CN110699382A - 一种递送siRNA的外泌体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及外泌体递送siRNA技术领域，提供一种递送siRNA的外泌体的制备方法，本发明在准备上清液的过程中将于‑80℃储存的血浆置于37℃水浴中，能够对冰冻的血浆进行融化，使其完全液态；然后通过沉淀试剂法对外泌体和血浆进行分离，并且通过离心的方式将外泌体和死亡细胞及其碎片进行去除，从而得到外泌体；然后分别分析外泌体的大小、产量、纯度、形态和标志物表达的特征，从而能够对所分离出的外泌体的特征进行表征分析，为后续封装siRNA至外泌体内的步骤做铺垫；最后通过电穿孔法将siRNA封装至所分离出的外泌体内，并通过粒度排除色谱法对游离的siRNA进行去除，从而能够得到纯度较高的封装有siRNA的外泌体，进而提高外泌体递送siRNA的效率。

Description

一种递送siRNA的外泌体的制备方法

技术领域

本发明涉及外泌体递送siRNA技术领域，具体涉及一种递送siRNA的外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体是天然的囊泡结构，真有得天独厚的生物相容性，其本身内部就含有核酸和蛋白，故近年来将外泌体作为递送系统是一个很热的研究方向。细胞外囊泡，特别是外泌体，由于其生物学起源、丰富性和内在的能力，近年来作为新型药物传递载体受到关注。siRNA为小干扰RNA，能够引起RNA干扰，其中RNA干扰是对基因转录后的表达过程进行特异性的抑制从而达到基因沉默的目的；而且外泌体作为载体，能够实现对siRNA进行递送。siRNA可以通过电穿孔成功地装载到外泌体中，然后使外泌体在体外传递到癌细胞中，该方案提供了一个标准的程序，开发装载siRNA的外泌体，以有效地传递到癌细胞内。

发明内容

解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种递送siRNA的外泌体的制备方法，旨在能够开发装载siRNA的外泌体，从而将siRNA有效地传递到癌细胞内。

技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种递送siRNA的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心20-30min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心20-30min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将所述混合物在室温下孵育10-15min后，于室温下10000×g离心5-10min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，所述分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除所述混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

更进一步地，所述S1中离心在室温条件下进行。

更进一步地，所述S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

更进一步地，所述S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。

更进一步地，所述S4中封装siRNA至外泌体内的具体操作步骤为：

1)先在冰上预冷电穿孔环30min，再按照1：60的摩尔比将外泌体和siRNA混合在微型离心管中，然后加入适量的柠檬酸缓冲液进行混合，所得记为预混合物；

2)将1)中的预混合物转移至电穿孔试管中进行电穿孔，电穿孔结束后所得即为混合物，并用移液管从试管中取出混合物进行下一步处理。

更进一步地，所述S5中去除游离siRNA的具体操作步骤为：

1)先通过两次过滤350μLPBS来平衡SEC柱，再取150μL所述混合物溶解在350μL过滤过的PBS中，并将其转移至SEC柱内进行游离siRNA去除，然后收集从SEC柱中洗脱的前500μL组分；

2)再次向SEC柱中加入500μL过滤后的PBS，并收集接下来的500μL组分；

3)重复步骤2)，直到收集到10×500μL的总份数，此时能够对混合物中游离的siRNA进行去除，得到封装有siRNA的外泌体。

有益效果

本发明提供了一种递送siRNA的外泌体的制备方法，与现有公知技术相比，本发明的具有如下有益效果：

本发明在准备上清液的过程中将于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，能够对冰冻的血浆进行融化，使其完全液态；然后通过沉淀试剂法对外泌体和血浆进行分离，并且通过离心的方式将外泌体和死亡细胞及其碎片进行去除，从而得到外泌体；然后分别分析外泌体的大小、产量、纯度、形态和标志物表达的特征，从而能够对所分离出的外泌体的特征进行表征分析，为后续封装siRNA至外泌体内的步骤做铺垫；最后通过电穿孔法将siRNA封装至所分离出的外泌体内，并通过粒度排除色谱法对游离的siRNA进行去除，从而能够得到纯度较高的封装有siRNA的外泌体，进而提高外泌体递送siRNA的效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的步骤流程图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本实施例的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心20min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心30min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将混合物在室温下孵育10min后，于室温下10000×g离心8min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

更进一步地，S1中离心在室温条件下进行。

更进一步地，S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

更进一步地，S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。

更进一步地，S4中封装siRNA至外泌体内的具体操作步骤为：

1)先在冰上预冷电穿孔环30min，再按照1：60的摩尔比将外泌体和siRNA混合在微型离心管中，然后加入适量的柠檬酸缓冲液进行混合，所得记为预混合物；

2)将1)中的预混合物转移至电穿孔试管中进行电穿孔，电穿孔结束后所得即为混合物，并用移液管从试管中取出混合物进行下一步处理。

更进一步地，S5中去除游离siRNA的具体操作步骤为：

1)先通过两次过滤350μLPBS来平衡SEC柱，再取150μL混合物溶解在350μL过滤过的PBS中，并将其转移至SEC柱内进行游离siRNA去除，然后收集从SEC柱中洗脱的前500μL组分；

2)再次向SEC柱中加入500μL过滤后的PBS，并收集接下来的500μL组分；

3)重复步骤2)，直到收集到10×500μL的总份数，此时能够对混合物中游离的siRNA进行去除，得到封装有siRNA的外泌体。

实施例2：

本实施例的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心25min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心20min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将混合物在室温下孵育15min后，于室温下10000×g离心5min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

更进一步地，S1中离心在室温条件下进行。

更进一步地，S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

更进一步地，S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。

更进一步地，S4中封装siRNA至外泌体内的具体操作步骤为：

1)先在冰上预冷电穿孔环30min，再按照1：60的摩尔比将外泌体和siRNA混合在微型离心管中，然后加入适量的柠檬酸缓冲液进行混合，所得记为预混合物；

2)将1)中的预混合物转移至电穿孔试管中进行电穿孔，电穿孔结束后所得即为混合物，并用移液管从试管中取出混合物进行下一步处理。

更进一步地，S5中去除游离siRNA的具体操作步骤为：

1)先通过两次过滤350μLPBS来平衡SEC柱，再取150μL混合物溶解在350μL过滤过的PBS中，并将其转移至SEC柱内进行游离siRNA去除，然后收集从SEC柱中洗脱的前500μL组分；

2)再次向SEC柱中加入500μL过滤后的PBS，并收集接下来的500μL组分；

3)重复步骤2)，直到收集到10×500μL的总份数，此时能够对混合物中游离的siRNA进行去除，得到封装有siRNA的外泌体。

实施例3：

本实施例的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心30min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心25min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将混合物在室温下孵育13min后，于室温下10000×g离心10min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

更进一步地，S1中离心在室温条件下进行。

更进一步地，S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

更进一步地，S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。

更进一步地，S4中封装siRNA至外泌体内的具体操作步骤为：

1)先在冰上预冷电穿孔环30min，再按照1：60的摩尔比将外泌体和siRNA混合在微型离心管中，然后加入适量的柠檬酸缓冲液进行混合，所得记为预混合物；

2)将1)中的预混合物转移至电穿孔试管中进行电穿孔，电穿孔结束后所得即为混合物，并用移液管从试管中取出混合物进行下一步处理。

更进一步地，S5中去除游离siRNA的具体操作步骤为：

1)先通过两次过滤350μLPBS来平衡SEC柱，再取150μL混合物溶解在350μL过滤过的PBS中，并将其转移至SEC柱内进行游离siRNA去除，然后收集从SEC柱中洗脱的前500μL组分；

2)再次向SEC柱中加入500μL过滤后的PBS，并收集接下来的500μL组分；

3)重复步骤2)，直到收集到10×500μL的总份数，此时能够对混合物中游离的siRNA进行去除，得到封装有siRNA的外泌体。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备上清液：先取出于-80℃储存的血浆置于37℃水浴中，完全液态后将其置于冰上；然后经2000×g离心20-30min去除细胞和碎片，再用移液枪吸取上清液至新的离心管内，再经10000×g离心20-30min；最后将所得上清液吸取至新的离心管内，并将其放置在冰上直至开始分离；

S2、分离外泌体：将S1中开始分离的上清液吸取适当体积至新的离心管中，加入0.5×上清液体积的PBS后进行涡旋混匀；然后加入0.2×(上清液体积+PBS体积)的外泌体沉淀试剂，涡旋混匀后所得记为混合物；将所述混合物在室温下孵育10-15min后，于室温下10000×g离心5-10min，弃去上清液后所得颗粒即为外泌体；

S3、外泌体的表征分析：对S2中得到的外泌体进行分析，所述分析包括以下步骤：

a、用纳米颗粒跟踪分析仪来表征外泌体大小和产量；

b、用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度；

c、采用流式细胞术检测外泌体标志物表达的特征；

d、使用透射电子显微镜表征外泌体形态；

S4、封装siRNA至外泌体内：通过电穿孔将siRNA封装到经过S3表征分析后的外泌体中，所得记为混合物；

S5、去除游离siRNA：采用粒度排除色谱法去除所述混合物中游离的siRNA，所得即为封装有siRNA的外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中离心在室温条件下进行。

3.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S2中PBS优选为1×PBS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S3中在外泌体的表征分析过程中，需要对分析结果进行记录。

5.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S4中封装siRNA至外泌体内的具体操作步骤为：

1)先在冰上预冷电穿孔环30min，再按照1：60的摩尔比将外泌体和siRNA混合在微型离心管中，然后加入适量的柠檬酸缓冲液进行混合，所得记为预混合物；

2)将1)中的预混合物转移至电穿孔试管中进行电穿孔，电穿孔结束后所得即为混合物，并用移液管从试管中取出混合物进行下一步处理。

6.根据权利要求1所述的一种递送siRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，所述S5中去除游离siRNA的具体操作步骤为：

1)先通过两次过滤350μLPBS来平衡SEC柱，再取150μL所述混合物溶解在350μL过滤过的PBS中，并将其转移至SEC柱内进行游离siRNA去除，然后收集从SEC柱中洗脱的前500μL组分；

2)再次向SEC柱中加入500μL过滤后的PBS，并收集接下来的500μL组分；

3)重复步骤2)，直到收集到10×500μL的总份数，此时能够对混合物中游离的siRNA进行去除，得到封装有siRNA的外泌体。

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