CN110511987B - 一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法 - Google Patents

一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法。该方法包括：将待检测的样品进行增菌培养，得到增菌培养液；使用试剂盒法提取增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；将待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，进行PCR反应，得到PCR反应产物；将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来判断样品是否含有单增李斯特菌。本发明基于以上引物建立了一种单增李斯特菌的PCR检测方法。本发明的检测方法具有特异性好、灵敏性高、检测速度快、成本低廉、操作简单的特点。

Description

一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，会导致许多食品中的污染，并可承受食品加工过程中常见的环境压力。单增李斯特菌抗盐碱、耐冷，在20％的盐浓度下仍可存活，在4℃下仍可生长繁殖。单增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人类病原体，主要感染老年人、孕妇、儿童和免疫功能低下者。李斯特菌病的临床表现包括脑膜炎、脑炎、流产、发热性胃肠炎和败血症等，李斯特菌病的死亡率高达30％。因此，大多数国家都对食品中的单增李斯特菌进行严格控制，特别是在即食食品中。
传统的基于培养的方法目前是单增李斯特菌检测的主要方法(可见国家标准GB4789.30-2016)，虽然其对实验设备的要求不高，但鉴定周期需要5-10天。使用免疫学方法鉴定虽然鉴定周期短，但操作复杂，不利于高通量检测，且单克隆抗体的制备较为困难。利用PCR方法进行单增李斯特菌的检测具有简便、快速、灵敏的特点。目前，单增李斯特菌的PCR检测使用的靶标主要是毒力基因，如hly、inlA、iap等基因。对现有专利，如CN100463972C、CN101029331B等专利中使用的检测引物使用Primer-BLAST进行验证，发现仍缺少敏感性和特异性都较好的单增李斯特菌PCR检测引物；然而，目前对单增李斯特菌的新PCR检测靶标的挖掘的相关文献报道较少。对其新PCR检测靶标的挖掘和新的PCR检测方法的建立，有助于提高单增李斯特菌PCR检测的敏感性和特异性。
发明内容
本发明针对现有检测方法的上述不足，提供一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法。
本发明提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法是一种特异性好、灵敏性高、检测速度快、成本低廉、操作简单的单增李斯特菌的PCR检测方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其使用的特异性靶标基因为lmo1341，使用的引物序列为：
lmo1341-F：5’-TGTTAGTTGATTATCCGTCGCC-3’，如SEQ ID NO：1所示；
lmo1341-R：5’-GCATTTACGCTCCCATTTACC-3’，如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，包括：将待测食品样品和细菌菌株进行增菌培养；使用试剂盒法提取食品样品增菌液和细菌菌液的基因组DNA；以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR反应；对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。若出现243bp的条带，则判断为单增李斯特菌阳性，若未出现243bp的条带，则判断为单增李斯特菌阴性。
本发明提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)将待检测的样品接种至李斯特菌增菌肉汤中进行增菌培养，得到增菌培养液；
(2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；
(3)将步骤(2)所述待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；
(4)将步骤(3)所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现243bp的条带，则步骤(1)所述待检测的样品中含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阳性；如果所述电泳结果图上没有出现条带，则步骤(1)所述待检测的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。
进一步地，步骤(1)中所述的增菌培养是使用李斯特菌增菌肉汤，在36-38℃振荡培养10-12h，其中李斯特菌增菌肉汤的成分为(以体积为一升来计)：胰蛋白胨16.0-18.0g、多价蛋白胨2.5-3.5g、酵母提取物5.0-7.0g、氯化钠4.5-5.5g、磷酸氢二钾2.0-3.0g、葡萄糖2.0-3.0g、萘啶酮酸35-45mg、吖啶黄素10-20mg，溶于1000mL蒸馏水。
优选地，步骤(1)中所述的增菌培养是使用李斯特菌增菌肉汤，在37℃振荡培养10h，其中李斯特菌增菌肉汤的成分为：胰蛋白胨17.0g、多价蛋白胨3.0g、酵母提取物6.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、萘啶酮酸40mg、吖啶黄素15mg以及1000mL蒸馏水。
进一步地，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36-38摄氏度，增菌培养的时间为10-12h，所述增菌培养的摇床转速为210-230rpm。
进一步地，步骤(2)所述待检测的DNA提取液中的DNA浓度为107.3ng/μL-107.3fg/μL。
进一步地，步骤(3)所述检测单增李斯特菌的PCR引物包括PCR引物lmo1341。
进一步地，所述PCR引物lmo1341包括正向引物lmo1341-F和反向引物lmo1341-R；所述正向引物lmo1341-F如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物lmo1341-R如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，步骤(3)所述PCR反应体系，按体积份数计，包含：
其中，所述10×PCR反应缓冲液的pH值为8.2-8.4；所述dNTP溶液为dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例与水混合均匀得到的溶液，在所述dNTP溶液中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度均为10-15mM；所述检测单增李斯特菌的PCR引物溶液为检测单增李斯特菌的PCR引物与水混合均匀得到的溶液，所述检测单增李斯特菌的PCR引物溶液中引物的浓度为各8-12μM；所述Taq酶溶液为Taq酶与水混合均匀得到的溶液，所述Taq酶溶液的浓度为2-3U/μL；所述水为无菌且无核苷酸的超纯水(DEPC水)。
优选地，步骤(3)所述PCR体系的体积为50μL。
优选地，步骤(3)所述PCR体系(以体积50μL计)包含：
10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP 0.25mM，引物lmo1341-F、lmo1341-R各0.2μM，模板DNA 1μL，Taq酶2.5U。
进一步地，步骤(3)所述PCR反应的条件为：
先在95-98℃预变性2-4min，然后进行扩展循环，最后在68-72℃条件下延伸4-6min；
所述扩展循环为：在95-98℃条件下变性14-16s，52-54℃条件下退火14-16s，68-72℃条件下延伸29-31s，进行30-35个循环。
优选地，步骤(3)所述PCR反应的条件为：
先在95℃预变性3min，然后进行扩展循环，最后在72℃条件下延伸5min；
所述扩展循环为：在95℃条件下变性15s，53℃条件下退火15s，72℃条件下延伸30s，进行35个循环。
进一步地，步骤(4)所述琼脂糖凝胶的质量百分比浓度为1.5-3.0wt％。
本发明公开了一种单增李斯特菌的特异性检测靶标，及其对应的PCR检测用引物和检测方法。所述特异性检测靶标通过比较基因组学和生物信息学挖掘获得，选自lmo1341基因，该检测靶标同时具有特异性好和敏感性高的特点。本发明针对新挖掘到的单增李斯特菌的特异性检测靶标lmo1341基因设计特异性引物，正向引物序列为5’-TGTTAGTTGATTATCCGTCGCC-3’(lmo1341-F)，反向引物序列为5’-GCATTTACGCTCCCATTTACC-3’(lmo1341-R)。本发明基于以上引物建立了一种单增李斯特菌的PCR检测方法。本发明的检测方法具有特异性好、灵敏性高、检测速度快、成本低廉、操作简单的特点。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，与与CN 100463972C、CN 101029331B等专利中的检测方法相比，同时具有敏感性高和特异性高的特点。
附图说明
图1a为实施例2中基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法的特异性评价的电泳检测的部分结果。
图1b为实施例2中基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法的特异性评价的电泳检测的另一部分结果。
图2为实施例3中基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法的灵敏度评价的电泳检测结果。
图3为实施例4中单增李斯特菌人工污染食品PCR检测的电泳检测结果。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
建立单增李斯特菌PCR检测方法(即所述基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法)
通过单增李斯特菌和其他细菌的全基因组序列进行比对，筛选得到单增李斯特菌的特异性基因lmo1341。使用Primer Premier 6进行引物设计，确定引物序列如下：
lmo1341-F：5’-TGTTAGTTGATTATCCGTCGCC-3’，如SEQ ID NO：1所示；
lmo1341-R：5’-GCATTTACGCTCCCATTTACC-3’，如SEQ ID NO：2所示。
使用在线工具Primer-BLAST将设计的引物与NCBI的NT数据库进行比对，以验证本发明检测引物的准确性。本发明的PCR检测引物在NT数据库的217个单增李斯特菌基因组中，正确地检测出了全部217个基因组对应菌株的血清型，并且没有将非单增李斯特菌的基因组检测为阳性。对现有专利中的检测引物进行相同的验证，CN 104342496B等发明中的引物仅正确地检测出了数据库中196个基因组，敏感度不够高；CN 102676647B等发明中的引物虽然敏感度足够高，但将4个非单增李斯特菌的基因组检测为阳性，特异性不够高，如下表1所示，表1为本发明的检测引物的敏感性和特异性评价表。因此本发明挖掘到的单增李斯特菌检测靶标以及根据该检测靶标设计的检测引物，相比于现有专利，同时具有敏感度高和特异性高的特点。
表1
采用以上所述的引物对(lmo1341-F和lmo1341-R)，建立单增李斯特菌的PCR检测方法。
所述的PCR反应体系总体积为50μL，包括10×PCR反应缓冲液5μL，模板DNA 1μL，余者为DEPC水；其中所述PCR反应体系还含有：dNTP 0.25mM，引物lmo1341-F、lmo1341-R各0.2μM及Taq酶2.5U。
所属的PCR反应程序为：95℃预变性3min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为，95℃变性15s、53℃退火15s、72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min。
检测结果的判定：取5μL的PCR反应产物在质量分数为2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，若出现243bp的条带，则判断为单增李斯特菌阳性，若未出现243bp的条带，则判断为单增李斯特菌阴性。
实施例2
本发明的单增李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
对本发明的单增李斯特菌PCR检测方法的特异性评价共使用了10株单增李斯特菌，分别为CICC 21633、CICC 21662、242-2、CICC 21632、CICC 21634、CMCC 54002、GIM1.347、ATCC 19114、2006-1、3877-1。
特异性评价共使用了20株非单增李斯特菌，分别为英诺克李斯特菌(Listeriainnocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、维德曼氏芽胞杆菌(Bacillus wiedmannii)、雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)、格拉纳达假单胞菌(Pseudomonas granadensis)、东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、解酪蛋白巨大球菌(Macrococcus caseolyticus)、格式乳球菌(Lactococcus garvieae)。
将10株单增李斯特菌和20株非单增李斯特菌分别接种到10mL的LB液体培养基中，在37℃增菌12h后，取菌悬液1mL，使用天根生化科技(北京)有限公司的细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
将提取得到的基因组DNA取1μL做PCR反应，PCR反应体系和反应程序如实施例1中所述。去PCR反应产物进行电泳，并如实施例1中所述判断单增李斯特菌的方法来判断检测结果。PCR检测结果如表2和图1a和图1b所示。其中，图1a和图1b中，M表示为DL 1,000的DNAMarker，泳道1-10为单增李斯特菌，泳道11-24为非单增李斯特菌，具体菌种和菌株名称见表2。实验结果表明(表2)，实施例2提供的一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法对10株不同的单增李斯特菌菌株皆可正确地检测为阳性，具有较高的敏感度；对20株非单增李斯特菌的菌种，本方法皆检测为阴性，因此，本方法也具有较高的特异性。
表2
表2中+表示检测结果为阳性；-表示检测结果为阴性。
实施例3
单增李斯特菌PCR检测方法的检测限测定
将单增李斯特菌GIM 1.347的基因组DNA使用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度，测得初始浓度为107.3ng/μL。使用无菌水对基因组DNA进行连续10倍梯度稀释，得到浓度为107.3ng/μL-10.7fg/μL的基因组DNA，每个稀释梯度的DNA取1μL作为模板加入PCR反应体系(50μL)。扩增结果如下表3和附图2所示；其中，图2的M表示为DL 1,000DNA的Marker，泳道1-8对应的PCR体系中DNA浓度分别为2.146ng/μL、214.6pg/μL、21.46pg/μL、2.146pg/μL、214.6fg/μL、21.46fg/μL、2.146fg/μL、0.2146fg/μL。当单增李斯特菌基因组DNA的浓度在2.146ng/μL-2.146fg/μL之间时，PCR反应体系可以扩增出阳性结果，当DNA浓度下降至0.2146fg/μL时，反应体系无法扩增出条带，判定为阴性。因此，该反应体系对单增李斯特菌基因组DNA的检测限为2.146fg/μL。因此，本发明提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法对于单增李斯特菌基因组DNA的检测具有较高的灵敏度。
表3
表3中+表示检测结果为阳性；-表示检测结果为阴性。
实施例4
单增李斯特菌人工污染食品的PCR检测
将单增李斯特菌菌落接种于TSB培养基振荡培养，取1mL菌液用生理盐水进行10倍梯度稀释，每10mL牛奶样品接入1mL稀释后的菌液，人工污染的牛奶样品中的单增李斯特菌初始浓度使用平板计数法测定，测得菌液的初始浓度分别为8.3×104CFU/10mL牛奶、8.3×103CFU/10mL牛奶、8.3×102CFU/10mL牛奶、8.3×101CFU/10mL牛奶及8.3×100CFU/10mL牛奶。将接种后的牛奶样品(10mL)分别加入90mL的李斯特菌增菌肉汤中，37℃下振荡培养。于4h、6h、8h、10h、12h取样1mL，采用试剂盒提取基因组DNA。以提取得的到基因组DNA为模板进行如实施例1所述的PCR反应。对于不同接种量，不同增菌时间的PCR检测结果如表4和图3所示，表4为单增李斯特菌人工污染牛奶样品的PCR检测结果。图3中的A、B、C、D及E分别为初始接种量8.3×104CFU/10mL、8.3×103CFU/10mL、8.3×102CFU/10mL、8.3×101CFU/10mL、8.3×100CFU/10mL的牛奶样品的PCR检测结果；图3中的M表示为DL 1,000DNA Marker，泳道1-6分别为增菌0h、4h、6h、8h、10h、12h后的PCR产物。
增菌10h后，人工污染的牛奶样品中初始接种量为8.3CFU的单增李斯特菌可以被PCR体系检测为阳性。即，此反应体系对牛奶样品中单增李斯特菌的检测限为8.3CFU/10mL牛奶。因此，本发明建立的PCR检测方法对于牛奶样品微量的单增李斯特菌也有较好的检测能力，并且与传统方法5-10天的鉴定周期相比，本发明只需10h即可有效检测出食品中微量的单增李斯特菌，缩短了检测时间。
表4
表4中+表示检测结果为阳性；-表示检测结果为阴性。
综上所述，本发明的单增李斯特菌PCR检测引物对于单增李斯特菌的检测特异性和敏感性较高，并且对于单增李斯特菌核酸和食品中单增李斯特菌的检测灵敏度较高，有较为全面的检测能力。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<400> 1
tgttagttga ttatccgtcg cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<400> 2
gcatttacgc tcccatttac c 21

Claims (7)

1.一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，所述方法用于非疾病诊断目的食品样品或细菌菌株中单增李斯特菌的检测，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将食品样品或细菌菌株接种至李斯特菌增菌肉汤中进行增菌培养，得到增菌培养液；
(2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；
(3)将步骤(2)所述待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物，所述检测单增李斯特菌的PCR引物包括PCR引物lmo1341，所述PCR引物lmo1341包括正向引物lmo1341-F和反向引物lmo1341-R，所述正向引物lmo1341-F如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物lmo1341-R如SEQID NO:2所示；
(4)将步骤(3)所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现243bp的条带，则步骤(1)所述待检测的样品中含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阳性；如果所述电泳结果图上没有出现条带，则步骤(1)所述待检测的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。
2.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(1)所述李斯特菌增菌肉汤，以体积为一升来计，每升李斯特菌增菌肉汤中包含：胰蛋白胨16.0-18.0g、多价蛋白胨2.5-3.5g、酵母提取物5.0-7.0g、氯化钠4.5-5.5g、磷酸氢二钾2.0-3.0g、葡萄糖2.0-3.0g、萘啶酮酸35-45mg、吖啶黄素10-20mg以及1000mL蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36-38摄氏度，增菌培养的时间为10-12h，所述增菌培养的摇床转速为210-230rpm。
4.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)所述待检测的DNA提取液中的DNA浓度为107.3ng/μL-107.3fg/μL。
5.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR反应体系，按体积份数计，包含：
10×PCR反应缓冲液5份；
dNTP溶液1份；
检测单增李斯特菌的PCR引物溶液1份；
待检测的DNA提取液1份；
Taq酶溶液1份；
水41份；
其中，所述10×PCR反应缓冲液的pH值为8.2-8.4；所述dNTP溶液为dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例与水混合均匀得到的溶液，在所述dNTP溶液中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度均为10-15mM；所述检测单增李斯特菌的PCR引物溶液为检测单增李斯特菌的PCR引物与水混合均匀得到的溶液，所述检测单增李斯特菌的PCR引物溶液中引物的浓度为各8-12μM；所述Taq酶溶液为Taq酶与水混合均匀得到的溶液，所述Taq酶溶液的浓度为2-3U/μL；所述水为无菌且无核苷酸的超纯水。
6.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR反应的条件为：
先在95-98℃预变性2-4min，然后进行扩展循环，最后在68-72℃条件下延伸4-6min；
所述扩展循环为：在95-98℃条件下变性14-16s，52-54℃条件下退火14-16s，68-72℃条件下延伸29-31s，进行30-35个循环。
7.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(4)所述琼脂糖凝胶的质量百分比浓度为1.5-3.0wt％。
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