CN110726800A - 对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质的检测方法，所述的检测方法包括使用反相高效液相色谱法并使用乙腈‑磷酸盐缓冲液作为流动相对对甲苯磺酸依度沙班一水合物样品中的5个警示结构杂质进行检测。该检测方法可以定量检出对甲苯磺酸依度沙班一水合物中高于0.0005％的杂质，以及能有效分离5个警示结构杂质，实用性强，检测过程简单、快捷。

Description

对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析化学领域，涉及对甲苯磺酸依度沙班一水合物的质量进行检测的方法，具体涉及采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离测定对甲苯磺酸依度沙班一水合物中警示结构杂质的检测方法。

背景技术

血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，可累及全身各个器官及系统，其发病率、致残率和死亡率都很高。目前抗血栓药物共分为3大类：抗血小板聚集药物、溶栓药物和抗凝药物。抗血小板聚集药物（platelet aggregation inhibitors，PAIs）主要通过抑制血小板粘附、释放、聚集功能和血小板活化起到抗血栓效应；溶栓药物（fibrinolytics and anticoagulants）又称为纤维蛋白溶解药，可激活纤溶酶而起到溶栓作用，用于急性心肌梗死、急性缺血性脑血栓形成、急性肺血栓栓塞症；抗凝药物（anticoagulants）主要包括肝素（heparins）、维生素K抑制剂(vitamin K antagonists，VKAs)、直接凝血酶抑制（directthrombin inhibitors，DTIs) 和直接凝血因子Xa抑制剂（direct factor Xa inhibitors) 等。

对甲苯磺酸依度沙班一水合物，其化学名为：N-(5-氯代吡啶-2-基)-N^'-((1S,2R,4S)-4-[(二甲氨基)羰基]-2-{[(5-甲基-4,5,6,7-四氢噻唑并[5,4-c]吡啶-2-基)羰基]氨基}环己基)乙二酰胺对甲苯磺酸盐一水合物，其化学结构式为：

（Edoxaban tosylate monohydrate）

依度沙班（Edoxaban）是日本第一三共株式会社研制的口服抗凝药，其通过选择性且可逆性地直接抑制FXa达到抑制血栓形成的目的，对FXa 的选择性比FIIa 高104 倍。依度沙班于2011年4月在日本获得批准，用于预防全膝关节置换、全髋关节置换和髋骨骨折等手术后的静脉血栓栓塞（VTE）。2015年1月FDA批准依度沙班在美国上市（品牌名Savaysa），获批的适应症为降低非心脏瓣膜病引起的房颤患者中风和危险血栓（系统性栓塞）风险，也被批准用于治疗以前接受过通过注射或输注（肠胃外）抗凝血药给药的深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）患者。2015年6月欧盟批准上市，用于伴有一个或多个风险因素的非瓣膜性房颤（NVAF）成人患者预防卒中和全身性栓塞，以及用于成人患者治疗深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）以及预防DVT和PE的复发。主要不良反应为出血( 尿潜血阳性、皮下出血、伤口出血等)、γ-GTP 升高、ALT 升高，其他不良反应有头痛、腹泻、出疹、瘙痒、浮肿、发热等。

药物中某些杂质，特别是基因毒性杂质的存在会极大地影响用药安全，因此，通过定向制备目标杂质，建立相应检测方法，对原料药及相关制剂的质量进行有效控制具有重要的意义。

发明内容

对甲苯磺酸依度沙班一水合物的质量研究过程中，涉及到如下疑似基因毒性杂质（简称：警示结构杂质）：

专利CN106008556B报道了依度沙班异构体的分离方法，填充剂选自直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)键合硅胶，流动相选自A、B、C和D的混合物，其中A选自正己烷和/或石油醚和/或正戊烷，B选自乙醇，C选自异丙醇，D选自二乙胺和/或三乙胺；流动相混合物中A、B、C、D各组分的体积比为50～65:10～45:1～35:0.1～0.3，该方法为正相分析方法。专利CN107543872A报道了依度沙班异构体的分析检测方法，采用以表面涂敷有纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)的硅胶为填料的手性色谱柱，以添加碱性试剂的甲醇-乙醇混合溶液作为流动相，所述甲醇-乙醇体积比为30:70～50:50，所述碱性试剂与甲醇-乙醇混合溶液的体积比为0.05％～0.5％。上述方法均是针对异构体的分离检测方法，无同时针对依度沙班YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1五个杂质的检测方法。

文献（李志伟,张任飞等. [J].HPLC 法测定甲苯磺酸依度沙班有关物质.河南大学学报,37 (5):489-496报道依度沙班有关物质的检测方法）（该法仅涉及YD-1杂质及其他杂质的检测）报道了依度沙班检测杂质的检测方法，但是由于上表中YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02杂质之间无法分离且在高波长下没有吸收，因此该文献的方法无法用于同时检测这五个杂质。

本发明提供了可用于控制对甲苯磺酸依度沙班一水合物质量的有效方法，特别是提供针对对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的检测、定量测定的有效的方法。本发明人发现，采用特定的反相高效液相色谱检测条件例如C18色谱柱分离测定对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的反相高效液相色谱方法，例如使用乙腈-磷酸盐缓冲液作为流动相， 可以有效地实现对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的分离及定量测定。

本发明提供了对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的检测方法，该方法包括使用反相高效液相色谱法对对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质进行质量检测的步骤：

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱填料粒径为3μm～10μm，优选填料粒径为5μm。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的内径为3mm～10mm，优选色谱柱的内径4.6mm。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的柱长为150mm～300mm，优选色谱柱的柱长为250mm。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的填料粒径为5μm，色谱柱的内径为4.6mm，色谱柱的柱长为250mm。以上型号参数可以简写为5μm，4.6×250mm，或简写为4.6×250mm，5µm，或其它类似简写方式。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是C18色谱柱。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是品牌为Waters的 XSelect HSS T3色谱柱。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法分离检测时色谱柱的柱温是25～45℃，例如30～40℃，例如约35℃。在柱温为32～38℃ 的范围内具有良好的分离效果。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法是使用A、B两种流动相，流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈；流动相A的摩尔浓度为15mmol/L～35mmol/L，例如20mmol/L～ 30mmol/L，例如25mmol/L；在流动相A的摩尔浓度为23mmol/L～27mmol/L的范围内具有良好的分离效果。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法是使用A、B两种流动相，流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，线性洗脱的程序如下：

本发明人已经发现，本品按照上述特定的洗脱方式进行线性洗脱，5个警示结构杂质之间均具有良好的分离效果，依度沙班及其他杂质均无干扰。在本发明下文具体实验中，如未特别说明，所用的流动相洗脱是照上述线性洗脱程序进行洗脱的。

在一个实施方案中，所述的磷酸盐缓冲液pH值为2.0～6.0；例如pH值为2.5～3.5，例如pH值为3.0±0.5；本发明已经发现，在pH值为2.8～3.2的范围内具有良好的分离效果；如若需调整缓冲液pH值，调节的酸或碱包括乙酸、甲酸、磷酸、盐酸、酒石酸、草酸、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾等，优选磷酸。在本发明下文具体实验中，如未特别说明，所用的流动相A为25mmol/L磷酸二氢钾溶液，其pH值为3.0±0.2。

在一个实施方案中，所述的磷酸盐缓冲液是通过以下步骤获得的：称取磷酸二氢钾3.4g，加1000ml水溶解，用磷酸调pH值为3.0±0.2，过滤，即得。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法中流动相的流速0.7ml/min～1.3 ml/ min，优选流速为1.0ml/ min。

根据本发明提供的检测方法，其中所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器，所述检测器的检测波长为195nm～215nm ，优选检测波长为205nm。

根据本发明提供的检测方法，对甲苯磺酸依度沙班一水合物的测定浓度为0.5mg/ml～20mg/ml，优选测定浓度为10mg/ml。

根据本发明提供的检测方法，对甲苯磺酸依度沙班的保留时间为15～23min和24～35min，优选对甲苯磺酸依度沙班的保留时间为18～20min和28～30min。

根据本发明提供的检测方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的供试品溶液是如下方式配制的：取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，加10体积%～50体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并稀释制成0.5mg/ml～20mg/ml的溶液，特别是配制成5mg/ml～15mg/ml，特别是配制成10mg/ml。

根据本发明提供的检测方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的杂质对照品溶液是如下方式配制的：取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加10体积%～50体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成0.05µg/ml～5µg/ml的溶液，特别是配制成0.15µg/ml。

根据本发明提供的检测方法，其中用于进行高效液相色谱法测试时，测试溶液注入液相色谱仪的量为10μl～100μl，特别是50μl。

根据本发明提供的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)、取对甲苯磺酸依度沙班一水合物样品适量，加10体积%～50体积%乙腈水溶液适量超声处理使溶解，再加10体积%～50体积%乙腈水溶液稀释并制成每1ml中含对甲苯磺酸依度沙班一水合物0.5 mg～20mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)、取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加10体积%～50体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.05µg～5µg的溶液，作为杂质对照品溶液；

(3)、设置流动相的流速0.7ml/ml～1.3ml/min；使用紫外检测器，检测波长为：195nm～215nm；使用Waters XSelect HSS T3（4.6×250mm，5µm）色谱柱；色谱柱的柱温为： 25℃～45℃；流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱；

(4)、取步骤(1)、步骤(2)所得的溶液10μl～100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，从中读取杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类，杂质各色谱峰之间的分离度、各色谱峰的峰面积；

(5)、按照步骤(4)读取的杂质信息，按照外标法进行计算各杂质的含量；

(6)、各杂质含量计算公式为：步骤(1)供试品溶液中该杂质的峰面积×步骤(2)杂质对照品溶液该杂质浓度/步骤(2)杂质对照品溶液该杂质的峰面积/步骤(1)供试品溶液的浓度。

根据本发明的方法，其任一实施方案可以与其他方案任意进行组合，只要这种组合不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步详细描述。

在本发明中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（C18柱）进行对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质分析测定，并采用线性梯度进行洗脱，以保证对甲苯磺酸依度沙班、5个警示结构杂质达到有效的分离，5个警示结构杂质均能有效的完全被洗脱检测出来，在此条件下能准确、有效的控制对甲苯磺酸依度沙班一水合物的质量。

在本发明中，供试品先采用适量20体积%乙腈水溶液超声处理溶解，再用20体积%乙腈水溶液进行稀释至检测所需浓度10mg/ml；5个警示结构杂质采用适量20体积%乙腈水溶液超声处理溶解，再用20体积%乙腈水溶液进行稀释至检测所需浓度0.15μg/ml。适量20体积%乙腈水溶液是指在将各种物质溶解时以其基本可以溶解的量或者稍多于可以溶解的量添加20体积%乙腈水溶液；已经发现，本发明涉及的对甲苯磺酸依度沙班一水合物、表中所示5种杂质在每1ml的20体积%乙腈水溶液中溶解量均可达到测试浓度的要求；采用上述方式用20体积%乙腈水溶液进行溶解供试品，以保证供试品中含有的相关杂质能完全溶解，以保证此方法能准确、有效的控制对甲苯磺酸依度沙班一水合物的质量。

在一个实施方案中，本发明所述的用反相高效液相色谱法分离测定对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，是以磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，采用线性梯度洗脱。

在一个实施方案中，上述所用的色谱柱选自品牌为Waters的XSelect HSS T3色谱柱。

在一个实施方案中，本发明所述的检测方法，可按以下方法实现：

(1)、取对甲苯磺酸依度沙班一水合物样品适量，加20体积%乙腈水溶液适量超声处理使溶解，再加20体积%乙腈水溶液稀释并制成每1ml中含对甲苯磺酸依度沙班一水合物10mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)、取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.15µg的溶液，作为杂质对照品溶液；

(3)、设置流动相的流速，优选流速为1.0ml/min；使用紫外检测器或二极管阵列检测器，优选紫外检测器；检测波长为：205nm；使用Waters XSelect HSS T3色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；色谱柱的柱温为：35℃；流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，线性洗脱程序见下表：

(4)、取步骤(1)、步骤(2)所得的溶液50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，从中读取杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类，杂质各色谱峰之间的分离度、各色谱峰的峰面积；

在一个实施方案中，高效液相色谱仪可以是使用岛津高效液相色谱仪LC-10ATvp/ LC-10AD/LC-20A/LC-2010AHT，也可以采用其它色谱系统。

在一个实施方案中，使用的色谱柱为C18柱，填料粒径可以是5μm；柱内径可以是4.6mm；柱长可以是250mm。

在一个实施方案中，使用的色谱柱的柱温：35℃。

在一个实施方案中，使用的流动相：流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，流动相B为乙腈。流动相A的磷酸二氢钾摩尔浓度为25mmol/L。

在一个实施方案中，流动相的流速为1.0ml/min。

在一个实施方案中，洗脱方式为线性梯度洗脱。

在一个实施方案中，使用的检测器的检测波长为205nm。

在一个实施方案中，液相检测进样体积为50μl。

本发明采用C18色谱柱，磷酸二氢钾缓冲液作为流动相A，乙腈作为流动相B，洗脱方式采用特定的线性梯度洗脱，能够有效的分离对甲苯磺酸依度沙班及其5个警示结构杂质。选用20体积%乙腈水溶液先溶解样品，再用20体积%乙腈水溶液稀释样品，以保证样品中的杂质均能有效的溶解，能够有效的将杂质分离检出。本发明解决了对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的分离及定量测定问题，从而保证了对甲苯磺酸依度沙班一水合物的质量可控。

附图说明

图1表示的是实施例1对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质准确度检测空白溶剂的HPLC图谱。

图2表示的是实施例1对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质准确度检测杂质对照品溶液（YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1）的HPLC图谱。

图3表示的是实施例1对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质准确度本底样品溶液的HPLC图谱。

图4表示的是实施例1对甲苯磺酸依度沙班一水合物警示结构杂质准确度供试品溶液（加入杂质100%浓度）的HPLC图谱。

具体实施方式

通过以下实例对本发明做进一步说明，但应该理解，以下实例不限于本发明的范围。

以下各实施例使用的试剂可从市场上容易购得。

检测方法参照高效液相法 （中国药典2015年版四部通则0512）测定。

实施例1

仪器设备样品：

检测器：紫外检测器，检测波长为205nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters XSelect HSS T3，4.6×250mm，5µm适用）

柱温：35℃；

流动相：25mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B；流动相流速：1.0ml/min

按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：

检测步骤：取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液适量超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml 中含10mg的溶液，作为供试品溶液；取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.15µg的溶液，作为杂质对照品溶液；取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，精密称定，加杂质对照品溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml 中含对甲苯磺酸依度沙班一水合物10mg的溶液，作为加入杂质100%浓度的供试品溶液；精密量取各样品溶液、空白溶剂（20体积%乙腈水溶液）各50µl注入液相色谱仪，记录色谱图；色谱图见图1～图4，杂质对照品溶液结果见表1。

由图1和图3可知，空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测；由图2可知，杂质对照品溶液中各警示结构杂质之间分离良好；由图3可知，供试品溶液中检出1个警示结构杂质（即YD-A-02杂质），其他4个警示结构杂质（YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-1）均未检出，表1实施例1的杂质对照品溶液结果：

实施例2

仪器设备样品：

检测器：紫外检测器，检测波长为205nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters XSelect HSS T3，4.6×250mm，5µm适用）

柱温：35℃；

流动相：20mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B；流动相流速：1.0ml/min

按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：

检测步骤：取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，精密称定，加50体积%乙腈水溶液适量超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml 中含15mg的溶液，作为供试品溶液；取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加50%体积乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含1µg的溶液，作为杂质对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照品溶液、空白溶剂（50体积%乙腈水溶液）各10µl注入液相色谱仪，记录色谱图；结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好。

实施例3

仪器设备样品：

检测器：紫外检测器，检测波长为205nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters XSelect HSS T3，4.6×250mm，5µm适用）

柱温：35℃；

流动相：30mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B；流动相流速：1..0ml/min

按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：

检测步骤：取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液适量超声处理溶解并定量稀释制成每1ml 中含10mg的溶液，作为供试品溶液；取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.15µg的溶液，作为杂质对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照品溶液、空白溶剂（20体积%乙腈水溶液）各100µl注入液相色谱仪，记录色谱图；结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好。

实施例4

仪器设备样品：

检测器：紫外检测器，检测波长为205nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters XSelect HSS T3，4.6×250mm，5µm适用）

柱温：35℃；

流动相：25mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至3.2）为流动相A，以乙腈为流动相B；流动相流速：1.0ml/min

按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：

检测步骤：取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液适量超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml 中含10mg的溶液，作为供试品溶液；取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.15µg的溶液，作为杂质对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照品溶液、空白溶剂（20体积%乙腈水溶液）各100µl注入液相色谱仪，记录色谱图；结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好。

实施例5

仪器设备样品：

检测器：紫外检测器，检测波长为205nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters XSelect HSS T3，4.6×250mm，5µm适用）

柱温：35℃；

流动相：25mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至2.8）为流动相A，以乙腈为流动相B；流动相流速：1.0ml/min

按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：

检测步骤：取对甲苯磺酸依度沙班一水合物适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液适量超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml 中含10mg的溶液，作为供试品溶液；取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1适量，精密称定，加20体积%乙腈水溶液超声处理使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.15µg的溶液，作为杂质对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照品溶液、空白溶剂（20体积%乙腈水溶液）各100µl注入液相色谱仪，记录色谱图；结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好。

实施例6

基本上与实施例1相同的方法，不同的是柱温箱柱温为30℃、40℃进行检测。结果与实施例1的结果基本相同，结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好，供试品溶液中警示结构杂质含量与实例1 的检测结果基本一致。

实施例7

基本上与实施例1相同的方法，不同的是流速为0.8ml/min、1.2ml/min进行检测。结果与实施例1的结果基本相同，结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好，供试品溶液中警示结构杂质含量与实例1 的检测结果基本一致。

实施例8

基本上与实施例1相同的方法，不同的是供试品溶液的浓度为0.5mg/ml、5mg/ml、15mg/ml或20mg/ml的溶液，杂质对照品溶液的浓度为0.05µg/ml、0.15µg/ml、1µg/ml或5µg/ml的溶液，进样体积100µl、50µl、20µl或10µl进行检测。结果与实施例1的结果基本相同，结果空白溶剂、依度沙班及其他杂质不干扰检测，各警示结构杂质之间分离良好，供试品溶液中警示结构杂质含量与实例1 的检测结果基本一致。

Claims (10)

1.对甲苯磺酸依度沙班一水合物中5个警示结构杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法采用反相高效液相色谱法，所述检测方法包括以下步骤：

（1）配制流动相：

流动相A：15mM～35mM磷酸盐缓冲溶液，并用酸或碱调节pH值为2.0～6.0；

流动相B：乙腈

（2）制备供试品溶液：称取对甲苯磺酸依度沙班一水合物样品，和10体积%～50体积%乙腈水溶液混合配制成供试品溶液，待用；

（3）制备杂质对照品溶液：分别称取杂质YD-Z30、YD-B-01、YD-A、YD-A-02、YD-1对照品，加入容量瓶中，和10体积%～50体积%乙腈水溶液混合配制成杂质对照品溶液，待用；

（4）分别吸取上述等量的供试品溶液和杂质对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，其色谱条件包括：

色谱柱：C18柱；

检测器：UV检测器；

检测波长：195nm～215nm；

柱温：25℃～45℃；

流速：0.7ml/min～1.3ml/min；

采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B按照如下程序进行线性梯度洗脱：

。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（4）中，所述色谱柱为：长150mm～300mm，内径3mm～10mm，填充料粒径3μm～10μm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（4）中，所述检测波长为200nm～210nm，任选地，为205nm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（4）中，所述柱温为30℃～40℃，任选地，为35℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（4）中，所述流速为0.8ml/min～1.2ml/min，任选地，为1.0ml/min。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液，浓度为20mmol/L～30mmol/L。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.0～6.0，任选地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为3.0±0.2；调节pH值用的酸可选自乙酸、甲酸、磷酸、盐酸、酒石酸和草酸中一种或多种；所述的碱选自氨水、氢氧化钠和氢氧化钾中一种或多种；任选地，用磷酸调节pH值。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，所述供试品溶液的浓度为0.5mg/ml～20mg/ml，优选地，为5 mg/ml～15mg/ml，更优选地为10mg/ml。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤（3）中，所述杂质对照品溶液中各杂质的浓度为0.05μg/ml～5μg/ml，任选地，为0.15µg/ml。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于：在所述的步骤（4）中，其中供试品溶液和杂质对照品溶液各10μl～100μl，任选地，各50μl；注入液相色谱仪。

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