CN110468177A - 一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β‑隐黄素及玉米黄素的方法,属于食品科学技术领域。该方法包括如下步骤:将特氏杜氏藻细胞接种至液体培养基中,培养,在培养过程中测定藻液的光密度,待OD630达到0.7~1.1时加入咪唑100~1000ppm,继续培养2~6d,然后测量β‑隐黄素及玉米黄素含量。本发明加入咪唑之后能够快速,有效地提高特氏杜氏藻中β‑隐黄素及玉米黄素的含量。本发明中使用的咪唑效果显著,生效迅速,且成本很低,是一种有效且经济的提高特氏杜氏藻中β‑隐黄素及玉米黄素的方法。
Description
技术领域
本发明属于食品科学技术领域,具体涉及一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法。
背景技术
特氏杜氏藻是一种无细胞壁的单细胞绿藻,能够在盐度范围为0.5M~5.5M的环境中生长。特氏杜氏藻的高耐盐性使其可以在海水,咸水湖及盐池中生活,并在高盐水体中形成优势种群。特氏杜氏藻对环境适应力强,易于繁育,不会在水体表面结块,因此具有在室外甚至开放水域低成本大规模培养的可能性。此外,在高光及硝酸盐充足的情况下,特氏杜氏藻会在细胞内积累高价值的类胡萝卜素如β-胡萝卜素及叶黄素。因此,特氏杜氏藻被认为是天然类胡萝卜素的重要来源。
β-隐黄质(beta-cryptoxanthin)又名β-隐黄素,是一种羟基化的β-胡萝卜素,也是唯一具有维生素A原活性的叶黄素,多存在于水果和蔬菜中,其中以橘子,红辣椒以及南瓜含量相对较高,具有多种对人体健康很重要的功能。β-隐黄素可以作为视黄醇的来源,还是一种体外抗氧化剂,由于其抗氧化,抗癌特性,骨骼疾病预防能力,β-隐黄素也在全球市场中引起关注。玉米黄素由β-隐黄素羟化而成,是一种叶黄素类色素,一般用作天然食品着色剂,同样在蔬菜及水果中广泛存在。虽然玉米黄素不能在人体内转化为维生素A,但是也具有保护视力,预防心血管疾病等功效。天然来源的β-隐黄质及玉米黄素一般来自花果,生产提纯成本很高,因此急需寻找更合适的原料来源。特氏杜氏藻含有一种催化非亚铁血红素β-胡萝卜素羟化酶,通过羟化β-胡萝卜素形成β-隐黄素,并进一步生成玉米黄素。因此,特氏杜氏藻具有大量累积β-隐黄素及玉米黄素的潜质。
发明内容
为了满足市场对于大量且廉价的天然β-隐黄素及玉米黄素的需求,本发明的目的在于提供一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法。该方法显著地提高了特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量。本发明中使用的咪唑效果显著,生效迅速,且成本很低,是一种有效且经济的提高特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,包括如下步骤:
将特氏杜氏藻细胞接种至液体培养基中,培养,在培养过程中测定藻液的光密度(OD值),待OD630达到0.7~1.1(优选为1.0)时加入咪唑,继续培养2~6d(优选为4~6d,进一步优选为4d),然后测量β-隐黄素及玉米黄素含量。
所述的培养的条件为:在光照度为6000~10000Lx,其中积累β-隐黄素的最优光照度为8000Lx,积累玉米黄素的最优光照度为10000Lx;光暗周期为16h/8h,温度为27~28℃,以转速50r/min的转速震荡培养。
所述的咪唑的加入量为100~1000ppm,优选为250~1000ppm;进一步优选为500~750ppm;更进一步优选为500ppm。
所述的液体培养基为:配制特氏杜氏藻基本培养液,向基本培养液中加入A5微量元素溶液,调节pH,灭菌、冷却至室温,得到液体培养基。
所述的特氏杜氏藻基本培养液,其成分为:NaNO3为0.420g/L,NaCl为87.69g/L,NaH2PO4·2H2O为0.156g/L,NaHCO3为0.840g/L,KCl为0.074g/L,MgSO4·7H2O为1.230g/L,CaCl2·2H2O为0.044g/L,0.1%Fe-EDTA液0.5mL/L,调pH至7.5。
所述的A5微量元素溶液,其成分如下:H3BO3 2.86g/L,MnCl2·4H2O 1.81g/L,ZnSO4·7H2O 0.22g/L,CuSO4·5H2O 0.08g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L,加入的量为1mL/L。
所述的Fe-EDTA液为:Na2EDTA 0.189g/L,FeCl3·6H2O 0.244g/L。溶液中Fe离子浓度0.1mg/mL,高压灭菌至溶解。
所述的灭菌的条件为:压力102.9kPa,温度121℃,时间20~25min。
所述的测量β-隐黄素及玉米黄素的方法为:
取10mL藻液,8000rpm离心1min,弃去上清液,重新加入2mL丙酮,涡旋2~3min(优选为2min),浸提20min,以10000~13000rpm离心5~15min(优选为10000rpm离心10min),取上清液转移至新的离心管中,加入0.2mL的60%KOH(用来去除叶绿素),静置分层,上层的丙酮相用0.45μm的滤膜过滤,4℃冰箱保存。
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素,所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18;所用的流动相为:A相:97%甲醇+3%超纯水,B相为100%叔丁基甲醚,所用的流速为1.0mL/min,所用的柱温为25℃。
β-隐黄素的峰高/含量换算公式为:y=0.0069x;
玉米黄素的峰高/含量换算公式为:y=0.021x。
换算公式通过标准品标定而得。
本发明的藻种来源:
所涉及的特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta FACHB-821)购于中科院水生生物研究所(武汉),并采用液体培养基弱光保存。
利用高效液相色谱法法测定微藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量,表明加入咪唑后β-隐黄素及玉米黄素含量有一个明显增加的变化。加入咪唑的量为500ppm时,D.tertiolecta中β-隐黄素及玉米黄素的积累量提高最明显。其中最有利于β-隐黄素积累的最适光照度为8000Lx,最有利于玉米黄素积累的最适光照度为10000Lx。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明加入咪唑后能够明显提高特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量。
(2)本发明加入咪唑之后能够快速,有效地提高特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量,相比于其它方法如利用基因工程技术过表达非亚铁血红素β-胡萝卜素羟化酶或者抑制玉米黄素环氧化酶的表达量等等,本发明有着操作简单,成本低廉,生效更快等优势。虽然咪唑在某种程度上减少了特氏杜氏藻的总生物量,但是由于单细胞β-隐黄素及玉米黄素含量有了大幅度的提升,最终导致体系内的β-隐黄素及玉米黄素含量有了显著的提升。
(3)本发明使用的特氏杜氏藻是一类自养生物,适合在户外高盐水域环境中大量地户外培养,培养过程中无需大量添加碳氮源,是一种环境友好的且可持续的类胡萝卜素原料。
附图说明
图1是加入咪唑后,对照组和各实验组的β-隐黄素的含量。
图2是加入咪唑后,对照组和各实验组的玉米黄素的含量。
图3是在8000Lx光照度下培养96h的对照组的液相图谱。
图4是在8000Lx光照度下以500ppm咪唑培养96h的实验组的液相图谱。
图5是在10000Lx光照度下以500ppm咪唑培养96h的实验组的液相图谱。
图6为图4中出峰时间为13.00min的物质的波段扫描图。
图7为β-隐黄素标准品全波段扫描图。
图8为图5中出峰时间为10.35min的物质的波段扫描图。
图9为玉米黄素标准品全波段扫描图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
所涉及的特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta FACHB-821)购于中科院水生生物研究所(武汉),并采用液体培养基弱光保存。
实施例1
(1)特氏杜氏藻培养液配制
配制盐藻培养液:NaNO3 0.420g/L,NaCl 87.69g/L,NaH2PO4·2H2O 0.156g/L,NaHCO3 0.840g/L,KCl 0.074g/L,MgSO4·7H2O 1.230g/L,CaCl2·2H2O 0.044g/L,0.1%Fe-EDTA液0.5mL/L。向培养液中加入A5微量元素溶液1mL/L,调pH至7.5。Fe-EDTA液成分如下:Na2EDTA 0.189g/L,FeCl3·6H2O 0.244g/L。A5微量元素溶液成分如下:H3BO3 2.86g/L,MnCl2·4H2O 1.81g/L,ZnSO4·7H2O 0.22g/L,CuSO4·5H2O 0.08g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O0.04g/L。盐藻培养液按100mL每瓶分装至250mL的三角瓶中,四层纱布封口,在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。室温冷却后使用。
(2)接种培养
将处于对数生长期的藻液于4000r/min下离心3min,弃除培养液,按5%的接种量将藻细胞加入装有新鲜灭菌培养液的三角瓶中,用四层纱布包裹瓶口并用橡皮筋扎紧。将三角瓶置于光照培养箱中,分别在光照度为6000,8000及10000Lx(光暗周期为16h/8h)下,以温度为27~28℃,以50r/min的转速震荡培养。培养过程中用分光光度计测定藻液的光密度(OD值),当其OD630达到1.0左右时分别加入咪唑0、250、500、750、1000ppm,继续培养约6天,每隔两天取样一次。
(3)类胡萝卜素的提取
取10mL藻液,8000rpm离心1min,弃去上清液,重新加入2mL丙酮,涡旋2min,浸提20min,以10000rpm离心10min,取上清液转移至4mL离心管,加0.2mL的60%KOH(用来去除叶绿素),静置分层,上层的丙酮相用0.45μm的滤膜过滤,4℃冰箱保存。
(4)类胡萝卜素含量的测定
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素,所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18;所用的流动相为:A相:97%甲醇+3%超纯水,B相为100%叔丁基甲醚,所用的流速为1.0mL/min,所用的柱温为25℃。
β-隐黄素的峰高/含量换算公式为:y=0.0069x;
玉米黄素的峰高/含量换算公式为:y=0.021x。
换算公式通过标准品标定而得。
(5)结论
当不加入咪唑时,在不同的光照度及培养时间下,β-隐黄素均无法通过上述方法被检测出来(图1,3)。在加入咪唑后,β-隐黄素开始积累(图6,7),其出峰时间在13.1min附近(图4)。经过条件优化,最有利于β-隐黄素在特氏杜氏藻中积累的条件为在8000Lx的照度下用500ppm咪唑处理特氏杜氏藻96h,此时β-隐黄素的累积量达到0.40μg/mL提取液。
当不加入咪唑时,玉米黄素(出峰时间在10.3min附近,特征光谱见图8,9)在不同的光照度及培养时间下均有积累,影响其积累的最重要因素为光照度(图2)。在高光强下,玉米黄素的积累量大大提高(图2)。在加入500~750ppm咪唑后,在高照度的实验组中观测到玉米黄素含量的骤增(图2)。经过条件优化,最有利于玉米黄素在特氏杜氏藻中积累的条件为在10000Lx的光照度下用500ppm咪唑处理特氏杜氏藻96h,此时玉米黄素的累积量达到7.50μg/mL提取液(图2,5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:包括如下步骤:
将特氏杜氏藻细胞接种至液体培养基中,培养,在培养过程中测定藻液的光密度,待OD630达到0.7~1.1时加入咪唑100~1000ppm,继续培养2~6d,然后测量β-隐黄素及玉米黄素含量。
2.根据权利要求1所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的咪唑的加入量为250~1000ppm。
3.根据权利要求1所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的咪唑的加入量为500~750ppm。
4.根据权利要求1所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的咪唑的加入量为500ppm。
5.根据权利要求1~4任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
待OD630达到1.0时加入咪唑;
所述的继续培养的时间为4~6d。
6.根据权利要求1~4任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的培养的条件为:在光照度为6000~10000Lx;光暗周期为16h/8h,温度为27~28℃,以转速50r/min的转速震荡培养。
7.根据权利要求6所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的培养的条件为:积累β-隐黄素的光照度为8000Lx,积累玉米黄素的光照度为10000Lx;光暗周期为16h/8h,温度为27~28℃,以转速50r/min的转速震荡培养。
8.根据权利要求1~4任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的液体培养基为:配制特氏杜氏藻基本培养液,向基本培养液中加入A5微量元素溶液,调节pH,灭菌、冷却至室温,得到液体培养基。
9.根据权利要求8所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的特氏杜氏藻基本培养液,其成分为:NaNO3为0.420g/L,NaCl为87.69g/L,NaH2PO4·2H2O为0.156g/L,NaHCO3为0.840g/L,KCl为0.074g/L,MgSO4·7H2O为1.230g/L,CaCl2·2H2O为0.044g/L,0.1%Fe-EDTA液0.5mL/L,调pH至7.5;
所述的A5微量元素溶液,其成分如下:H3BO3 2.86g/L,MnCl2·4H2O 1.81g/L,ZnSO4·7H2O 0.22g/L,CuSO4·5H2O 0.08g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L,加入的量为1mL/L;
所述的Fe-EDTA液为:Na2EDTA 0.189g/L,FeCl3·6H2O 0.244g/L;溶液中Fe离子浓度0.1mg/mL,高压灭菌至溶解;
所述的灭菌的条件为:压力102.9kPa,温度121℃,时间20~25min。
10.根据权利要求1~4任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法,其特征在于:
所述的测量β-隐黄素及玉米黄素的方法为:
取10mL藻液,8000rpm离心1min,弃去上清液,重新加入2mL丙酮,涡旋2~3min,浸提20min,以10000~13000rpm离心5~15min,取上清液转移至新的离心管中,加入0.2mL的60%KOH,去除叶绿素,静置分层,上层的丙酮相用0.45μm的滤膜过滤。
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