cross AH.等人所著,J Neuroimmunol 2001 Jan 1；112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，Oron L.等人所著,J Neural Transm Suppl.1997；49:77)、重症肌无力(myasthenia gravis，Infante AJ.And Kraig E,Int Rev Immunol 1999；18(1-2):83；Oshima M.等人所著,Eur J Immunol 1990 Dec；20(12):2563)、神经病变、运动神经病变(neuropathies、motor neuropathies，Kornberg AJ.J Clin Neurosci.2000 May；7(3):191)、格林巴利综合征和自身免疫性神经病(Guillain-Barre syndrome and autoimmuneneuropathies，Kusunoki S.Am J Med Sci.2000 Apr；319(4):234)、重症肌无力、朗伯-伊顿肌无力综合征(myasthenia,Lambert-Eaton myasthenic syndrome，Takamori M.Am JMed Sci.2000 Apr；319(4):204)、副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵硬综合症(paraneoplastic neurological diseases,cerebellar atrophy,paraneoplastic cerebellar atrophy and stiff-man syndrome，Hiemstra HS.等人所著,Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27；98(7):3988)、非副肿瘤性硬汉综合症、进行性小脑萎缩症、脑炎、拉斯穆森氏脑炎、肌萎缩性侧索硬化症、Sydeham舞蹈病、Gillesde la Tourette综合征和自身免疫性多发性内分泌病(non-paraneoplastic stiff mansyndrome,progressive cerebellar atrophies,encephalitis,Rasmussen’sencephalitis,amyotrophic lateral sclerosis,Sydeham chorea,Gilles de laTourette syndrome and autoimmune polyendocrinopathies，Antoine JC.and HonnoratJ.Rev Neurol(Paris)2000 Jan；156(1):23)、免疫功能低下的神经病(dysimmuneneuropathies，Nobile-Orazio E.等人所著,Electroencephalogr Clin NeurophysiolSuppl 1999；50:419)、获得性神经强直、多发性先天性关节炎(acquired neuromyotonia,arthrogryposis multiplex congenita，Vincent A.等人所著,Ann N Y Acad Sci.1998May 13；841:482)、神经炎、视神经炎(neuritis,optic neuritis，Soderstrom M.等人所著,J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May；57(5):544)以及神经退行性疾病(neurodegenerative diseases).
自身免疫性肌肉疾病的例子包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原发性干燥综合征(myositis、autoimmune myositis and primary Sjogren’s syndrome，Feist E.等人所著,Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep；123(1):92)以及平滑肌自身免疫病(smoothmuscle autoimmune disease，Zauli D.等人所著,Biomed Pharmacother 1999 Jun；53(5-6):234)。
自身免疫性肾病的例子包括但不限于肾炎和自身免疫性间质性肾炎(nephritisand autoimmune interstitial nephritis，Kelly CJ.J Am Soc Nephrol 1990 Aug；1(2):140).
与生殖有关的自身免疫性疾病的例子包括但不限于反复胎儿丢失(repeatedfetal loss，Tincani A.等人所著,Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)。
自身免疫性结缔组织疾病的例子包括但不限于耳部疾病、自身免疫性耳部疾病(ear diseases,autoimmune ear diseases，Yoo TJ.等人所著,Cell Immunol 1994 Aug；157(1):249)和内耳自身免疫性疾病(Gloddek B.等人所著,Ann N Y Acad Sci 1997 Dec29；830:266)。
自身免疫性系统疾病的例子包括但不限于系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，Erikson J.等人所著,Immunol Res 1998；17(1-2):49)以及系统性硬化(systemic sclerosis，Renaudineau Y.等人所著,Clin Diagn Lab Immunol.1999 Mar；6(2):156)；Chan OT.等人所著,Immunol Rev 1999 Jun；169:107)。
传染性疾病：
传染病的例子包括但不限于慢性传染病、亚急性传染病、急性传染病、病毒病、细菌病、原生动物病、寄生虫病、真菌病、支原体病(mycoplasma diseases)和病毒病。
移植排斥反应疾病：
与移植物移植有关的疾病的例子包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥以及移植物抗宿主病。
过敏性疾病：
过敏性疾病的例子包括但不限于哮喘、荨麻疹、(hives,urticaria)、花粉过敏、尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、乳胶过敏、化学过敏、药物过敏、昆虫叮咬过敏、动物皮屑过敏、螫刺植物过敏、常春藤过敏和食物过敏。
根据具体的实施例，所述炎性疾病是炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBDs)。根据特定的实施例，IBD是克罗恩氏病(Crohn's disease，CD)或溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)。
根据一些实施例，所述方法还包括向受试者施用一治疗有效量的大麻二酚(cannabidiol，CBD)。
根据一些实施例，所使用的一或多个馏分、THCA或组合物还包括使用一治疗有效量的大麻二酚(CBD)。
根据一种实施例，CBD可以在本发明的一些实施例的所述组合物的施用之前、同时或之后施用。
根据一些实施例，所述方法进一步包括对所述受试者施用CB1受体、CB2受体和/或GPR55的激动剂。
根据一些实施例，所使用的一或多个馏分、THCA或组合物还包括CB1受体、CB2受体和/或GPR55的激动剂的用途。
根据本教导，可以使用任何已知的CB1受体、CB2受体和/或GPR55激动剂。根据一种实施例，CB1受体的激动剂包括例如萘必隆(nabilone)、WIN55、212-2、HU210和anandamide。根据一种实施例，CB2受体的激动剂例如包括AM1241、GW405833、JWH133和WIN 55、212-2。根据一实施例，GPR55受体的激动剂例如包括2-花生四烯酰基甘油磷酸肌醇(2-arachidonoyl-glycerolphosphoinositol)。
根据一种实施例，CB1受体、CB2受体和/或GPR55的激动剂可以在本发明的一些实施例的组合物的施用之前、同时或之后施用。
可以将上述各种组合物本身或还包括生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物的一部分施用于一个体。药物组合物的目的是促进将活性成分给予一生物体。
如本文所使用的“药物组合物”是指本文所述化合物的制备物，与其它化学组分例如药学上可接受的及适合的载体和赋形剂(carriers and excipients)。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物体。
本文中术语“活性成分”是指大麻衍生的活性成分，其负责生物学效应。
下文中，术语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指一载体或稀释剂对生物体不会引起显着刺激，且不会消除所施用化合物的生物学活性和特性。这些短语包括佐剂(adjuvant)。
此处的“赋形剂(excipient)”是指加入到药物组合物中以进一步促进施用一化合物的惰性物质。赋形剂的非限制性实施例包括碳酸钙(calcium carbonate)，磷酸钙(calcium phosphate)，各种糖和各种类型的淀粉(starch)，纤维素衍生物(cellulosederivatives)，明胶(gelatin)，植物油和聚乙二醇(poly-ethylene glycols)。
可以在“雷明顿的制药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”Mack出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，latest edition)发现用于配制和施用药物的技术，在此引入作为参考。
合适的给药途径可以包括例如口服、直肠、经粘膜、特别是经鼻、、肠或肠胃外给药，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右心室腔或左心室腔，进入冠状动脉、静脉注射、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于向中枢神经系统(CNS)递送药物的常规方法包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内输注)、所述试剂的分子操作(例如，嵌合融合蛋白的产生，其包含对内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽以及本身不能穿过BBB的试剂)以试图利用其中一种脑血屏障(BBB)的内源转运途径；设计用于增加药剂脂质溶解度的药理学策略(例如，水溶性药剂与脂质或胆固醇载体的结合)；通过高渗性破坏(由甘露醇(mannitol)溶液注入颈动脉或使用生物活性所引起，如血管紧张素肽(angiotensin peptide))对BBB完整性的短暂破坏。然而这些策略中的每一种都具有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险，内源性转运系统固有的限制所施加的尺寸限制，与包含的嵌合分子的全身施用相关的潜在不期望的生物学副作用，所述嵌合分子的载体部分可能在CNS外活跃，以及在BBB被破坏的脑区域内可能存在脑损伤的风险，这使得它成为次优选的递送方法。
可替代地，可以以局部而非全身的方式施用药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中。
术语“组织”是指生物体的一部分，由用于执行一种或多种功能的细胞所组成。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明的一些实施例的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。
因此使用于根据本发明的一些实施例的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂(excipients)和助剂(auxiliaries)，其有助于将活性成分加工成可以药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的给药途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中，例如Hank溶液，Ringer溶液或生理盐缓冲液。对于渗透粘膜给药，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。这些载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，供患者口服摄入。口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethyl-cellulose)、羧甲基纤维素钠(sodiumcarbomethylcellulose)；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，可以加入崩解剂(disintegrating agents)，例如交联聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、琼脂或海藻酸(alginic acid)或其盐，例如海藻酸钠(sodium alginate)。
糖衣丸芯具有合适的涂层。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶(gum arabic)、滑石(talc)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇(polyethylene glycol,)、二氧化钛(titanium dioxide)、漆溶液(lacquer solutions)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入式胶囊(push-fit capsule)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)和任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外可以添加稳定剂。用于口服给药的所有制剂应该是适合于所选择的给药途径的剂量。
对于经皮给药，所述组合物可以配制成凝胶、乳膏、软膏、糊剂、乳液、乳汁、悬浮液、气溶胶、喷雾剂、泡沫、血清、棉签(swab)、拭子(pledget)、垫片(pad)或贴片(patch)。用于经皮递送的制剂通常可包括载体，例如水，液体醇、液体二醇(liquid glycols)、液体聚亚烷基二醇(liquid polyalkylene glycols)、液体酯(liquid esters)、液体酰胺(liquidamides)、液体蛋白质水解产物、液体烷基化蛋白质水解产物、液体羊毛脂(liquidlanolin)、羊毛脂衍生物(lanolin derivatives)、甘油、矿物油、硅胶、凡士林(petroleumjelly)、羊毛脂(lanolin)、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯(parabens)、蜡等材料通常用于局部组合物中。本领域技术人员已知的各种添加剂可包括在本发明的经皮制剂中。例如溶剂可用于溶解某些活性成分物质。其他任选的添加剂包括皮肤渗透增强剂、遮光剂、抗氧化剂、胶凝剂、增稠剂、稳定剂等。
对于口腔(buccal)给药，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂(lozenges)的形式。
对于鼻吸入给药，根据本发明的一些实施例使用的活性成分可方便地以加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾(aerosol spray)形式递送，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷(dichlorodifluoromethane)、三氯氟甲烷(trichlorofluoromethane)、二氯四氟乙烷(dichloro-tetrafluoroethane)或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门来递送被测量的量来确定。可以配制用于分配器(dispenser)的胶囊和药筒(例如明胶)，其含有所述化合物和合适的粉末基质的粉末混合物，如乳糖或淀粉。
本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿(ampoules)中或在多剂量容器中，任选地，添加的防腐剂。所述组合物可以是油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水溶液。另外活性成分的悬浮液可以制备成适当的油性或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油(sesame oil))或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯(ethyl oleate)、甘油三酯(triglycerides)或脂质体(liposomes))。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose)、山梨糖醇(sorbitol)或葡聚醣(dextran)。
任选地，所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。
可替代地，所述活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌、无热原的水基溶液)构建。
本发明的一些实施例的药物组合物也可以配制成多种直肠组合物，例如栓剂(suppositories)或滞留灌肠剂(retention enemas)，例如使用常规的栓剂基质，如可可脂(cocoa butter)或其它甘油酯。
适用于本发明一些实施例的药物组合物包括多个组合物，其中含有有效量的活性成分以达到预期目的。更具体地，所述治疗有效量是指多种活性成分的一剂量(大麻来源的活性成分)，其有效预防、缓解或改善病症(例如IBD)症状或延长所治疗对象生存。
一治疗有效量的决定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文所提供的详细揭露内容。
对于本发明方法中使用的任何制剂，最初可以从体外和细胞培养测定中估计治疗有效量或剂量。例如可以在动物模型中配制剂量以达到所需的浓度或滴度。这些信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。
用于炎症的动物模型例如描述于Webb DR所著的生物化学药物学,BiochemPharmacol.(2014)87(1):121-30。
根据一实施例，一组合物的一治疗有效量包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述多个液相色谱合并馏分的治疗有效量包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸(THCA)，其范围为0.1至1000毫克/日/公斤、0.1至100毫克/日/公斤、0.1至50毫克/日/公斤、0.1至10毫克/日/公斤、0.1至5毫克/日/公斤、0.1至2.5毫克/日/公斤、0.1至1毫克/日/公斤、0.2至1.5毫克/日/公斤、0.2至0.7毫克/日/公斤、例如0.7毫克/日/公斤。
根据一实施例，一组合物的一治疗有效量包括一大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，所述液相色谱馏分的治疗有效量包括至少30％THCA(例如60至100％THCA，例如75％THCA)，其中所述馏分包括除四氢大麻酚酸(THCA)之外的大麻衍生的活性成分，其范围为0.1至1000毫克/日/公斤、0.1至500毫克/日/公斤、0.1至100毫克/日/公斤、0.1至50毫克/日/公斤、0.1至10毫克/日/公斤、0.1至5毫克/日/公斤、0.1至2.5毫克/日/公斤、0.1至1毫克/日/公斤、0.2至1.5毫克/日/公斤、0.2至0.7毫克/日/公斤、例如0.7毫克/日/公斤。
如上所述，当与CBD一起施用上述组合物时，已经观察到协同的抗炎作用。
因此当将CBD与包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的组合物一起施用时(其中所述大麻提取物的多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，所述活性成分包含THCA)，则一治疗有效量取决于CBD对于所述组合物的关系。
类似地因此当将CBD与包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效剂量的组合物一起施用时(其中所述多个液相色谱合并馏分的治疗有效剂量包括至少约30％的THCA(例如60至100％的THCA、例如75％的THCA)，所述馏分包括除四氢大麻酚酸(THCA)之外的大麻衍生的活性成分)，则一治疗有效量取决于CBD与所述组合物的关系。
根据一实施例，可以以0.1至1000mM/日/公斤、0.1至500mM/日/公斤、0.1至100mM/日/公斤、0.1至50mM/日/公斤、0.1至10mM/日/公斤、0.1至5mM/日/公斤、0.1至2.5mM/日/公斤、0.1至1mM/日/公斤、0.5至50mM/日/公斤、0.5至10mM/日/公斤、0.5至5mM/日/公斤、0.5至1mM/日/公斤、例如0.22至0.45mM/日/公斤的剂量范围施用CBD。
因此根据一实施例，当以0.7毫克/天/公斤的剂量(其中所述多个活性成分包含THCA)施用组合物时，以0.45mM/天/公斤的剂量施用CBD，即以1.5：1的比例施用(组合物：CBD)。
根据一实施例，当以0.7毫克/天/公斤的剂量(其中所述多个活性成分包含THCA)施用组合物时，以0.22mM/天/公斤的剂量，即以3:1的关系施用(组合物：CBD)。只要维持组合物：CBD的关系，就可以调节此剂量。
根据一实施例，当以0.4mM/天/公斤的剂量施用CBD时，以0.4毫克/天/公斤的剂量施用组合物，即以1：1的比例施用(CBD：组合物)。
根据一实施例，当以0.4mM/天/公斤的剂量施用CBD时，以0.3毫克/天/公斤的剂量施用组合物，即以1.33：1的比例施用(CBD：组合物)。
根据一实施例，当以0.4mM/天/公斤的剂量施用CBD时，以0.2毫克/天/公斤的剂量施用组合物，即以2：1的比例施用(CBD：组合物)。
只要如上所述维持组合物：CBD的关系或CBD：组合物的关系，就可以调节此剂量。本领域技术人员可以根据所治疗的受试者和所述组合物中所述多个组份的水平(如THCA)进行适当的调节。
本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过体外标准药学方法、细胞培养物或实验动物来测定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。剂量可根据使用的剂型和所用的给药途径而变化。确切的配方、给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的病情选择。(参见例如Fingl等人所著，1975，治疗学的药学基础“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1p.1)。
可以个别调整剂量和间隔以提供足以诱导或抑制生物效应的大麻衍生的活性成分(肠组织)水平(最小有效浓度minimal effective concentration，MEC)。每种制剂的MEC都不同，但可以从体外数据估算。实现MEC所需的剂量取决于个体特征和给药途径。检测分析可用于确定血浆浓度。
根据被治疗的病症的严重程度和反应性，可以是单次给药或多次给药，治疗过程持续数天至数周或直至达成治愈或达成疾病状态的减轻。
当然给药组合物的量取决于所治疗的受试者、痛苦的严重\程度、给药方式，处方医师的判断等。
如果需要，本发明的一些实施例的组合物可以存在于一包装或一分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可以含有一种或多种活性成分的单位剂型。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装(blister pack)。所述包装或分配器装置可附有给药说明。所述包装或分配器也可以由与容器相关的通知容纳，以管理药品制造、使用或销售的政府机构的形式，所述通知反映了所述机构批准的组合物的形式或人类或兽医的给药。例如这种通知可以是美国食品和药物管理局批准标示，用于处方药或批准的批准的产品插页。还可以制备多种组合物，其包含在相容的药物载体中配制的本发明制剂，将其置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病症，如上文进一步详述。
根据另一实施例，为了增强对炎症疾病的治疗，本发明进一步设想向受试者施用可有益于治疗的额外的治疗。本领域技术人员能够做出这样的确定。
因此例如抗炎治疗可以包括但不限于NSAIDs(Non-Steroidal Anti-inflammatory Drugs，非甾体抗炎药)、皮质类固醇(如泼尼松，prednisone)和抗组胺药。
根据本教导可以使用的其他抗炎剂包括但不限于，Alclofenac；AlclometasoneDipropionate；Algestone Acetonide；Alpha Amylase；Amcinafal；Amcinafide；AmfenacSodium；Amiprilose Hydrochloride；Anakinra；Anirolac；Anitrazafen；Apazone；Balsalazide Disodium；Bendazac；Benoxaprofen；Benzydamine Hydrochloride；Bromelains；Broperamole；Budesonide；Carprofen；Cicloprofen；Cintazone；Cliprofen；Clobetasol Propionate；Clobetasone Butyrate；Clopirac；Cloticasone Propionate；Cormethasone Acetate；Cortodoxone；Deflazacort；Desonide；Desoximetasone；Dexamethasone Dipropionate；Diclofenac Potassium；Diclofenac Sodium；DiflorasoneDiacetate；Diflumidone Sodium；Diflunisal；Difluprednate；Diftalone；DimethylSulfoxide；Drocinonide；Endrysone；Enlimomab；Enolicam Sodium；Epirizole；Etodolac；Etofenamate；Felbinac；Fenamole；Fenbufen；Fenclofenac；Fenclorac；Fendosal；Fenpipalone；Fentiazac；Flazalone；Fluazacort；Flufenamic Acid；Flumizole；Flunisolide Acetate；Flunixin；Flunixin Meglumine；Fluocortin Butyl；Fluorometholone Acetate；Fluquazone；Flurbiprofen；Fluretofen；FluticasonePropionate；Furaprofen；Furobufen；Halcinonide；Halobetasol Propionate；Halopredone Acetate；Ibufenac；Ibuprofen；Ibuprofen Aluminum；Ibuprofen Piconol；Ilonidap；Indomethacin；Indomethacin Sodium；Indoprofen；Indoxole；Intrazole；Isoflupredone Acetate；Isoxepac；Isoxicam；Ketoprofen；Lofemizole Hydrochloride；Lomoxicam；Loteprednol Etabonate；Meclofenamate Sodium；Meclofenamic Acid；Meclorisone Dibutyrate；Mefenamic Acid；Mesalamine；Meseclazone；Methylprednisolone Suleptanate；Momiflumate；Nabumetone；Naproxen；NaproxenSodium；Naproxol；Nimazone；Olsalazine Sodium；Orgotein；Orpanoxin；Oxaprozin；Oxyphenbutazone；Paranyline Hydrochloride；Pentosan Polysulfate Sodium；Phenbutazone Sodium Glycerate；Pirfenidone；Piroxicam；Piroxicam Cinnamate；Piroxicam Olamine；Pirprofen；Prednazate；Prifelone；Prodolic Acid；Proquazone；Proxazole；Proxazole Citrate；Rimexolone；Romazarit；Salcolex；Salnacedin；Salsalate；Sanguinarium Chloride；Seclazone；Sermetacin；Sudoxicam；Sulindac；Suprofen；Talmetacin；Talniflumate；Talosalate；Tebufelone；Tenidap；TenidapSodium；Tenoxicam；Tesicam；Tesimide；Tetrydamine；Tiopinac；Tixocortol Pivalate；Tolmetin；Tolmetin Sodium；Triclonide；Triflumidate；Zidometacin；ZomepiracSodium.
任何上述药剂可以单独给药或组合给药。
本发明的大麻提取物可以多种其他形式(包括营养药物组合物)给予有需要的受试者(例如人类)。
如本文所用，“营养药物组合物(nutraceutical composition)”是指可被视为食物或食物的一部分并提供医学上或健康益处的任何物质，包括疾病的预防和治疗。在一些实施例中，营养药物组合物旨在补充饮食并含有至少一种或多种以下成分：维生素、矿物质、草药、植物、果实、蔬菜、氨基酸或任何前述成分的浓缩物、代谢物、成分或提取物及其组合。
在一些实施例中，本发明的营养药物组合物可以作为“膳食补充剂(dietarysupplement)”施用，如美国食品和药物管理局所定义，其为口服含有“膳食成分”的产品，例如但不限于维生素、矿物质、草药、其他植物、氨基酸以及诸如酶、器官组织、腺体、代谢物或其提取物或浓缩物的物质。
本发明的营养组合物的非限制性形式包括：片剂、胶囊、丸剂、软凝胶、软胶囊、液体、粉末、溶液、酊剂(tincture)、悬浮液、糖浆或已知的其他形式。对于本领域技术人员而言。营养保健品组合物也可以是食品的形式，例如但不限于食品棒、饮料、食品凝胶、食品添加剂/补充剂、粉末、糖浆及其组合。
根据本发明的另一方面，提供一种确定本发明的一些实施例的组合物的细胞毒活性的方法，所述方法包括使受试者的恶性组织与组合物离体接触，其中发炎组织的抗炎反应增加到一预定阈值以上，则指示所述组合物的抗炎活性。
根据一实施例，所述发炎的组织是胃肠组织的活检体。示例性组织包括食道、胆囊、肝脏、胰腺、胃、小肠、肠(大肠或结肠和直肠)和肛门。
根据一实施例，所述发炎的组织是在炎性疾病的活跃阶段从受试者获得的。典型的炎性疾病包括但不限于IBD、UC和克罗恩氏病。
根据一实施例，所述组合物的抗炎活性包括抗炎因子(例如细胞因子(cytokine)，例如但不限于IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α和TGF-β)分泌的向上调控和/或促炎因子(例如细胞因子，例如但不限于IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、INF-γ、IL-12、IL-18和GM-CSF)的分泌减少。
根据一实施例，所述组合物的抗炎活性包括降低与所述炎症相关的基因的表达。根据一实施例，示例性基因包括但不限于MMP9和COX2。
根据一实施例，可以通过确定健康组织的一表达水平(例如基因的表达水平)或一因子(例如细胞因子)的分泌来确定一预定阈值(例如健康供体受试者的健康组织，疾病发作之前或疾病缓解期间受试者的健康组织，或从市售的组织培养物中获得)。
如本文所用的术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。
术语“由...组成(consisting of)”意指“包括并且限于”。
术语“基本上由......组成(essentially consisting of)”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征。
本文所使用的单数形式“一”、“一个”及“至少一”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在。应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。
每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。术语，第一指示数字及第二指示数字"之间的范围”及第一指示数字"到”第二指示数字"的范围"在本文中可互换，并指包括第一及第二指示数字，及其间的所有分数及整数。
如本文所用的术语“方法(method)”指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学，药理，生物，生化及医学领域从业者所开发。
可以理解，本发明中的特定特征，为清楚起见，在分开的实施例的内文中描述，也可以在单一实施例的组合中提供。相反地，本发明中，为简洁起见，在单一实施例的内文中所描述的各种特征，也可以分开地、或者以任何合适的子组合、或者在适用于本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各种实施例的内文中所描述的特定特征，并不被认为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施例没有那些元素就不起作用。
上文所述的及以权利要求项部分所请求的本发明各种实施例和方面，可在以下的实施例中找到实验支持。
示例：
现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施例。
通常本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。例如参见"分子克隆：实验室手册Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等人所著(1989)；"分子生物学中的现行方案Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.所著(1994)；Ausubel等人所著,"分子生物学中的现行方案Current Protocols in MolecularBiology",John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland等人所著(1989)；Perbal所著,"分子克隆实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons所著New York(1988)；Watson等人所著,"重组DNA Recombinant DNA",Scientific American Books,NewYork；Birren等人所著(eds)"基因组分析：实验室手册系列Genome Analysis:ALaboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(1998)；美国专利U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；"细胞生物学：实验手册Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.所著(1994)；"目前的免疫学方案Current Protocols inImmunology"Volumes I-III Coligan J.E.所著(1994)；Stites等人所著"基础临床免疫学Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi所著"细胞免疫学中的选择方法Selected Methods in CellularImmunology",W.H.Freeman and Co.所著New York(1980)；在专利和科学文献中广泛描述可用的免疫测定法U.S.Pat.Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771and 5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.所著(1984)；“核酸杂合Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和Higgins S.J.所著(1985)；"转录与转译Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.所著(1984)；"动物细胞培养Animal Cell Culture"Freshney,R.I.所著(1986)；"固定的细胞与酵素Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"分子克隆实用指南APractical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"酵素学的方法Methodsin Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR方案：方法与应用指南PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人所著"蛋白质纯化和表征策略Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些内容都被并入做为参考文献，如同在本文中完整描述，其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息都通过引用结合在此。
一般材料和实验程序：
大麻花序的提取：
从植物收获C.sativa品系AD的鲜花。将其立即提取并在-80℃下冷冻，或在提取前在150℃下烘烤3小时。将新鲜和烘焙的大麻花(2克)用液氮粉碎。将无水乙醇加入到含有粉末的各管中，样品与无水乙醇的比例为1：4(w/v)。将管在振荡器上彻底混合30分钟，然后通过滤纸过滤提取物。将滤液转移到新管中。用真空蒸发器蒸发溶剂。将干燥的提取物重悬于1毫升的无水甲醇中，并通过0.45微米注射器过滤器过滤。收集过滤的液体用于处理，将重悬的提取物稀释，以用于细胞培养和酶联免疫吸附测定(ELISA)实验中的活组织检查。通过压碎1克具有已知鲜重的植物材料并在60℃下孵育过夜，然后再次称重以计算干重来确定样品干重。
化学特性：
标准品准备：
大麻素(cannabinoid)标准品：大麻萜酚(cannabigerol,CBG)，大麻二酚(cannabidiol，CBD)、大麻二酚酸(cannabidiolic acid，CBDA)、大麻酚(cannabinol，CBN)、大麻萜酚酸(cannabigerolic acid，CBGA)、四氢大麻酚酸(tetrahydrocannabinolicacid，THCA)、大麻环萜酚(Cannabichromene，CBC)和四氢大麻酚酸(tetrahydrocannabinolic acid，THCA)用甲醇稀释至10ppm浓度，然后进行HPLC分离。为了定量THC和THCA，将标准品以5ppm至40ppm的不同浓度溶解在甲醇中。
样品制备：
对于HPLC，将干提取物(乙醇粗物质)重悬于1毫升甲醇中，并通过0.45微米注射器过滤器(Merck，Darmstadt，Germany)过滤。将过滤的提取物(滤液)用甲醇稀释10倍，然后通过HPLC分离。为了进行分析，将滤液用甲醇稀释50倍。
HPLC分离：
样品分离在与WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器偶联的UltiMate 3000HPLC系统中进行。在具有一保护柱(4mm×4mm I.D.)的Purospher RP-18封端柱(250mm×4.6mm I.D.；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)上进行分离。通过等度比例(isocratic proportion)与15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)以1.5毫升/分钟的流速持续35分钟形成溶剂梯度。在220、240和280纳米处检测到多个化合物峰值。取220纳米的峰值进行进一步处理。根据获得的色谱将提取物分成9个馏分。
气相色谱仪(GC)与质量选择检测器(MSD)(GC/MS)分析：
使用与HP6973质谱仪偶联的HP7890气相色谱仪进行GC/MS分析，电子倍增器电位为2KV，灯丝电流为0.35mA，电子能量为70eV，并且在m/z 40至400的范围内记录光谱。使用Agilent 7683自动进样器进行样品引入。氦气以1.1毫升/秒的恒定流量用作载气。使用1:10分流比注射模式将1μl每种样品注射到GC/MS中。将保持在50℃的等温保持2分钟，然后加热梯度为6℃/每分钟至300℃，最终温度保持4分钟。使用具有0.25微米膜厚的30米，0.25毫米ID 5％交联苯基甲基硅氧烷毛细管柱(cross-linked phenylmethyl siloxanecapillary column，HP-5MS)进行分离，并且注入口温度为220℃。MS界面温度为280℃。借助于谱库谱(library spectra，NIST 14.0)进行峰值分配，并与公布的数据和从购自LGC的标准品注射获得的MS数据进行比较。在进行GC/MS分析之前，将200微升含有1％三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane，TMCS)的N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA，购自以色列Sigma-Aldrich)加入各个完全干燥的萃取物中，并加热至70℃持续20分钟。使用1:10分流比(split ratio)进样模式将各样品1μL注入GC/MS(如上所述)。
质谱(MS)分析：
使用ESI(Q-TOF)6545(高分辨率)(Agilent)进行级分分析。MS条件如下：ESI阳性模式、m/z 50-1500、气体温度350℃、注射体积5微升、溶剂组合物0.1％甲酸水溶液(46％)、乙腈(acetonitrile，50％)和水(4％)(v/v)。
核磁共振(NMR)分析：
1H和13C光谱在Bruker Avance-400仪器(分别为400.1和100.6MHz)中记录，在CDCl3中作为溶剂，所述含有四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)作为一内部参照，在300K下。此外，进行了三个2D实验：COZY(1H-1H相关)，HMQC(单键1H-13C相关)和HMBC(长范围1H-13C相关)。
HCT116、HT29细胞和CaCO2细胞的细胞培养和抗炎活性的测定：
HCT116(ATCC CCL-247)，HT29(ATCC HTB-38)和CaCO2(ATCC HTB-37)结肠细胞在湿度为5％CO2–95％的空气中于37℃下生长。将细胞保存在McCoy的5a改良培养基(HCT116和HT29)和Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中，其中添加了10％的胎牛血清(CaCO2)。
在500μL生长培养基中，将细胞以三重复、每孔50,000个细胞的浓度接种到24孔板中，然后在潮湿的5％CO2-95％空气中于37℃孵育24小时。当用TNF-α进行细胞激发时，如上所述用50至300纳克/毫升重组人类TNF-α(PeproTech，Rocky Hill，NJ，美国)和50微升植物提取物处理各孔中的培养物(稀释指数57或280)。取上清液，并使用市售的Human CXCL8/IL-8DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)在处理后4至16小时测量IL-8的水平[12]。使用地塞米松(美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司)于20、200和400μM的最终浓度作为阳性对照组。
通过用20μM CB1受体拮抗剂/反向激动剂Rimonabant(Abcam，Cambridge，MA，美国)、CB2受体拮抗剂/反向激动剂SR144528(Abcam)和GPR55拮抗剂/反向激动剂CID16020046(Sigma-Aldrich，Buchs，瑞士)处理细胞，来检查受体(CB1，CB2和GPR55)的参与。拮抗剂处理1小时后，将新鲜花序(C2F)的全部提取物或活性馏分(F7)与TNF-α一起施用于细胞。使用不同浓度的CBD(Restek，PA，USA)、最终浓度为0.2mM的THCA(THCA-A；Restek)以及如每个实验中所指示的mM最终浓度的THC(Restek)进行细胞处理，以确认各大麻素的活性。
使用刃天青(R&D Systems)检查提取物的细胞毒性作用。为此将10％刃天青添加到处理的各孔中，并在37℃下在潮湿的5％CO2-95％大气中温育4小时。将上清液(每孔100微升)转移到96孔板中，测量544/590纳米激发/发射的相对荧光。利用一线性标准浓度曲线计算活细胞数，所述曲线通过将不同浓度的细胞接种在刃天青处理过的24孔板中而建立。在减去无细胞的Alamar Blue自发荧光后，将多个值计算为活细胞相对于未处理的(无TNF-α和处理的细胞)对照组的百分比。
对于剂量反应测定，数据点通过S形剂量反应关系的非线性回归线连接。使用GraphPad Prism(适用于Windows的6版，GraphPad软件公司，美国圣地亚哥)生成剂量反应曲线，并使用非线性回归分析计算IC50剂量。
活检体培养：
从29名患有克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)的患者中获得了来自IBD(炎性肠病)患者的健康和发炎肠的三份活检体，这些患者被其医生认为必要的结肠镜检查，赫尔辛基批准号获得为0094-16。在获得知情同意后，从发炎和正常组织进行活检，并将其置于组织培养基中。接受活检后，用75微升分散酶(StemCell Technologies，英国剑桥)和150微升胶原酶1A(StemCell Technologies)溶液代替PBS。然后将试管在37℃下孵育1小时。孵育后，将包含活组织检体的试管以8000rpm(11,885x g)离心1分钟。然后除去上清液，并用汉克平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solutin)将组织洗涤3次。每次洗涤后，如上所述将管离心。然后将组织放在小培养皿上，用干净的手术刀切成2至3块。然后将这些碎片放在Millicel亲水PTFE组织培养插入物上(Millipore，30mm，0.4μm)。将所述插入物与1.5毫升组织培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基，补充有10％v/v热灭活胎牛血清、100U/毫升青霉素、50微克/毫升Leupeptin、1mM PMSF和50微克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂)一起放入6孔塑料组织培养皿(Costar 3506)中。当地塞米松(dexamethasone)包含在培养基中时，其浓度为200微克/毫升。随后用上述提取物处理组织，或不对其进行处理(对照组)。当添加TNF-α诱导白介素(IL)表达时，所述浓度为50纳克/毫升。然后将培养物在5％的CO2–95％的潮湿空气中于37℃孵育。为了评估TNF-α的表达，孵育1小时后取上清液。对于其他的白介素IL，除非另有说明，否则过夜孵育后取上清液。通过使用商业化的ELISA试剂盒测量其水平，将活检体的上清液用于测定IL-8细胞因子谱(cytokine profile)。比较发炎的、大麻处理的和未处理的组织的细胞因子水平。
定量实时(qRT)PCR
将细胞以每孔1,500,000个细胞/毫升的浓度接种到6孔板中。在潮湿的5％CO2–95％空气中于37℃下孵育24小时后，将细胞用TNF-α(终浓度为1纳克/毫升)处理，并在相同条件下孵育过夜。未处理的细胞或仅用TNF-α处理的细胞分别作为阴性和阳性对照。然后在37℃的5％CO2-95％湿润空气中，将细胞与C2F(0.2毫克的粗干提取物/毫升)或F7(0.08毫克/毫升)重新孵育5小时。第二天收集细胞并根据制造商的规程使用TRI试剂(Sigma-Aldrich)提取总RNA。对于活检体，所有处理均需添加过夜，然后将活检体保存在-20℃的RNA Save溶液中(Biological Industries，Beit Haemek，以色列)。从冷冻的活检体中提取RNA。如同上述对细胞所执行，用合适的匀质器在TRI试剂中将组织样品均质。使用Maxim反转录酶(Thermo Scientific，波士顿，马萨诸塞州，美国)，根据制造商的规程，将RNA(活检体50纳克：四名UC患者和一名CD患者)或2.5μg(细胞)以总体积20微升进行反转录。所有引物均使用Primer3Plus软件设计。根据制造商的规程，使用Rotor-Gene 6000仪器(QIAGEN，苏黎世，瑞士)和Maxima SyGreen Mix(Thermo Scientific)以三重复进行PCR。相对于2-ΔΔCt中GAPDH mRNA的表达，将每个目标基因的表达标准化，并表示为目标基因与GAPDHmRNA的比率，表示为2-ΔCt，其中Ct为阈值循环，ΔCt＝Ct Target-Ct GAPDH。实验重复三遍。引物是用于COX2的(正向，SEQ ID NO：1)5'-ATTGACCAGAGCAGGCAGAT-3'和(反向，SEQ IDNO：2)5'-CAGGATACAGCTCCACAGCA-3'，用于MMP9的(正向，SEQ ID NO::3)5′-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′和(反向，SEQ ID NO：4)5′-TCACGTCGTCCTTATGCAAG-3′。
联合用药效果分析：
为了检查CBD和F7之间是否存在协同作用，使用了ELISA分析法来测量馏分对HCT116细胞的抗炎活性。将细胞在正常生长培养基中以三重复每孔50,000个细胞的形式接种到24孔板中。在37℃的5％CO2-95％的潮湿空气中孵育24小时后，将细胞用不同浓度的F7(5微克/毫升至80微克/毫升)进行处理，同时添加和不添加CBD(30μM)，以及300纳克/毫升TNF-α；或是不同浓度的CBD(5μM至120μM)，同时添加和不添加F7(30微克/毫升)以及300纳克/毫升TNF-α，持续4小时。随后取上清液，并使用商业的人类CXCL8/IL-8DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)测量IL-8的水平。使用刃天青(Resazurin，R&D Systems)检查提取物的细胞毒性作用。
药物协同作用由Bliss独立性药物相互作用模型决定，所述模型由以下方程式定义：
Exy＝Ex+Ey-(ExEy)
其中(Exy)是药物x和y的累加作用，如其各自的作用(Ex和Ey)所预测。出于计算目的，在本文中，药物的抗癌作用被定义为对获得的结果(1-Exy)的补数(complementary)。然后将所述观察到的组合生存力百分比与计算值进行比较。如果Exy的观察值大于计算的Exy值，组合处理被认为比预期还差，其表示拮抗作用。如果观察值小于计算值，则认为组合处理比预期还优，因此显示协同作用。如果两个值相等，则组合处理被认为是等同于两种药物的叠加，其表示是叠加性的(独立的)。
统计分析：
结果表示为重复分析的平均值+SE，代表或包括至少两个独立实验。使用JMP统计软件包通过Tukey–Kramer检验(P≤0.05)对重复平均值进行统计学分析，当P≤0.05时，认为具有统计学意义。
示例1：
从鲜花中提取的大麻提取物在减少结肠细胞系的炎症具有很高的活性：
测定大麻(Cs-AD var。)的新鲜(C2F)和烘烤过的(C2B)花序的无水乙醇提取物的抗炎活性。以HCT116结肠癌细胞培养物中IL-8的降低水平来确定活性，所述HCT116结肠癌细胞培养物用TNF-α预处理以诱导IL-8表达然后用C2F或C2B处理(图1B和图1E)。值得注意的是，IL-8还用于HCT116以及其他细胞模型和IBD患者的其他几项研究中，作为IBD相关炎症水平的指标[Ihenetu K.等人所著，Eur J Pharmacol.(2003)458:207-215；Banks C etal.,J Pathol.(2003)199:28-35]。在不同浓度的C2F和C2B(114–207微克/毫升)下，与TNF-α相比，两种提取物均显着降低了IL-8水平。在这些条件下，地塞米松(浓度为200和400μM)在降低IL-8水平方面没有活性(图1B和图1E)。由于两种大麻乙醇提取物均显着降低了IL-8水平，因此暗示它们具有抗炎活性。此外C2F提取物在降低IL-8水平方面比C2B活性更高(图1B)。
为了确定IL-8的减少是由于抗炎作用而不是细胞毒性作用，针对不同浓度的C2F和C2B处理检测细胞活力。在大多数检查浓度下，C2B具有明显的细胞毒性活性，而C2F没有(图1A和图1F)。这些结果表明，尽管用C2B治疗后IL-8水平的降低可能源于细胞死亡，但是用C2F治疗后的IL-8水平的降低仅基于抗炎活性。
对于C2F和C2B，在HT29和CaCO2细胞中获得了相似的抗炎活性结果，其中C2F的活性明显高于C2B，并且都比地塞米松活性更高(图1C至图1D和图1G至图1J)。值得注意的是，确定CaCO2细胞系中C2F的细胞毒性略有增加(在较高浓度下)(图1I至图1J)。
总结而言，结果表明大麻提取物在减少IL-8方面具有强活性，其中C2F比C2B更有效。C2F和C2B的IC50浓度值相似(C2F和C2B的浓度分别为0.0839毫克/毫升和0.0841毫克/毫升；图1C至图1D)。因此，这些结果证明了大麻具有强的、剂量依赖性的抗炎活性，而其在C2B中大致上不存在。
示例2：
新鲜花序和烘烤过的花序中大麻提取物的化学成分：
测定抗炎活性提取物C2F和活性较低的提取物C2B的HPLC色谱图和主要活性化合物(图2A-B和表1)。
表1.新鲜花序和烘烤过的花序中的HPLC峰面积和面积百分比
Figure BDA0002242590740000711
在220纳米的新鲜的和烘焙的粗提物中鉴定出八种主要大麻素。相对于大麻素标准品(未显示)的HPLC谱图，这些峰值被鉴定为CBG、CBD、CBDA、CBN、CBGA、THC、CBC和THCA，滞留时间分别为5.9、6.4、7.9、10.9、11.3、13.1、17.5和29.3分钟。与C2F提取物相比，C2B中CBD，CBGA和THC的含量分别高36、14和32倍。C2F中未发现CBC，但C2B中出现了CBC。与C2F相比，C2B中的THCA和CBDA含量分别降低了1200倍和1.5倍(图2A至图2B和表1)，这是由于加热过程中CBDA和THCA的脱羧作用所致(例如[22])。
式例3：
大麻鲜花提取物活性馏分的鉴别及其与全提取物组合的作用：
用HPLC分离C2F(浓度为163μg/mL)(图3A)。收集馏分并检查高浓度(0.9mg/ml)的抗炎活性，所述活性由HCT116细胞中的IL-8所确定。一馏分F7将每个HCT116细胞的IL-8水平显着降低至整个提取物处理的IL-8水平(C2F和合并的F1-F9；图3B和3E)。对于任何其他部分，均未观察到IL-8水平的显着降低(图3B至图3C和图3E)。这些馏分均未降低细胞活力，而用某些馏分处理甚至显示出细胞增殖的增加(例如F3，F9；图3F)。对于HT29和CaCO2细胞中的F7，获得了类似的抗炎活性结果(图1G至图1J)。
随后通过稀释提取物并检查C2F、F7、合并的F1至F9(不含F7)的细胞毒活性活性，并对包括F7在内的所有组分进行合并处理，以比较C2F和F7对于HCT116细胞的活性(图3B至图3C和图3G至图3H)。不出所料，F7和C2F具有相似的抗炎活性，而F1至F9(不含F7)则治疗无效(图3C和图3E)。但是一旦将F7添加到F1至F9(不含F7)治疗中，抗炎活性将得以保留(图3C和图3G)。至于细胞毒活性，对于F1至F9不含F7和添加F7的组合处理，分别于190和190微克/毫升浓度，发现明显的细胞毒活性诱导作用，对于F1至F9不含F7以及F7，分别在163和190微克/毫升浓度，更明显(图3H)。这些结果表明，F7代表结肠细胞系中的抗炎活性，而用提取物的所有馏分进行的某些治疗组合会导致细胞毒活性的显着提高。
示例4：
CBD仅在较低剂量下可减轻炎症，但其细胞毒性活性取决于剂量：
就IL-8减少而言，包含CBG、CBD和CBDA的馏分(F2)在HCT116细胞中未显示任何抗炎活性(图3A至图3B)。这与一些刊物表明CBD是IBD的主要抗炎化合物相违背(见[23])。为了进一步检查CBD活性，在HCT116，HT29和CaCO2细胞中，纯CBD(纯度通过HPLC验证，未显示)的抗炎和细胞毒活性。用不同浓度(16至252微克/毫升)的纯CBD处理，在较低CBD浓度下可降低IL-8水平(图3I)。然而对于HCT116细胞中较高的CBD浓度，尚未确定CBD的抗炎活性(图3D和图3I)。CBD在降低CaCO2和HT29细胞中IL-8水平方面具有积极的功效(图3I)。但是用CBD进行治疗会导致HCT116和CaCO2细胞中剂量依赖性的细胞死亡，而HT29细胞中的剂量依赖性的细胞死亡程度较小(图3J和图6)。
示例5：
大麻提取物的活性馏分主要包含THCA：
活性馏分(F7)的化学成分通过HPLC和电喷雾电离质谱(electrosprayionization mass spectrometry，ESI–MS)进行了分析。在HPLC色谱图中获得的F7为宽峰。为了分析其结构并验证其纯度，与THCA标准品相比，以不同的稀释度对其进行了分析。结果表明F7是THCA(图4)。ESI-MS结果进一步证实F7含有THCA：C22H30O4(358.214)；m/z(MH+)359.222,(MNa+)381.203。取得1H和13C光谱以验证确切的结构并确定F7的纯度。NMR结果表明，F7确实是THCA，纯度为80至95％。值得注意的是，F7的不同样品(来自不同的收集)采用两种不同的方法进行分析，因此纯度之间存在差异。在GC/MS中，纯度是5个不同样品的平均值。
示例6：
THCA对HCT116细胞中的炎症具有活性
由于发现THCA是大麻提取物活性馏分中的主要化合物，因此确定了THCA(市售纯度为99％)在HCT116细胞中的抗炎活性。用THCA处理(通过HPLC验证纯度，未显示)可显着降低HCT116细胞中的IL-8水平(图5)。为了进一步确定F7中的活性是否仅源自THCA，确定其在所述馏分中的浓度为22.81毫克/毫升，并将F7稀释280倍，相当于0.2mM THCA。在这些条件下，F7和THCA的活性相似(图5)，进一步表明F7的抗炎活性源自THCA。
总之，本发明结果表示是THCA在HCT116细胞系中具有抗炎活性，而非CBD。此外整个大麻提取物，C2F或合并的馏分具有比F7或F1-F9(不含F7)更高的活性，这对于较低浓度的馏分也很明显。这表明各部分之间的相互作用，使得F7(THCA)和存在于新鲜大麻提取物中的化合物的组合比只有F7(THCA)更有效地减少了HCT116细胞的炎症。
示例7：
GPR55受体拮抗剂显着降低F7的抗炎活性，而CB2受体拮抗剂显着提高HCT116细胞的增殖
为了确定是否通过CB或GPR55受体赋予HCT116细胞C2F和F7活性，测定了CB1、CB2和GPR55受体拮抗剂(分别为利莫那班Rimonabant、SR144528和CID16020046)对抗炎的作用。CB1和CB2受体拮抗剂没有显着改变F7或F1至F9的抗炎活性(图7)。但是在这些治疗中，添加GPR55拮抗剂会导致活性显着降低和IL-8水平升高(图7)。添加GPR55拮抗剂并没有改变对照中的IL-8水平(图7)。
通过qPCR在HCT116细胞中检测到CB1、CB2和GPR55的转录本。在这些细胞中用TNF-α处理后，CB2和GPR55的表达显着增加(数值是TNF-α处理的细胞与未处理的细胞中基因表达的稳定态水平；表2)。
表2：HCT-116细胞中的相对基因表达。在用TNF-α处理细胞过夜后，测量CB1、CB2和GPR55基因表达。
Figure BDA0002242590740000741
值得注意的是，使用2-ΔΔCT方法，将基因转录本的值确定为目标基因(CB1、CB2和GPR55)与参考基因(GAPDH)之间的比率。
式例8：
用大麻提取物C2F和F7处理可导致患者结肠组织中IL-8水平降低：
由于细胞系不能完全反映结肠组织的状况，因此在取自IBD患者的结肠组织活检中进一步证实了C2F和F7的减轻炎症的活性。活组织检查保持离体，并且在未处理的组织与C2F和F7处理的组织中确定IL-8和IL-6的水平。与未处理的对照组(n＝29)相比，用C2F治疗可显着降低IL-8和IL-6水平。这些结果证实了C2F和F7对源自IBD患者的结肠组织的抗炎作用(图8)。
式例9：
用大麻提取物C2F、F7和纯化的化合物(而非CBD)处理HCT116细胞和活检样品，导致MMP9和COX2表达降低：
在IBD患者的大肠中会诱导COX2表达([24]综述)，MMP9是活跃IBD期间肠粘膜表达的主要蛋白酶之一，与疾病的严重程度有关[25]。检查了MMP9和COX2表达的稳态水平，作为IBD患者HCT116细胞和结肠活检(四个UC和一个CD)中炎症水平的标志物。在用TNF-α处理的HCT116细胞中，COX2和MMP9的表达均显着诱导，而用C2F和F7处理则显着降低。F7在降低COX2表达上比C2F更有效(图9A)。在结肠组织中，C2F和F7处理下调了COX2和MMP9的表达(图9B)。与细胞系一样，F7在降低COX2表达上比C2F更有效(图9B)。
示例10：
大麻提取物中大麻素对大肠癌细胞系(HT29)的抗炎活性的协同作用：
为了确定F7和CBD的相互作用是否是协同的，即它们的联合活性大于其单独活性的总和，在不同浓度下检查它们的活性程度。首先对F7、CBD和THC进行剂量反应。图10说明处理4小时后HT29细胞中F7的剂量反应(抗炎活性)。从结果显而易见，用F7处理可导致HT29细胞中IL-8水平呈剂量依赖性降低。图11显示了处理4小时后HT29细胞中CBD的剂量反应(抗炎活性)。从结果可以明显看出，用CBD处理可导致HT29细胞中IL-8水平呈剂量依赖性降低，即使在低浓度(低于20μM)下，IL-8水平也会显着下降。图12显示了处理4小时后，HT29细胞中THC的剂量反应(抗炎活性)。从结果明显看出，用THC处理导致HT29细胞中IL-8水平呈剂量依赖性降低。
F7、CBD和THC的EC50由抗炎试验(活性的50％)计算得出(图13)。F7、CBD和THC的EC50分别确定为35.14、30.35和102.2微克/毫升。这些浓度进一步用于处理组合的下一个实验中。
在EC50剂量下，有和没有CBD的不同浓度的F7的抗炎活性(图14)和在EC50剂量下，有和没有F7的不同浓度的CBD的抗炎活性(图15)清楚地表明这些处理增强了CBD或F7的抗炎活性。
为了确定F7和CBD的相互作用是否协同作用，在不同浓度下组合时检查了它们的活性程度。对于每个组合实验，根据Bliss独立模型计算药物的部份作用。检查每种组合的五个浓度。发现以下组合具有协同相互作用：浓度为30微克/毫升的F7+浓度为20和10μM的CBD和浓度为30μM的CBD+浓度为30、20和15微克/毫升的F7(按分别在下面的表4和3中显示)。用粗体标记的是显示出协同作用的浓度。
表3：根据bliss模型对恒定CBD和不同浓度的F7组合进行ELISA实验的实验和计算值
Figure BDA0002242590740000761
表4.根据bliss模型对恒定F7和不同浓度的CBD组合进行ELISA实验的实验和计算值
此外，本发明人希望检查多个标准品(CBD和THCA)之间是否也存在协同作用。检查了五种THCA浓度(从5微克/毫升到30微克/毫升)以及浓度为30μm的CBD。发现以下组合的协同相互作用：CBD(30μM)+THCA的浓度为30、20、15、10、5微克/毫升，如下表5所示。
表5.根据bliss模型的ELISA实验的实验值和计算值
Figure BDA0002242590740000763
实施例11
馏分F7的化学成分：
对馏分F7的进一步分析表明，F7包含THCA、THC、CBD和CBN，其他酸(棕榈酸(palmitic acid)、亚麻酸(Linolenic acid)、苹果酸(malic acid)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、硬脂酸(stearic acid)和肉荳蔻酸(myristic acid))和化合物，如表6所示。
表6：从分析型HPLC重复收集的馏分7(F7)的组成(5次重复的总结结果)，并使用具有NIST 14.0的GC/MS进行分析
Figure BDA0002242590740000771
值得注意的是：在用100微升BSTFA和1％TMCS甲硅烷基化(silylation)后，将所有样品引入GC/MS
虽然本发明结合其具体实施例而被描述，显而易见的是，许多替代、修改及变化对于那些本领域的技术人员将是显而易见的。因此，其意在包括落入所附权利要求书的范围内的所有替代、修改及变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请以其整体在此通过引用并入本说明书中。其程度如同各单独的出版物、专利或专利申请被具体及单独地指明而通过引用并入本文中。此外，所引用的或指出的任何参考文献不应被解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。标题：本申请中标题部分在本文中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。
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莫尔研究应用有限公司
科尔泰, 希纳尼特
卡普尔尼克, 约拉姆
马祖兹, 莫兰
纳夫塔利, 蒂姆娜
<120> 治疗炎性疾病的组合物和方法
<130> 70927
<150> US 62/467,157
<151> 2017-03-05
<150> US 62/537,050
<151> 2017-07-26
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 单一股DNA寡核苷酸
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<223> 单一股DNA寡核苷酸
<400> 4
tcacgtcgtc cttatgcaag 20

Claims (50)

1.一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，其特征在于：所述方法包括对所述受试者施用一大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，所述液相色谱馏分的治疗有效量包括至少75％的四氢大麻酚酸，其中所述馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
2.一种大麻提取物的一液相色谱馏分的一治疗有效量，其特征在于：所述液相色谱馏分的治疗有效量包括至少75％四氢大麻酚酸，其中所述液相色谱馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分，用于治疗一受试者中的一炎性疾病。
3.一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，其特征在于：所述方法包括对所述受试者施用一物质组合物，所述物质组合物包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效量，所述多个液相色谱合并馏分的治疗有效量包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
4.一种大麻提取物的多个液相色谱合并馏分的一治疗有效量，其特征在于：所述多个液相色谱合并馏分的治疗有效量包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸，从而治疗一受试者的一炎性疾病。
5.一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，其特征在于：所述方法包括对所述受试者施用一组合物的一治疗有效量，所述组合物的治疗有效量包括四氢大麻酚酸，其中所述四氢大麻酚酸组成所述组合物中30％的多个有效成分，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
6.一种用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的的四氢大麻酚酸的治疗有效量，其特征在于：所述述四氢大麻酚酸组成所述组合物中30％的多个有效成分。
7.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述大麻提取物的多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，其中所述多个活性成分包括四氢大麻酚酸。
8.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括液相色谱纯化的大麻馏分，所述液相色谱纯化的大麻馏分可通过对大麻提取物进行液相色谱，并通过收集在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个馏分而获得。
9.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括大麻提取物的多个液相色谱合并馏分，所述大麻提取物的多个液相色谱合并馏分包括在220纳米操作下可被一检测器所检测的多个活性成分，所述组合物的特征在于：
(1)对癌细胞具有一细胞毒活性；
(2)降低细胞中促炎性细胞因子的分泌水平；和/或
(3)降低细胞中MMP9和COX2表达的水平。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括四氢大麻酚酸。
11.如权利要求7或10所述的组合物，其特征在于：所述组合物包含至少75％的四氢大麻酚酸。
12.一种包含四氢大麻酚酸和大麻二酚的组合物，其特征在于：所述组合物不含大麻环萜酚、大麻萜酚酸、大麻二酚酸、大麻萜酚和/或大麻酚中的至少一者。
13.如权利要求7至12中任一项所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括D-柠檬烯、β-石竹烯、α-石竹烯、苹果酸、α-法尼烯、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚和/或大麻萜酚中的至少一者。
14.如权利要求7至13中任一项所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括D-柠檬烯、β-石竹烯、α-石竹烯、苹果酸、α-法尼烯、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚和/或大麻萜酚。
15.如权利要求7至14中任一项所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括表6中所列的至少一种组分。
16.如权利要求7至8或10至15中任一项所述的组合物，其特征在于：
(1)对癌细胞具有一细胞毒活性；
(2)降低细胞中促炎性细胞因子的分泌水平；和/或
(3)降低细胞中MMP9和COX2表达的水平。
17.如权利要求7至11或13至16中任一项所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括大麻二酚。
18.一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，其特征在于：所述方法包括对所述受试者施用如权利要求7至17中任一项所述的组合物的一治疗有效量，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
19.一种如权利要求7至17中任一项所述的组合物的治疗有效量，其特征在于：所述治疗有效量用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病。
20.如权利要求1、3、5或18中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括对所述受试者施用大麻二酚的一治疗有效量。
21.如权利要求2、4、6或19中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，其特征在于：所述馏分、四氢大麻酚酸或组合物进一步包括使用大麻二酚的一治疗有效量。
22.如权利要求1、3、5、18或20中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括对所述受试者施用CB1受体、CB2受体和/或GPR55的一激动剂。
23.如权利要求2、4、6、19或21中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，其特征在于：所述馏分、四氢大麻酚酸或组合物进一步包括使用CB1受体、CB2受体和/或GPR55的一激动剂。
24.如权利要求1、3、5、18、20或22中任一项所述的方法，如权利要求2、4、6、19、21或23中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7或10至17中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述四氢大麻酚酸包括具有一抗炎活性的一合成四氢大麻酚酸或其类似物。
25.如权利要求3、5、18、20或22中任一项所述的方法，如权利要求4、6、19、21或23中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7或10至17中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述四氢大麻酚酸包括一大麻提取物的一液相色谱馏分，所述馏分包括至少75％的四氢大麻酚酸，其中所述馏分包括除所述四氢大麻酚酸之外的大麻衍生的多个活性成分。
26.如权利要求1、20、22、24或25中任一项所述的方法，如权利要求2、21、23、24或25中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求25所述的组合物，其特征在于：所述大麻提取物包括约80至95％的四氢大麻酚酸。
27.如权利要求1、3、5、18、20、22或24至26中任一项所述的方法，如权利要求2、4、19、21或23至26中任一项所述使用的治疗有效量的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7至11、13至17或24至26中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述一或多个馏分包含D-柠檬烯、β-石竹烯、α-石竹烯、苹果酸、α-法尼烯、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚和/或大麻萜酚中的至少一者。
28.如权利要求1、3、5、18、20、22或24至26中任一项所述的方法，如权利要求2、4、19、21或23至27中任一项所述使用的治疗有效量的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7至11、13至17或24至27中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述馏分或多个馏分包含D-柠檬烯、β-石竹烯、α-石竹烯、苹果酸、α-法尼烯、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚和/或大麻萜酚中的至少两者。
29.如权利要求1、3、18、20、22或24至28中任一项所述的方法，如权利要求2、4、19、21或23至28中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7至11、13至17或24至28中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述一或多个馏分包括表6中所列的多个组分。
30.如权利要求18、20、22或24至29中任一项所述的方法，如权利要求19、21或23至29中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求12至17或24至29中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述大麻二酚包括具有一抗炎活性的一合成大麻二酚或其类似物。
31.如权利要求1、3、5、18、20、22或24至30中任一项所述的方法，或如权利要求2、4、6、19、21或23至30中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，其特征在于：所述炎性疾病是一炎性肠病。
32.如权利要求1、3、18、20、22或24至31中任一项所述的方法，或如权利要求2、4、19、21或23至31中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7至11、13至17或24至30中的任一项所述的组合物，其特征在于：所述液相色谱包括高压液相色谱。
33.如权利要求1、3、18、20、22或24至32中任一项所述的方法，或如权利要求2、4、19、21或23至32中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7至11、13至17、24至30或32中任一项所述的组合物，其特征在于：所述液相色谱法在一相反的固定相上进行。
34.如根据权利要求33所述的方法、使用的馏分、四氢大麻酚酸、组合物或组合物，其特征在于：所述液相色谱使用包括10至30％的酸性水溶液和90至70％的醇的一流动相来进行。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法、使用的馏分、四氢大麻酚酸、组合物或组合物，其特征在于：所述高压液相色谱包括一固定相，所述固定相包含RP-18封端管柱；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
36.如权利要求35所述的方法、使用的馏分、四氢大麻酚酸、组合物或组合物，其特征在于：所述高压液相色谱的多个条件包括一UltiMate 3000高压液相色谱系统，结合WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器、一Purospher RP-18封端管柱、一流动相具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
37.如权利要求3、18、20、22或24至36中任一项所述的方法，或如权利要求4、19、21或23至36中任一项所述使用的馏分、四氢大麻酚酸或组合物，或如权利要求7至11、13至17、24至30或32至36中任一项所述的组合物，其特征在于：所述检测器是一二极管阵列检测器。
38.一种产生一抗炎组合物的方法，其特征在于：所述方法包括：
(1)对一干燥的大麻花序中加入一极性溶剂，以获得一粗提取物；
(2)过滤所述粗提取物，以获得一过滤的提取物；
(3)在一高压液相色谱上分馏所述过滤的提取物；
(4)收集至少一馏分，所述馏分包括在220纳米操作下可被一检测器检测的多个活性成分。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于：所述至少一馏分包括四氢大麻酚酸。
40.如权利要求38或39所述的方法，其特征在于：所述至少一馏分包括至少75％的四氢大麻酚酸。
41.如权利要求38或40所述的方法，其特征在于：所述至少一馏分包括D-柠檬烯、β-石竹烯、α-石竹烯、苹果酸、α-法尼烯、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚和/或大麻萜酚中的至少一者。
42.如权利要求38至41中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一馏分包含如表6中所列的多个组分。
43.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其特征在于：所述高压液相色谱包括一固定相，所述固定相包含RP-18封端管柱；以及一流动相，具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于：所述高压液相色谱的多个条件包括一UltiMate 3000高压液相色谱系统，结合WPS-3000(T)自动进样器、HPG-3400泵和DAD-300检测器、一Purospher RP-18封端管柱、一流动相具有15％溶剂A(0.1％乙酸水溶液)和85％溶剂B(甲醇)，流速为1.5毫升/分钟，持续28至35分钟。
45.如权利要求38至44中任一项所述的方法，其特征在于：所述检测器是一二极管阵列检测器。
46.一种抗炎组合物，其特征在于：所述抗炎组合物可通过如权利要求38至45中任一项所述方法获得的。
47.一种治疗有需要的一受试者的一炎性疾病的方法，其特征在于：所述方法包括对所述受试者施用如权利要求46所述的组合物的一治疗有效量，从而治疗所述受试者的炎性疾病。
48.一种如权利要求46所述的组合物的治疗有效量，其特征在于：所述治疗有效量用于治疗有需要的一受试者的一炎性疾病。
49.一种测定如权利要求7至16、24至30、32至37或46中任一项所述的组合物的一抗炎活性的方法，其特征在于：所述方法包括使一受试者的一发炎组织与所述组合物离体接触，其中所述发炎组织的抗炎反应增加高于一预定阈值表明所述组合物的抗炎活性。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于：所述发炎的组织是一胃肠组织活检体。
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