CN110547195A

CN110547195A - 一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法

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Publication number: CN110547195A
Application number: CN201910902614.1A
Authority: CN
Inventors: 梁慧敏; 李成龙; 韩鹏; 梁栋; 夏阳; 贾思振; 李双云; 郭彩红
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-09-23
Also published as: CN110547195B

Abstract

本发明公开一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，包括如下步骤：1）选择空气凤梨种荚采集的时间；2）种荚的消毒灭菌；3）种荚的处理；4）丛生芽培养；5）芽增殖培养；6）壮苗生根培养；7）无菌苗的炼苗与移栽。本发明一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法具有操作简单，种子萌发率高，繁殖系数较大，种苗生长健壮整齐一致，生长速度快，移栽种苗室外成活率高，有利于大规模工厂化生产等优点。

Description

一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法。

背景技术

空气凤梨是一类无需种植在土壤中、无需根吸收水肥、而只通过叶片就能吸收大气中的水分和养分，且能满足自身生长发育的缩根植物。其种类繁多，株型形态各异，千姿百态，花叶多彩艳丽，极具个性美。空气凤梨不仅具有观赏性强，装饰效果好等优点，还具有吸收甲醛、苯烯物、CO₂等强大的净化空气的功能。由于这些特点，其作为观赏植物越来越受到人们的青睐，潜在商机不可估量。早在20世纪初空气凤梨在海外就受到广泛重视，如美国、危地马拉和日本等都有专业从事空气凤梨研究的苗圃和机构，有些还有专门的管理研发团队及大型智能温室，进行空气凤梨的种植生产和装饰工艺品的开发和销售。气凤梨一经引进中国市场，就因生长方式奇特、无土栽培洁净、且可随意放置或制作成植物窗帘、植物壁画、植物贺卡等受到广大消费者的喜爱，并走出展示的温室在市场上崭露头角，市场前景也是非常广阔。

但由于国内引进空气凤梨较晚，种源较少，从事空气凤梨开发生产的机构也少，栽培管理技术很不成熟，致使相关方面的研究报道亦少。目前制约空气凤梨开发推广应用的主要因素是种苗较少、价格较贵，尤其是一些稀有种源。空气凤梨的繁殖方式主要有三种：分株繁殖，播种繁殖和组织培养(丁久玲等，2010)。分株繁殖是最常用的方式，一般在花后强健的母株会长出一到数个侧芽，当侧芽生长至母株的1/3-1/2大小时分离最佳，但子株数量的多少易受品种、栽培环境等因素的影响，所以分株繁殖子株数量有限，繁殖系数很低；空气凤梨的种子繁殖可自花授粉也可异花授粉，授粉成功后到看到种荚及种荚成熟需经过2-30个月，视品种而定；果实为荚果，荚果成熟后会纵向裂开，散出带羽状冠毛的种子；空气凤梨播种育苗的难度极大，一般要求种子采收后尽快播种，放置时间越长发芽率越低；种子是否发芽及小苗能否正常生长极易受湿度、温度及通风等环境变化的影响，初期种苗非常脆弱，生长也极缓慢，一般2年内的种苗不允许随意移苗及喷洒任何化学物质和肥料，否则会导致种苗大批死亡；不同地区因气候湿度不同，要求的管理水平也不一样，采用的基质也不同，也制约了其它地方播种繁殖的发展。此外空气凤梨因大多品种为异花授粉，杂种后代性状易发生分离，也难以和母本性状保持一致；这些均大大增加了空气凤梨尤其是优良稀有种质资源的商业化生产和产业化开发的难度。植物组培快繁技术，可为空气凤梨工厂化育苗及产业化开发提供一条行之有效的途径，但目前这方面的研究报道非常少。李宁比较了空气凤梨斯垂科特种子在MS培养基、无糖MS培养基和单一的琼脂培养基上的生长，结果表明在这3种培养基上斯垂科特种子均能长出幼苗，但MS培养基幼苗生长最快；在添加生长素(NAA和IBA)的MS培养基中斯垂科特种苗明显较未添加的生长要快，叶片数要多；在MS培养基中添加细胞分裂素(6-BA)类生长调节剂对于斯垂科特种苗生长无促进作用。李鹏公开了一种空气凤梨组织培养快繁方法发明专利，说明是解决了现有技术中存在的外植体消毒困难、诱导愈伤组织困难的问题，使生长速度比自然状态下提高3倍，出苗率提高4倍以上。但上述报道无论是在空气凤梨品种数量上还是方法技术上及培养基配方配比等方面均与本发明差距很大，其实验结果及效果也大(或完全)不一样。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，包括如下步骤：

1)选择空气凤梨种荚采集的时间：在种荚呈绿色还在纵向伸长生长阶段不宜取材，当种荚长度不再变化，颜色由绿色转向绿褐色，还未炸裂时均可作为外植体材料取材，其中以绿色略带褐红色的种荚为最优选材；

2)种荚的消毒灭菌：将种荚放在洗衣粉中浸泡15～20min后流水冲洗1-2h，再用次氯酸钠液消毒10-15min，灭菌水冲洗后吸干表面水分，拿到超净工作台上备用；在超净工作台上，分别用下述消毒液消毒灭菌：先用70-75％酒精浸泡30s，之后放入0.1％的升汞或0.1％升汞+2-3滴吐温中消毒8-12分钟，无菌水冲洗10次以上，用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种；

3)种荚的处理：将上述消毒灭菌后的种荚，用剪刀分别在种荚前段的1/3处、1/2处和3/4处剪断，将种子接种在琼脂7％+GA₃3-5.0mg/L的诱导种子萌发培养基上；

4)丛生芽培养：将步骤3)获得的种子接种在添加不同种类浓度激素及不同浓度的MS培养基上，在无菌自然光下培养28-30天得到丛生芽苗；

5)芽增殖培养：将丛生芽苗分成单株，转入芽增殖培养基中，分别在1500-2000LX光下培养14h/d左右，28-30天后统计芽增殖倍数及芽苗生长发育情况；

6)壮苗生根培养：28-30天后再将小芽苗转入壮苗生根培养基，小芽苗长成具有多个茎叶根的正常植株；

7)无菌苗的炼苗移与栽：将上述生长正常健壮的植株瓶口封口膜揭开室内炼苗2-3d，之后取出小植株，洗净植株上附着的培养基，散放于温室大棚的穴盘中，适当遮荫，并及时喷水，保持种苗处在较湿润且透气地状态，直到小植株适应新环境并开始正常生长，20d后统计成活率。

其中，作为进一步优选，所述步骤3)中的种荚的处理：将上述消毒灭菌后的种荚，用剪刀分别在种荚前段的1/2处剪断，将种子接种在琼脂7％+GA₃3-5.0mg/L的诱导种子萌发培养基上。

其中，作为进一步优选，所述步骤4)中的不同种类浓度激素及不同浓度的MS培养基为1/2Ms+GA3.0mg/L+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L或Ms+GA3.0mg/L+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L。

其中，作为进一步优选，所述步骤5)芽增殖培养基为Ms+6-BA0.2-0.8mg/L+NAA0.1mg/L。

其中，作为更进一步优选，所述步骤5)芽增殖培养基为Ms+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L或Ms+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L或Ms+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L中的一种。

其中，作为进一步优选，所述步骤6)壮苗生根培养基为：Ms+6-BA0.1mg/L+IBA0.2-0.5mg/L。

其中，作为更进一步优选，所述步骤4)中的不同种类浓度激素及不同浓度的MS培养基为1/2Ms+GA3.0mg/L+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L，所述步骤5)的芽增殖培养基为Ms+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L，所述步骤6)的壮苗生根培养基为：Ms+6-BA0.1mg/L+IBA0.5mg/L。

有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明的一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法具有操作简单，种子萌发率高，繁殖系数较大，种苗生长健壮整齐一致，生长速度快，移栽种苗室外成活率高，有利于大规模工厂化生产等优点。

附图说明

图1消毒灭菌的三色花种荚；

图2消毒灭菌的松萝种荚；

图3剪断种子顶端冠毛的种荚；

图4被剪断的具顶端冠毛的种荚；

图5初期萌动的种子；

图6种苗的生长；

图7壮苗生根培养；

图8无菌苗炼苗移栽。

具体实施方式：

下面通过实施例来进一步阐述本发明。

本发明实施例中的所有培养温度均在20-28℃之间，没有特别说明，培养基PH5.8，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L。本发明使用的品种有：大气花T.Aeranthc Hybrid，花中花T.intermedia，贝克利T.brachycaulos，三色花(线叶铁兰)T.tricolor，柳叶T.balbisiana，卡比塔塔T.capitata，大天堂T.pseudobailey，琥珀T.schideeana，美杜莎T.caput-medusage，富士T.festucoides Clump，万汉T.van-hyning，犀牛角T.Seleriana，紫罗兰T.Aeranthos，阿珠伊T.Araujei，贝姬T.Bergeri，哈里斯T.Harrisii，范伦铁诺T.velutina，大三色T.juncea，斯垂科特T.stricta；T.montana蒙大拿，T.bulbosa章鱼；T.Usneoides松萝类(包括细叶、卷叶、巴西、墨西哥松萝等品种)，T.Ionantha精灵类(包括维多利亚、水蜜桃、哈密瓜、福果、华美路拉、小精灵、墨西哥、花生米、德鲁伊、危地马拉、全红、火焰、长颈、多国、高丝、白化、手榴弹、锥头、罗西塔、线艺等品种)等共计45个品种。

实施例1：种荚不同处理方式对种子染菌率和萌发生长的影响

依空气凤梨的上述的45个品种开花时间选择各园艺类结荚未炸裂的绿带紫红等色种荚，依据种荚大小放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗1-2h，再用2％次氯酸钠液消毒10-15min，灭菌水冲洗3次后吸干表面水分，在超净工作台上，分别用75％酒精浸泡30s，之后放入0.1％升汞+2滴吐温消毒液中消毒8-12分钟，无菌水冲洗至少10遍，用灭菌吸水纸擦干水分之后备用(图1、图2)；用剪刀分别在种荚前段的1/3处、1/2处和3/4处剪断种子顶端黄白色的冠毛(图3、图4)，掏出种子接种在琼脂7％+GA₃3-5.0mg/L的诱导种子萌发培养基上，每瓶接种10粒，共接种10瓶，自然光下培养15d左右统计种子染菌率；30d左右观察种子的萌发生长情况。统计结果见表1(三色花为例)。

表1种荚不同处理方式对种子染菌率和萌发生长的影响

由表1可以看出：种荚不同的处理方式，对种子染菌率、萌发率和种苗生长均有影响；如处理1当种荚前段剪去1/3时，导致种子顶端的长冠毛大部分都被剪去，只保留了种子部分，这样尽管减少了外植体感染的面积，降低了感染率，有利于种子掏出，但种子长冠毛结构的消失，使得本来依赖长冠毛结构有利于种子粘附在培养基上并有助于种子保湿及吸收营养的作用也同时减弱，直接表现为种子萌发率降低，种苗生长不良；处理2当种荚前段剪去1/2时，种子保留部分冠毛，外植体染菌率未明显提高，但种子萌发率和种苗生长状况都显著好于处理1；而处理3当种荚前段剪去3/4时，种子长冠毛结构基本保存，尽管有利于种苗生长，但外植体染菌率明显提高；通过上述实验得出，最好的种荚处理方式是处理2，其他品种的染菌情况、种子萌发情况和种苗生长情况和三色花类似，所以下面实施例均采用处理2。

此外，根据观察发现，成熟度较低的绿色种荚种子接种在培养基中添加GA₃5.0mg/L效果较好；而成熟度较高的绿黄褐色种荚种子接种在培养基中添加GA₃3.0mg/L效果更好。

实施例2：不同培养基配方对种子的丛生芽率及愈伤化程度的影响：

选取成熟度较高的绿黄褐色种荚经实施例1的处理2处理后，将无菌种子接种在MS不同浓度及不同种类浓度激素的培养基上，每瓶接种10粒种子，每种培养基配方接种10瓶，在无菌自然光下培养28-30天，统计种子的丛生芽率及愈伤化程度(表2，以三色花为例)，其中以D1和D2作为对照。

表2不同培养基配方对种子的丛生芽率及愈伤化程度的影响

由表2可以看出：配方D1因为培养基中没有添加营养，所以没有丛生芽和愈伤组织，只有一颗弱苗；D2因为培养基中添加营养，所以有1到2个芽苗，但无愈伤组织形成；1/2Ms和Ms培养基对丛生芽率和愈伤化程度的影响无显著差异，所以均可用；但K1到K10培养基中因为添加的生长素和细胞分裂素浓度不同，尽管均有丛生芽产生，但丛生芽数量和愈伤化程度不同。其他品种的丛生芽率和愈伤化程度与三色花的结果类似，到底哪个配方更好，可以将上述材料转接到下面芽增殖及壮苗生根培养基中继续观察。

实施例3：种苗的快繁培养及移栽

1、芽增殖培养：将上述(丛生)芽苗分成单株，转入芽增殖培养基中，分别在1500-2500LX光下培养14h/d，28-30天后统计芽增殖倍数及芽苗生长发育情况(表3)，其中以D1和D2作为对照。芽增殖培养基配方为：

Ms+6-BA0.2-0.8mg/L+NAA0.1mg/L

表3不同培养基配方对芽增殖及种苗生长发育的影响

通过表3结果综合分析可以得出：最好的初代培养基配方是K4和K9，丛生芽率达到100％，愈伤化程度中等，愈伤组织黄绿色较坚硬；从成本考虑K4最经济实惠；当将K4丛生芽转入芽增殖培养基，其中K41、K42和K43不管对于芽增殖倍数还是种苗生长发育均为同等条件下综合效果最好的；但在这3个芽增殖培养基配方中综合效果表现最好的配方又是K42，不管芽增殖倍数还是种苗生长发育均达到最好状态。所以得出空气凤梨初代培养基配方首选K4：1/2Ms+GA3.0+6-BA0.2+NAA0.5；芽增殖培养基配方首选K42：Ms+6-BA0.5+NAA0.1为好。最终使一粒种子可以分离出9棵左右小芽苗，大大增加了植株数量。

2、壮苗生根培养：将上述小芽苗转入壮苗生根培养基，在1500-2500LX光下培养14h/d，28-30天后小芽苗100％长成具有多个根茎叶的正常健壮植株。壮苗生根培养基为：Ms+6-BA0.1mg/L+IBA0.2-0.5mg/L；当培养基中IBA浓度低于0.3mg/L时，有利于幼株生长更加健壮；当培养基中IBA浓度达到0.5mg/L时，植株会产生大量须根，生长健壮。

3、无菌苗的炼苗与移栽：将上述生长正常健壮的植株瓶口封口膜揭开室内炼苗2-3d，之后取出小植株，洗净植株上附着的培养基，散放于温室大棚的穴盘中，适当遮荫，并及时喷水，保持种苗处在较湿润且透气地状态，直到小植株适应新环境并开始正常生长，20d后统计所有品种的无菌苗成活率均可达100％。

4、上述所有培养温度均在20-28℃之间，没有特别说明，培养基PH5.8，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L。

Claims

1.一种通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）选择空气凤梨种荚采集的时间：在种荚呈绿色还在纵向伸长生长阶段不宜取材，当种荚长度不再变化，颜色由绿色转向绿褐色，还未炸裂时均可作为外植体材料取材，其中以绿色略带褐红色的种荚为最优选材；

2）种荚的消毒灭菌：将种荚放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗1-2h，再用次氯酸钠液消毒10-15min，灭菌水冲洗后吸干表面水分，拿到超净工作台上备用；在超净工作台上，分别用下述消毒液消毒灭菌：先用70-75%酒精浸泡30s，之后放入0.1%的升汞或0.1%升汞+2-3滴吐温中消毒8-12分钟，无菌水冲洗10次以上，用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种；

3）种荚的处理：将上述消毒灭菌后的种荚，用剪刀分别在种荚前段的1/3处、1/2处和3/4处剪断，将种子接种在琼脂7%+GA₃3-5.0mg/L的诱导种子萌发培养基上；

4）丛生芽培养：将步骤3）获得的种子接种在添加不同种类浓度激素及不同浓度的MS培养基上，在无菌自然光下培养28-30天得到丛生芽苗；

5）芽增殖培养：将丛生芽苗分成单株，转入芽增殖培养基中，分别在1500-2000LX光下培养14h/d，28-30天后统计芽增殖倍数及芽苗生长发育情况；

6）壮苗生根培养：28-30天后再将小芽苗转入壮苗生根培养基，小芽苗长成具有多个茎叶根的正常植株；

7）无菌苗的炼苗与移栽：将上述生长正常健壮的植株瓶口封口膜揭开室内炼苗2-3d，之后取出小植株，洗净植株上附着的培养基，散放于温室大棚的穴盘中，适当遮荫，并及时喷水，保持种苗处在较湿润且透气地状态，直到小植株适应新环境并开始正常生长，20d后统计成活率。

2.根据权利要求1所述的通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，其特征在于，所述步骤3）中的种荚的处理：将上述消毒灭菌后的种荚，用剪刀分别在种荚前段的1/2处剪断，将种子接种在琼脂7%+GA₃3-5.0mg/L的诱导种子萌发培养基上。

3.根据权利要求1所述的通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，其特征在于，所述步骤4）中的不同种类浓度激素及不同浓度的MS培养基为1/2Ms+GA3.0 mg/L +6-BA0.2mg/L +NAA0.5 mg/L或Ms+GA3.0 mg/L +6-BA0.2 mg/L +NAA0.5 mg/L。

4.根据权利要求1所述的通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，其特征在于，所述步骤5）芽增殖培养基为Ms+6-BA0.2-0.8mg/L+NAA0.1mg/L。

5.根据权利要求1所述的通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，其特征在于，所述步骤6）壮苗生根培养基为：Ms+6-BA0.1mg/L+IBA0.2-0.5mg/L。

6.根据权利要求1所述的通过种子无菌萌发获得空气凤梨种苗的方法，其特征在于，所述步骤4）中的不同种类浓度激素及不同浓度的MS培养基为1/2Ms+GA3.0 mg/L +6-BA0.2mg/L +NAA0.5 mg/L，所述步骤5）的芽增殖培养基为Ms+6-BA0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L，所述步骤6）的壮苗生根培养基为：Ms+6-BA0.1mg/L+IBA0.5mg/L。