CN110592112B - 班氏跳小蜂葡糖脱氢酶gld基因及其扩增用引物组合和克隆方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法,属于分子生物学以及基因克隆技术领域。所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。该基因的获得可以进一步研究该基因在班氏跳小蜂细胞中的组成及基因结构,并为其在班氏跳小蜂生殖生理中的作用和功能区域位置,以及与其他物种的区别提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及基因克隆技术领域,尤其涉及班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法。
背景技术
葡糖脱氢酶Glucose dehydrogenase(GLD)是一类结构功能多样的小肽分子,分子量大小为2Kbp左右,等电点介于5~7之间。该基因广泛分布于节肢动物体内,在卵和幼虫阶段,该基因分布在昆虫的诸多表皮衍生组织中,包括一些体壁繁殖器官中;然而,在成虫阶段,该基因仅保守分布于某些生殖器官中,如受精囊。对于寄生蜂雌蜂而言,因其吸收和释放的精子数量与受精卵的数量密切相关。GLD基因可通过影响受精囊内精子储存和释放量,来提高雌性的受精能力。
班氏跳小蜂Aenasius bambawalei是重要外来入侵性害虫——扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis的优势种寄生蜂。目前,班氏跳小蜂种群的室内大量饲养和繁殖存在较多技术瓶颈,其中种群退化和子代偏雄性是制约该蜂研究与应用的重要因素。而提高雌蜂的受精能力,可以有效解决以上问题。
目前未见关于班氏跳小蜂GLD基因的相关研究报道,NCBI数据库中关于其他寄生蜂GLD基因的序列亦为预测序列,尚无准确的序列上传记录及相关的文献报道。
发明内容
鉴于背景技术中存在的问题,本发明的目的在于提供班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因,所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了用于班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因扩增的引物组合,包括上游引物和下游引物,所述上游引物包括A-Gld-P 1F,其核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示;所述下游引物包括A-Gld-P 2R,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的,所述上游引物还包括A-Gld-P 2F,其核苷酸序列如SEQ ID No.3 所示;所述下游引物还包括A-Gld-P 1R,其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的,所述上游引物还包括A-Gld-P 2F,其核苷酸序列如SEQ ID No.3 所示;所述下游引物还包括A-Gld-P 1.1R,其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明提供了一种克隆班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因的方法,包括如下步骤:
(1)提取班氏跳小蜂基因组DNA,得到扩增用模板DNA;
(2)用上述的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)对所述扩增产物进行测序,得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。
优选的,步骤(2)所述PCR扩增包括反应A和反应B;
所述反应A为:用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增;
所述反应B为:用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。
优选的,所述反应A和反应B使用的酶独立为高保真DNA聚合酶。
优选的,步骤(2)所述PCR扩增包括反应A’和反应B;
所述反应A’为:用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1.1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增;
所述反应B为:用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。
优选的,所述反应A’使用的酶为Taq酶。
有益效果:本发明提供了班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法。所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。该基因的获得可以进一步研究该基因在班氏跳小蜂细胞中的组成及基因结构,并为其在班氏跳小蜂生殖生理中的作用和功能区域位置,以及与其他物种的区别提供理论依据。
附图说明
图1为本发明实施例1所述班氏跳小蜂GLD基因CDS区PCR产物经1%凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因,所述GLD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明通过对班氏跳小蜂GLD基因CDS区进行预测,然后针对预测序列进行引物设计,再通过PCR扩增克隆,得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因 (包括完整CDS区序列)的表达序列。该基因的获得可以进一步研究该基因在班氏跳小蜂细胞中的组成及基因结构,并为其在班氏跳小蜂生殖生理中的作用和功能区域位置,以及与其他物种的区别提供理论依据。
本发明提供了用于班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因扩增的引物组合,包括上游引物和下游引物,所述上游引物包括A-Gld-P 1F,其核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示;所述下游引物包括A-Gld-P 2R,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。在本发明中,所述A-Gld-P 1F是基于起始密码子前段130bp内的部分设计得到;所述A-Gld-P 2R是基于TAA之后130bp的外显子部分设计得到。
本发明所述上游引物优选还包括A-Gld-P 2F,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;所述下游引物优选还包括A-Gld-P 1R或A-Gld-P 1.1R,所述 A-Gld-P 1R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述A-Gld-P 1.1R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。在本发明中,所述A-Gld-P 2F能和A-Gld-P 2R 组成新的引物对;所述A-Gld-P 1R或A-Gld-P 1.1R的能和A-Gld-P 1F组成新的引物对。由于GLD基因片段较长,中间引物(A-Gld-P 2F、A-Gld-P 1R 或A-Gld-P 1.1R)的加入能对GLD基因进行分段扩增,进而有助于扩增得到更为完整、准确的GLD基因序列。
本发明还提供了一种克隆班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因的方法,包括如下步骤:
(1)提取班氏跳小蜂基因组DNA,得到扩增用模板DNA;
(2)用上述提供的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)对所述扩增产物进行测序,得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。
本发明先提取班氏跳小蜂基因组DNA,得到扩增用模板DNA。本发明对班氏跳小蜂基因组DNA的提取方法不作特别限定,本领域常规操作即可。
得到扩增用模板DNA后,本发明用上述提供的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增,得到扩增产物。
在本发明中,所述PCR扩增优选包括反应A和反应B;所述反应A为:用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1R对所述扩增用模板DNA进行 PCR扩增;所述反应B为:用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R 对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。
在本发明的一种优选方案中,所述反应A和反应B使用的酶独立优选为高保真DNA聚合酶。在本发明中,所述反应A的反应体系优选为:模板 1μL,10μmol/L上游引物A-Gld-p1F和下游引物A-Gld-p 1R各2μL,2×Phata Max Master Mix 25μL,用PCR水将反应体系补充至50μL;所述反应A的程序优选为:1个循环,95℃变性2min;30个循环,94℃变性15s,59℃退火 15s,72℃延伸35s;1个循环,72℃延伸5min;4℃保温。所述反应B的反应体系优选为:模板1μL,10μmol/L上游引物A-Gld-p 2F和下游引物A-Gld-p 2R各2μL,2×Phata MaxMaster Mix 25μL,用PCR水将反应体系补充至50μL。所述反应B的程序优选为:1个循环,95℃变性2min;30个循环,94℃变性15s,58℃退火15s,72℃延伸35s;1个循环,72℃延伸5min;4℃保温。
在本发明的另一种优选方案中,所述PCR扩增包括反应A’和反应B;所述反应A’为:用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1.1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增;所述反应B为:用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。
在本发明中,所述反应A’使用的酶优选为普通Taq酶。在本发明中,所述反应A’的反应体系优选为:模板1μL,10μmol/L上游引物A-Gld-p 1F和下游引物A-Gld-p 1.1R各2μL,2×Phata Max Master Mix 25μL,用PCR水将反应体系补充至50μL;所述反应A的程序优选为:1个循环,95℃变性2min; 30个循环,94℃变性15s,59℃退火15s,72℃延伸35s;1个循环,72℃延伸5min;4℃保温。
得到扩增产物后,本发明对所述扩增产物进行测序,得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。本发明对具体的测序方法不作特别限定,本领域常规操作均可。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)班氏跳小蜂基因组DNA的提取
取5头班氏跳小蜂雌成虫全虫进行基因组DNA的提取,提取方法参照 TIANamp公司Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。
(2)班氏跳小蜂GLD基因CDS区序列引物设计
根据本实验室已有的班氏跳小蜂GLD基因转录组数据,并参照NCBI数据库预测的班氏跳小蜂近似种蝇蛹金小蜂GLD基因序列(GenBank登录号为: XM_016982053),对班氏跳小蜂GLD基因CDS区进行预测,针对预测序列进行引物设计,设计的引物序列如下:在起始密码子前段130bp内(序列如下)设计上游扩增引物(A-Gld-p1F:ctcgcagtacactcgcaaac),并在TAA之后 130bp左右的外显子上设计下游引物(A-Gld-p2R:aacaggttggagtgcgagag)。
同时,由于扩增片段较长,需要在中间设计1对引物,分别为A-Gld-p1R:atccccgacagcatgagcag和A-Gld-p2F:cgagaactggactacaacgc。
(3)用高保真DNA聚合酶对2个大片段进行PCR扩增。
在后续测序中,发现目标片段1(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)中存在缺失的情况,因此新设计引物A-Gld-p1.1R(序列:catgctgtagagggtgctgg),与A-Gld-p1F一起用普通Taq酶对目标片段1进行2轮扩增,TA克隆后测序。
通对PCR产物以及TA克隆的测序,分别获得了片段1(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)、片段2(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)、片段3(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)、片段4(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)的核酸序列。然后,对以上片段进行拼接,共获得2204(2203)bp的有效的基因组序列,包含完整的CDS序列,ATG之前获得122bp的有效基因组序列, TGA之后获得77bp的有效基因组序列
结果:预扩增片段长度为2204bp,其中包含完整CDS区及部分UTR区。
(4)班氏跳小蜂GLD基因CDS区序列的PCR扩增
利用上下游引物进行PCR扩增。
反应体系1为:模板1μL,10μmol/L上游引物A-Gld-p1F和下游引物A-Gld-p1.1R各2μL,2×Phata Max Master Mix 25μL,用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件如下:1个循环,95℃变性2min;30个循环,94℃变性15s,59℃退火15s,72℃延伸35s;1个循环,72℃延伸5min;4℃保温。
反应体系2为:模板1μL,10μmol/L上游引物A-Gld-p2F和下游引物 A-Gld-p2R各2μL,2×Phata Max Master Mix 25μL,用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件如下:1个循环,95℃变性2min;30个循环,94℃变性15s, 58℃退火15s,72℃延伸35s;1个循环,72℃延伸5min;4℃保温。
(5)测序
班氏跳小蜂GLD基因CDS区PCR产物经1%凝胶电泳后的结果见图1。用诺唯赞公司的DNA胶回收试剂盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit进行回收纯化,纯化产物按照TaKaRa公司pMD19-T Vector试剂盒说明书进行操作,采用蓝白斑法筛选克隆产物,最终送生物公司测序。
结果:扩增目的片段长度为2204(2203)bp,包含完整的CDS序列,ATG 之前获得122bp的有效基因组序列,TGA之后获得77bp的有效基因组序列。所构建的重组质粒序列与NCBI数据库剪辑变异体序列比对相符,说明班氏跳小蜂GLD基因CDS区序列克隆成功。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因及其扩增用引物组合和克隆方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgcagtac actcgcaaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacaggttgg agtgcgagag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgagaactgg actacaacgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccccgaca gcatgagcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catgctgtag agggtgctgg 20
<210> 6
<211> 2204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgcagtac actcgcaaac tttcaataaa aagtccaatt tctcggcgta gatccaatta 60
attggaatta accatcctgg agaagaaaat tggtcgttgg aatttgcgaa ggaggaaggg 120
ccatgtcttg ttcgcagagc agcacggacg cgcggatttg caggcccgac tcctgcagct 180
cgtccgccct gacttttctc gcgctgctct cccactacct cggctactcg tacgaccaga 240
atttcaaact cgtcagcgag gagagcgagt ccacggagtt cgacttcata gtcgtgggcg 300
cgggcagcgc cggctgcgtc gtcgcgaatc gcctcagcga gaacgccaac tggagcgtag 360
gttgcacact ctcttgtatt ccccccgagc tcccgggctt cggccgagct aatacgccgc 420
ggcgtgcgcg caggttctgt tgctggaggc gggcccggag gagccggcca tcgccgacag 480
ccccggactg atgcacctgc tctgggccag cgagctcaac tacggctaca ggacgcagcc 540
ggaggcccgg gcctgcggcg accagccggg ccgcacctgt aactgggtcc gtggccgggt 600
catgggcggc tccagcaccc tctacagcat gcacgtggtg cgcggcaacc gctgggacta 660
cgaccactgg gcgagcctgg gcaacccggg ctggagctgg gccgaggtgc tgccctactt 720
caagaagtcc gaggacttcc ggatccccga ggtgagtagt gctggctgcg gtagcagagg 780
cagcccccgc tccgtttccc ctccccgttc tcggcttcta cggctgcaac tcgtcttcct 840
cgggcgcagg tgctgcgcga gtccggccag ttccacggga ccggcggcta ccagagcatc 900
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atgctcgcgg gcgcccggca gagcgccaac ggggccttcc tccggccgat ccgcggccgc 1080
cggccgaacc tgcagctccg ggcgaacagc cgggtcgtcc ggctgctgct cgacccgagc 1140
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ctctacgcgc gcaaggaggt cgtcctctcg gccggcgtca tcgactccgc gaagctgctc 1260
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ctgcggacga gcttcgagcc ccggccggag ctgccggacg tccaggtcgg ctacatcaag 1560
tacgcgcgcg aggccggccg cggggcctgc cgcacccacc tgccctacta cgagggcttc 1620
ctgctgacga gcctgtacct cgcgcccaag agccggggcg agctgctgct gaacagctcg 1680
gacccgctgg ccggccagcc gctcatacgc gccaactact tctcggagcc ggaggacctg 1740
ctcgccctgg cggaggcggc gcggctcact cgccggctgc tccgcacccg ggcggccggg 1800
cgcgccggct tcgtcgcgag caggctgccg ggcccgctct gcgaccacct cgagttcgag 1860
tccgagccgt actaccgctg cctcgcgtac aactacacgg gcatcatcca ccacgaggtg 1920
ggcacttgta aaatgggccc ggccaatgac cccggggccg tggtcgaccc caggctcagg 1980
gtccacggcg tcgccgggct cagggtcgtc gacgcctcga tcatgccggt cctgccccgg 2040
ggcaacaccc aggcgcccac tgtgatgatt ggcgagaagg gcagcgacct catcaagcaa 2100
gactggatgg gagtagcggg caattgagtg tcccggaccc gattctcctg gatccgtccc 2160
atcctccttc ttggtcactc cccgtgcaat taccactgcc gcat 2204
<210> 7
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgacgtagct gcagtcgacg attcatgctg tagagggtgc tggagccgcc catgacccgg 60
ccacggaccc agttacaggt gcggcccggc tggtcgccgc aggcccgggc ctccggctgc 120
gtcctgtagc cgtagttgag ctcgctggcc cagagcaggt gcatcagtcc ggggctgtcg 180
gcgatggccg gctcctccgg gcccgcctcc agcaacagaa cctgcggcac gccttggcgt 240
attagctcgg ccgaagcccg cgagctcggg gggaatacaa gagagtgtgc aacctacgct 300
ccagttggcg ttctcgctga ggcgattcgc gacgacgcag ccggcgctgc ccgcgcccac 360
gactatgaag tcgaactccg tggactcgct ctcctcgctg acgagtttga aattctggtc 420
gtacgagtag ccgaggtagt gggagagcag cgcgagaaaa gtcagggcgg acgagctgca 480
ggagtcgggc ctgcaaatcc gcgcgtccgt gctgctctgc gaacaagaca tggcccttcc 540
tccttcgcaa attccaacga ccaattttct tctccaggat ggttaattcc aattaattgg 600
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agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 720
aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 780
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ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 900
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tcagggataa cgcaggaaga catgtgagca aaaggccagc aaaagccagg accgtaaaag 1080
gcgcgttgct ggcgttttca tagctccgcc cccctgacga gcatcacaaa atcgacgctc 1140
aagtcagagg tgggcgaacc cgacaggaac tattaaagg 1179
<210> 8
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacgaagct gcagtcgacg attcatgctg tagagggtgc tggagccgcc catgacccgg 60
ccacggaccc agttacaggt gcggcccggc tggtcgccgc aggcccgggc ctccggctgc 120
gtcctgtagc cgtagttgag ctcgctggcc cagagcaggt gcatcagtcc ggggctgtcg 180
gcgatggccg gctcctccgg gcccgcctcc agcaacagaa cctgcgcgca cgccgcggcg 240
tattagctcg gccgaagccc gggagctcgg ggggaataca agagagtgtg caacctacgc 300
tccagttggc gttctcgctg aggcgattcg cgacgacgca gccggcgctg cccgcgccca 360
cgactatgaa gtcgaactcc gtggactcgc tctcctcgct gacgagtttg aagttctggt 420
cgtacgagta gccgaggtag tgggagagca gcgcgagaaa agtcagggcg gacgagctgc 480
aggagtcggg cctgcaaatc cgcgcgtccg tgctgctctg cgaacaagac atggcccttc 540
ctccttcgca aattccaacg accaattttc ttctccagga tggttaattc caattaattg 600
gatctacgcc gagaaattgg actttttatt gaaagtttgc gagtgtactg cgagaatctc 660
tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 720
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 780
cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 840
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 900
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 960
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacgggtt atccacagaa 1020
tcaggggata acgcaggaaa gacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggacgtaaa 1080
aaggcgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc ctgacgagca tcacaaaaat 1140
cgacgcctca agtcagaggg tggcgaagct cgaacaggga ctatataaag gaaataacca 1200
gggcgttttt ctctctctgg cagt 1224
<210> 9
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggccgagagg acgacctcct tgcgcgcgta gagccggcgc agccgcggcg gggagcccgg 60
ggcccggtac tccacgccga gggcccgact gccgctcggg tcgagcagca gccggacgac 120
ccggctgttc gcccggagct gcaggttcgg ccggcggccg cggatcggcc ggaggaaggc 180
cccgttggcg ctctgccggg cgcccgcgag catcgcgtac tgcagccggg cggtgcccag 240
gttgtcgccg gcgttgtagt ccagttctcg cagcccgagc tccttccagg cctccagcag 300
gacctgggcg ttcgggtcga agcgctcggc ctcgatgctc tggtagccgc cggtcccgtg 360
gaactggccg gactcgcgca gcacctgcgc ccgaggaaga cgagttgcag ccgtagaagc 420
cgagaacggg gaggggaaac ggagcggggg ctgcctctgc taccgcagcc agcactactc 480
acctcgggga tccggaagtc ctcggacttc ttgaagtagg gcagcacctc ggcccagctc 540
cagcccgggt tgcccaggct cgcccagtgg tcgtagtccc agcggttgcc gcgcaccacg 600
tgcatgctgt agagggtgct ggagccgccc atgacccggc cacggaccca gttacaggtg 660
cggcccggct ggtcgccgca ggcccgggcc tccggctgcg tcctgtagcc gtagttgagc 720
tcgctggccc agagcaggtg catcagtccg gggctgtcgg cgatggccgg ctcctccggg 780
cccgcctcca gcaacagaac c 801
<210> 10
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctgcagta cgcgatgctc gcgggcgccc ggcagagcgc caacggggcc ttcctccggc 60
cgatccgcgg ccgccggccg aacctgcagc tccgggcgaa cagccgggtc gtccggctgc 120
tgctcgaccc gagcggcagt cgggccctcg gcgtggagta ccgggccccg ggctccccgc 180
cgcggctgcg ccggctctac gcgcgcaagg aggtcgtcct ctcggccggc gtcatcgact 240
ccgcgaagct gctcatgctg tcggggatcg ggcccgcccg gaacctccgg gagtccggca 300
tccccctggt ccgggagctg cccgtcggcc ggaacctgca gaaccacgtc tcgatcacgc 360
cgctcgtggt gcggctggcc aacagctccg ggcccggctt cgacttccgc gagatggagc 420
gcgacctcgt ctactggctg agcgcccggc ggggccccat gcgggagaac ggcttcatgg 480
acaacgtggc cttcctgcgg acgagcttcg agccccggcc ggagctgccg gacgtccagg 540
tcggctacat caagtacgcg cgcgaggccg gccgcggggc ctgccgcacc cacctgccct 600
actacgaggg cttcctgctg acgagcctgt acctcgcgcc caagagccgg ggcgagctgc 660
tgctgaacag ctcggacccg ctggccggcc agccgctcat acgcgccaac tacttctcgg 720
agccggagga cctgctcgcc ctggcggagg cggcgcggct cactcgccgg ctgctccgca 780
cccgggcggc cgggcgcgcc ggcttcgtcg cgagcaggct gccgggcccg ctctgcgacc 840
acctcgagtt cgagtccgag ccgtactacc gctgcctcgc gtacaactac acgggcatca 900
tccaccacga ggtgggcact tgtaaaatgg gcccgggcaa tgaccccggg gccgtggtcg 960
accccaggct caggtccacg ggcgtcgcgg ctcagggtcg tcgacgctcg atcatgccgg 1020
tcctgccccg gggcacacca gcgccactgt gatgattgcg agagggcagc gactcatcag 1080
cagactgaat gggagtagcg gccatgagtg tcccgacccg atctcctgga tcgtcccatc 1140
ctccttcttg gtcactccca t 1161
<210> 11
<211> 860
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagatgcggc agtggtaatt gcacggggag tgaccaagaa ggaggatggg acggatccag 60
gagaatcggg tccgggacac tcaattgccc gctactccca tccagtcttg cttgatgagg 120
tcgctgccct tctcgccaat catcacagtg ggcgcctggg tgttgccccg gggcaggacc 180
ggcatgatcg aggcgtcgac gaccctgagc ccggcgacgc cgtggaccct gagcctgggg 240
tcgaccacgg ccccggggtc attggccggg cccattttac aagtgcccac ctcgtggtgg 300
atgatgcccg tgtagttgta cgcgaggcag cggtagtacg gctcggactc gaactcgagg 360
tggtcgcaga gcgggcccgg cagcctgctc gcgacgaagc cggcgcgccc ggccgcccgg 420
gtgcggagca gccggcgagt gagccgcgcc gcctccgcca gggcgagcag gtcctccggc 480
tccgagaagt agttggcgcg tatgagcggc tggccggcca gcgggtccga gctgttcagc 540
agcagctcgc cccggctctt gggcgcgagg tacaggctcg tcagcaggaa gccctcgtag 600
tagggcaggt gggtgcggca ggccccgcgg ccggcctcgc gcgcgtactt gatgtagccg 660
acctggacgt ccggcagctc cggccggggc tcgaagctcg tccgcaggaa ggccacgttg 720
tccatgaagc cgttctcccg catggggccc cgccgggcgc tcagccagta gacgaggtcg 780
cgctccatct cgcggaagtc gaagccgggc ccggagctgt tggccagccg caccacgagc 840
ggcgtgatcg agacgtggtt 860
Claims (5)
1.一种班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因,其特征在于,所述GLD基因的核苷酸序列如SEQID No.6所示。
2.用于扩增权利要求1所述班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因的引物组合,其特征在于,包括上游引物组合和下游引物组合,所述上游引物组合包括上游引物A-Gld-P 1F和上游引物A-Gld-P 2F,所述上游引物A-Gld-P 1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述上游引物A-Gld-P 2F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
所述下游引物组合包括下游引物A-Gld-P 2R和下游引物A-Gld-P 1.1R,所述下游引物A-Gld-P 2R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述下游引物A-Gld-P 1.1R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
3.一种克隆权利要求1所述班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取班氏跳小蜂基因组DNA,得到扩增用模板DNA;
(2)用权利要求2所述的引物组合对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)对所述扩增产物进行测序,得到班氏跳小蜂葡糖脱氢酶GLD基因序列。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述PCR扩增包括反应A’和反应B;
所述反应A’为:用上游引物A-Gld-P 1F和下游引物A-Gld-P 1.1R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增;
所述反应B为:用上游引物A-Gld-P 2F和下游引物A-Gld-P 2R对所述扩增用模板DNA进行PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述反应A’使用的酶为Taq酶。
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Applications Claiming Priority (1)
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