CN110462365A - 微小物质封入方法及微小物质检测方法以及微小物质检测用装置 - Google Patents

微小物质封入方法及微小物质检测方法以及微小物质检测用装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供，作为利用简易操作，将核酸、蛋白质、病毒及细胞等检测对象物质封入极小容积的液滴中，能够进行高灵敏度检测的技术，在基板表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入微小物质的方法，其至少包括以下步骤：(1)第一步骤，在上述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与上述基板的相对位置根据设置于上述插入体的支持部进行定位，将上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面对向配置，由此在上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面之间设置溶液导入空间，并且设置与上述溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间、上述基板内和/或上述插入体内。

Description

微小物质封入方法及微小物质检测方法以及微小物质检测用 装置
技术领域
本发明涉及微小物质封入方法及微小物质检测方法以及微小物质检测用装置。更具体而言，涉及在基板上互相分开形成的多个凹部内形成封入微小物质的液滴的方法等。
背景技术
为了进行疾病、传染病等的诊断，因此，要求用于迅速、简便，且高灵敏度地检测核酸、蛋白质、病毒及细胞等的标记的技术。例如，从在体积1mm3的肿瘤中包含的100万个癌症细胞将标记蛋白(从各细胞各100分子)分泌到5L的血中的情况下，标记蛋白的血中浓度为30aM左右。要求对这样的浓度非常低的物质也能够检测的技术。
作为这样的技术，存在“单分子酶测定”：其将核酸、蛋白质、病毒及细胞等检测对象物质封入极小容积的液滴中，通过使用了标记抗体的免疫学手段进行检测。利用单分子酶测定，能够将检测对象物质以一分子单位的灵敏度进行检测。
在专利文献1中，作为能够应用于单分子酶测定的技术，公开了“一种颗粒封入方法，其特征在于包括：颗粒导入步骤，其是向下层部与上层部之间的空间导入包含颗粒的亲水性溶剂，该下层部中形成有多个仅可以收容1个所述颗粒的收容部，多个所述收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，该上层部与该下层部的形成有所述收容部的面相对向；疏水性溶剂导入步骤，其在所述颗粒导入步骤之后向所述空间导入疏水性溶剂”。
专利文献1所公开的技术，使用了“一种阵列，其特征在于：其具备下层部及上层部，所述下层部中形成有多个收容部，该多个收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，所述上层部与所述下层部的形成有所述收容部的面以隔着空间的方式而相对向”，其使用的是具有下层部和上层部隔着空间相对的流通池结构的阵列。根据该技术，认为“可以将大量颗粒高效地封入阵列中，因此能够以高灵敏度检测出低浓度的靶分子”。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2012/121310号
专利文献2：日本特开2004-309405号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的主要目的在于提供用于利用简易操作，将核酸、蛋白质、病毒及细胞等检测对象物质封入极小容积的液滴中，能够进行高灵敏度的检测的技术。
解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明提供以下[1]～[32]。
[1]在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入微小物质的方法，其包括：
(1)第一步骤，在上述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与上述基板的相对位置根据设置于上述插入体的支持部进行定位，将上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面对向配置，由此在上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与上述溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间、上述基板内和/或上述插入体内；以及
(2)第二步骤，将包含上述微小物质和第一溶剂的第一溶液导入上述溶液导入空间内，以及
(3)第三步骤，将包含与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入上述溶液导入空间，将该溶液导入空间内的上述第一液体向上述溶液排出空间排出，由此，在上述凹部内形成被上述第二液体包覆且包含上述微小物质的上述第一液体的液滴。
[2]根据[1]的方法，其中，在上述第一步骤中，将上述溶液排出空间设置在上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间。
[3]根据[[1]的方法，其中，在上述第一步骤中，将上述溶液排出空间设置在上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板内。
[4]根据[1]的方法，其中，在上述第一步骤中，将上述溶液排出空间设置在上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间并在上述基板内。
[5]根据[1]的方法，其中，在上述第一步骤中，将上述溶液排出空间设置在上述插入体的上述下表面的上方，且在上述插入体内。
[6]根据[1]的方法，其中，在上述第一步骤中，将上述溶液排出空间设置在上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间并在上述插入体内。
[7]根据[1]～[6]中任一项的方法，其中，在上述第二步骤中，将上述第一溶液通过形成于上述插入体和/或上述基板而在上述溶液导入空间具有出口的流动路径，导入上述溶液导入空间。
[8]根据[2]的方法，其中上述插入体具有在插入方向的两端具备凸缘的筒管状形状，
使该插入体的上述下表面为与上述基板的上述凹部形成面具有大致相同形状的第一凸缘，
该第一凸缘将上述基板的上述凹部形成面的上方空间划分为以下两个空间：位于该下表面与上述凹部形成面之间的上述溶液导入空间、和位于该第一凸缘上方的上述溶液排出空间。
[9][根据1]～[8]中任一项的方法，其中在上述第二步骤与上述第三步骤之间，进一步包括控制形成有孔的上述基板的温度的步骤。
[10]在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入微小物质的方法，其包括：
(A)将插入体配置于上述基板的凹部形成面的上方，使得该插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面相对，向由此形成的上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面之间的溶液导入空间，导入包含上述微小物质和第一溶剂的第一溶液的步骤，以及
(B)将包含与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入上述溶液导入空间，将被导入到上述溶液导入空间和上述凹部内的上述第一溶剂中的被导入到上述溶液导入空间的上述第一溶剂，向与上述溶液导入空间连通的溶液排出空间排出，由此在上述凹部内形成被上述第二液体包覆且包含上述微小物质的上述第一液体的液滴的步骤。
[11]检测在基板的表面在互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入的微小物质的方法，其包括：
(1)第一步骤，在上述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与上述基板的相对位置根据设置于上述插入体的支持部进行定位，将上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面对向配置，由此在上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与上述溶液导入空间连通的溶剂排出空间，使所述溶剂排出空间位于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间、上述基板内和/或上述插入体内；以及
(2)第二步骤，将包含上述微小物质和第一溶剂的第一溶液导入上述溶液导入空间内；以及
(3)第三步骤，将包含与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入上述溶液导入空间，将该溶液导入空间内的上述第一液体向上述溶剂排出空间排出，由此，在上述凹部内形成被上述第二液体包覆且包含上述微小物质的上述第一液体的液滴；以及
(4)第四步骤，光学、电和/或磁性检测在上述液滴内存在的上述微小物质。
[12]基于生色底物的吸光度变化和/或荧光，而光学检测在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入的微小物质的方法，其包括：
(1)第一步骤，在上述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与上述基板的相对位置根据设置于上述插入体的支持部进行定位，将上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面对向配置，由此在上述插入体的下表面与上述基板的上述凹部形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与上述溶液导入空间连通的溶剂排出空间，使所述溶剂排出空间位于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间、上述基板内和/或上述插入体内；以及
(2)第二步骤，将包含上述微小物质和上述生色底物和第一溶剂的第一溶液导入上述溶液导入空间内；以及
(3)第三步骤，将包含与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入上述溶液导入空间，将该溶液导入空间内的上述第一液体向上述溶剂排出空间排出，由此，在上述凹部内形成被上述第二液体包覆且包含上述微小物质的上述第一液体的液滴；以及
(4)检测将在上述液滴内存在的上述生色底物的吸光度变化和/或荧光的第四步骤。
[13]微小物质检测用装置，其包含：具备互相分开而形成多个封入微小物质的凹部的表面的基板、和在上述基板的凹部形成面的上方配置的插入体，
上述插入体具备用于定位与上述基板的相对位置的支持部，
在上述基板的上述凹部形成面与在其上方对向配置的上述插入体的下表面之间，设置溶液导入空间，
设置与上述溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间、上述基板内和/或上述插入体内；且，
在上述插入体和/或上述基板形成有在上述溶液导入空间具有出口的流动路径。
[14]根据[13]的装置，其被构成为使得将在上述溶液导入空间内保持的第一溶剂，置换为与通过上述流动路径被导入上述溶液导入空间内的与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂，并向上述溶液排出空间排出的方式。
[15]根据[14]的装置，其被构成为使得在上述溶液导入空间内及上述凹部内保持的包含上述微小物质和上述第一溶剂的第一液体中的在上述溶液导入空间内保持的第一液体，利用通过上述流动路径被导入上述溶液导入空间内的包含与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体，向上述溶液排出空间排出，在上述凹部内形成被上述第二液体包覆且包含上述微小物质的上述第一液体的液滴。
[16]根据[13]的装置，其中，上述溶剂排出空间设置于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间。
[17]根据[13]的装置，其中，上述溶剂排出空间设置于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板内。
[18]根据[13]的装置，其中，上述溶剂排出空间设置于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间并在上述基板内。
[19]根据[13]的装置，其中，上述溶剂排出空间设置于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述插入体内。
[20]根据[13]的装置，其中，上述溶剂排出空间设置于上述插入体的上述下表面的上方，且在上述基板与上述插入体之间并在上述插入体内。
[21]根据[13]的装置，其中，上述插入体具有在插入方向的两端具备凸缘的筒管状形状，
使该插入体的上述下表面为与上述基板的上述凹部形成面具有大致相同形状的第一凸缘，
该第一凸缘将上述基板的上述凹部形成面的上方空间划分为以下两个空间：位于该第一凸缘与上述凹部形成面之间的上述溶液导入空间、和位于该第一凸缘的上方的上述溶液排出空间。
[22]根据[21]的装置，其中，上述支持部为在上述插入体的上端侧环绕设置的第二凸缘，
该第二凸缘在向上述基板的凹部形成面的上方配置时与上述基板锁合，上述插入体的从上述第一凸缘到该第二凸缘为止的高度为上述溶液排出空间的高度。
[23]根据[22]的装置，其中，上述插入体的上述第一凸缘及上述第二凸缘之间为圆筒形状，上述第一凸缘及上述第二凸缘为圆板形状。
[24]根据[21]～[23]中的任一装置，其中，上述第一凸缘为不透光性的。
[25]根据[21]的装置，其中，上述支持部为配置于上述插入体的上述下表面的突起，上述突起的高度为上述溶液导入空间的高度。
[26]根据[21]～[25]中的任一装置，其中，在向上述凹部形成面的上方配置时，该第一凸缘与上述基板之间形成的间隙以液体能够流通的方式连通上述溶液导入空间与上述溶液排出空间。
[27]根据[21]～[25]中的任一装置，其中，上述插入体的上述第一凸缘具有缺口，
在向上述凹部形成面的上方配置时，该缺口以液体能够流通的方式连通上述溶液导入空间与上述溶液排出空间。
[28]根据[13]～[27]中的任一装置，其中，上述插入体至少在其下表面中为不透光性。
[29]根据[13]～[26]中的任一装置，在上述插入体向上述基板的凹部形成面的上方配置时，上述支持部与上述基板嵌合。
[30]根据[13]～[29]中的任一装置，其进一步具备控制上述基板的温度的温度调节器。
[31]根据[13]～[30]中的任一装置，其进一步具备对上述凹部内存在的上述微小物质进行光学、电和/或磁性检测的检测器。
[32]将微小物质(微观小体，microscopic body)封入凹部(沟槽，cavity)的方法，其包括以下步骤：
(1)使插入体与基板以能够装卸的方式接触的步骤，其中，
插入体具有表面，
基板具有形成有多个凹部的表面，
在插入体与基板以能够装卸的方式接触时，
将插入体的表面隔着对于诱发毛细现象而言足够小的距离而位于基板的表面上，由此在两表面之间形成液体导入空间，
将包含插入体的表面的平面定义为阈值水平(threshold level)，
液体导入空间至少通过第一流动路径和第二流动路径与阈值水平上的空间连通；
(2)将第一液体通过第一流动路径导入液体导入空间的步骤，
这里，第一液体包含第一溶剂和目标微小物质(靶标微观小体，targetmicroscopic body)；
(3)将第二溶剂通过第一流动路径或第二流动路径导入液体导入空间，将液体导入空间内的第一液体置换的步骤，这里，第二溶剂为与第一溶剂非混合性的。
发明的效果
根据本发明，可提供用于利用简易的操作，将核酸、蛋白质、病毒及细胞等检测对象物质封入极小容积的液滴中，能够进行高灵敏度的检测的技术。
附图简单说明
[图1]示出的本发明的第一实施方式涉及的微小物质检测用装置的孔和插销(plug)的图。
[图2-1]说明使用第一实施方式涉及的微小物质检测用装置的微小物质检测方法及微小物质封入方法的步骤的图。
[图2-2]说明使用第一实施方式涉及的微小物质检测用装置的微小物质检测方法及微小物质封入方法的步骤的图。
[图2-3]说明使用第一实施方式涉及的微小物质检测用装置的微小物质检测方法及微小物质封入方法的步骤的图。
[图2-4]说明使用第一实施方式涉及的微小物质检测用装置的微小物质检测方法及微小物质封入方法的步骤的图。
[图3]用于说明基于在病毒的颗粒表面存在的酶与生色底物的反应的反应产物的图。
[图4]示出第一实施方式涉及的插销的变形例的图。
[图5]示出(A)图4所示的插销的变形例，(B)第一实施方式涉及的插销的其它变形例的图。
[图6]示出的第一实施方式涉及的插销的其它变形例的图。
[图7]示出图6所示的插销的变形例的构造的图。
[图8]示出本发明的第一实施方式涉及的阵列及插销的其它变形例的图。
[图9]示出本发明的第一实施方式涉及的阵列及插销的其它变形例的图。
[图10]示出本发明的第二实施方式涉及的阵列及插销的其它变形例的图。
[图11]示出第二实施方式涉及的阵列及插销的变形例的图。
[图12]示出本发明的第三实施方式涉及的阵列及插销的其它变形例的图。
[图13]示出第三实施方式涉及的阵列及插销的变形例的图。
[图14-1]本发明使用的插销的参考例的俯视图(A)，正视图(B)。
[图14-2]图14-1所示的插销的剖面图。
[图15]示出本发明使用的插销具备的吸附性物质的图。
[图16]示出本发明使用的96孔阵列的参考例的整体、开口的局部放大、及在开口的底部设置的容器的局部放大而代替附图的照片。
[图17]示出将插销以1个或2列的方式预先连接而成的16个插入阵列的情形而代替附图的照片。
[图18]示出将1个插销插入阵列的情形而代替附图的照片。
[图19]示出用移液器从插入阵列的2列连接插销的一个的端部注入溶剂的情形代替附图的照片。
具体实施方式
以下，参考附图对于用于实施本发明的优选形态进行说明。需要说明的是，以下说明的实施方式仅为示出本发明的代表的实施方式的一个实例，并不意在解释为使本发明的范围变窄。
本发明涉及的物质封入方法，为用于向在基板(以下也称为“阵列”)的表面利用侧壁而互相分开形成的多个凹部(以下也称为“容器”)中的至少一部分封入微小物质的方法。在本发明涉及的微小物质封入方法中，包括以下步骤(A)、(B)、(C)。
(A)在阵列的容器形成面的上方配置插入体(以下也称为“插销”)，该插销与上述阵列的相对位置根据设置于上述插销的支持部进行定位，将上述插销的下表面与上述阵列的上述容器形成面对向配置，由此在上述插销的下表面和上述阵列的上述容器形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与上述溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于上述插销的上述下表面的上方，且在上述阵列和上述插销之间、上述阵列内和/或上述插销内的步骤(插销插入步骤)：
(B)将包含上述微小物质和第一溶剂的第一溶液导入上述溶液导入空间内的步骤(物质导入步骤)。
(C)将包含与上述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入上述溶液导入空间，将该溶液导入空间内的上述第一液体向上述溶液排出空间排出，由此，在上述容器内形成被上述第二液体包覆且包含上述微量物体的上述第一液体的液滴的步骤(物质封入步骤)。
另外，本发明涉及的微小物质检测方法，为检测在上述的容器内封入的微小物质的方法，除了上述的微小物质封入方法的步骤(A)～(C)以外，还包括以下步骤(D)：
(D)光学、电和/或磁性检测在上述液滴内存在的上述微小物质的步骤(检测步骤)。
以下，对本发明涉及的微小物质检测方法进行说明。对于本发明涉及的微小物质封入方法及微小物质检测用装置，在涉及微小物质检测方法的说明中一并说明。
[检测对象物质]
在本发明涉及的微小物质检测方法等中，作为检测对象的微小物质(以下也称为“靶标物质”)，只要是容器可容纳的大小的物质即可，没有特别限定。靶标物质可以为：核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体，以及病毒、细胞及细胞器等。另外，靶标物质可以为具有相对于上述物质的结合能力的树脂制或金属制的颗粒(珠)。靶标物质优选为能够作为各种疾病或传染病的标记的核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体，以及细胞及细胞器，或者具有相对于它们的结合能力的载体。
在核酸中，包括DNA及RNA等天然核酸及LNA及PNA等人工核酸，也包括它们的聚合物。另外，在细胞中，包括动物细胞、植物细胞及细菌细胞等。在细胞器中，包括脂质体、外来体及线粒体等。
这里，“珠”与“颗粒”以同义使用，为本技术领域中常用的技术术语。对珠的形状没有特别限定，通常使为球形。对珠的材料也没有特别限定，可以为：玻璃、硅、橡胶、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯葡聚糖、交联葡聚糖(Sephadex(商标))、琼脂糖凝胶(Sepharose(商标))、硅胶、乳胶凝胶、丙烯酸树脂、乙烯基与丙烯酰胺的共聚物、纤维素、硝酸纤维素、纤维素衍生物、明胶及磁性材料等。对珠而言，可以为多孔性的。珠的平均粒径优选为5μm以下，例如1μm～4μm左右。需要说明的是，“平均粒径”在此是指使用电子显微镜观察或动态光散射法测定的数值。
为了赋予珠以相对于核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体，及病毒、细胞及细胞器等的结合能力，可以例如在珠上固定相对于核酸的互补链、或固定针对蛋白质等的抗体。利用这些核酸杂交反应、抗原抗体反应等公知的分子间结合反应，可以赋予珠以相对于靶标物质的结合能力。
对核酸链、抗体向珠的固定而言，可以利用以往公知的手段进行。例如：可以通过接头使珠的表面存在的修饰基与互补链、抗体进行结合。对于氨基修饰珠，能够通过具有N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)等的交联剂使在其表面存在的氨基与核酸链、抗体共价键合。
<第一实施方式>
[阵列]
在本发明涉及的微小物质检测方法中使用的装置，包含阵列和插销。在图1及图2(A)中示出阵列和插销的构造。在阵列1(参考图2(A))中形成了孔11。孔11可以在阵列1中形成多个。在孔11的底面111中，形成了容纳靶标物质的多个容器112(以下，将底面111称为“容器形成面111”)。各容器112利用侧壁113而被互相分开。
阵列1可使用玻璃制基板层的湿式蚀刻、干式蚀刻，或塑料制基板层的纳米压印、注射成型、切削加工等公知的技术而成型。对阵列1的材质而言，在对靶标物质进行光学检测的情况下，设为具有光透过性的材质，例如设为：玻璃、各种塑料(PP、PC、PS、COC、COP、PDMS等)。对阵列1而言，优选选择自体荧光小、波长分散小、光学误差少的材质。
阵列1可以使用设置有96个孔11的市售的96孔板。
对孔11的大小(容积)及形状而言，只要能够嵌合插销2即可，没有特别限定。孔11的大小，例如：以容器形成面111的直径计为5～10mm左右，典型的为7mm左右，深度(参考图2(B)符号H)为10～12cm左右。对孔11的形状而言，从孔11及插销2的成型的容易程度的观点出发，优选为圆柱形或者棱柱形。
对各孔11中的容器112的配置数没有特别限定，为10万～100万个左右、优选为20万～50万个左右。
对容器112的大小(容积)及形状而言，能够容纳靶标物质即可。容器12的大小，例如：底面的径为4～8μm左右，典型为5μm左右，深度为6～12μm左右，容积为fL(10-15L)级别。
对孔11的形状而言，也从成型的容易程度的观点出发优选圆柱形或者棱柱形。
[插销插入步骤]
在本步骤中，在阵列1的容器形成面111的上方配置插销2，插销2与阵列1的相对位置根据设置于插销2的支持部进行定位，将插销2的下表面和阵列1的容器形成面111对向配置，由此在插销2的下表面与阵列1的容器形成面111之间设置溶液导入空间。同时，设置以液体能够流通的方式与溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于插销2下表面的上方，且在阵列1与插销2之间。
首先，从孔11的开口114将插销2插入孔11空间内(参考图1及图2(B))。虽然在此示出了一对孔11和插销2，但阵列1可以具有多个孔11，在这种情况下，使用与孔11的数量对应的数目的插销2。插销2可以以能够装卸的方式被插入孔11中。
插销2具有在插入方向的两端具备凸缘的筒管状形状，具备第一凸缘23和下表面22，第一凸缘23在向孔11空间内的插入方向下端侧环绕设置，下表面22在向孔空间11内插入时与容器形成面111相对，且具有与容器形成面111大致相同的形状。在此，第一凸缘23的下表面与下表面22构成同一平面。
另外，插销2具备第二凸缘24，第二凸缘24作为向孔空间11内插入时将下表面22保持在与孔底面111不接触的位置的支持部，在向孔11空间内插入方向的上端侧环绕设置。
上述筒管状形状是指插销2的第一凸缘23与第二凸缘24之间(以下也称为“插销2主体部”)为圆柱形状，第一凸缘23及第二凸缘24分别被成型为从圆柱的两端突出的圆板形状。插销2主体部可以具有锥体，优选具有向着插入方向下方而直径变小的锥体。
优选在插销2向孔空间11内插入时，第二凸缘24与基板1嵌合。由此，通过使得暂时插入的插销2不会再次脱离，由此消除误操作，并能够防止由插销发生意外脱离而孔空间11内的溶液溢出导致的污染。
插销2具备溶剂导入路径25，溶剂导入路径25在上表面21具有进口251，在下表面22具有出口252。
对插销2的材质没有特别限定，可以为与阵列1相同的材质。插销2可以使用塑料的纳米压印、注射成型、切削加工等公知的技术进行成型，也可以使用3D打印机进行成型。
插销2的第一凸缘23具有比容器形成面111小的面积。即，第一凸缘23从插销2向孔11空间内的插入方向的投影面积，小于容器形成面111的面积。因此，插销21向孔11空间内插入时，在第一凸缘23与孔11的内壁之间形成间隙231。
孔11的直径为5～10mm左右，典型为7mm左右，对插销2的第一凸缘23的直径(下表面22的直径)而言，为了形成间隙231而使其比孔11的直径更小，例如使其小5～30％左右。
第一凸缘23在插销2向孔11空间内插入时，将孔空间11内划分为以下两个空间：位于容器形成面111与第一凸缘23之间的溶液导入空间11a、和位于第一凸缘23与第二凸缘24之间的溶液排出空间11b。溶液导入空间11a和溶液排出空间11b利用在第一凸缘23与孔11的内壁之间形成的间隙231而以能够液体流通的方式联系。
这里，将插销2的下表面22按照作为对位于其下方的溶液导入空间11a、和位于上方的溶液排出空间11b进行划分的含义而定义为“阈值水平(threshold level)”。
第二凸缘24，在插销2向孔空间11内插入时与孔11的开口缘锁合，将下表面22保持在与容器形成面111不接触的位置。为此，使从插销2的下表面22至第二凸缘24为止的高度h(即，溶液排出空间11b的高度)低于孔11的深度H。
[物质导入步骤]
接着，将包含靶标物质3和第一溶剂的第一溶液S1导入溶液导入到空间11a(参考图2(C))。
在此，说明与靶标物质3一起导入的用于对靶标物质3进行基于吸光度变化和/或荧光的光学检测的生色底物4的例子。
第一溶剂可以为用于溶解或悬浊靶标物质3及生色底物4的适当的溶剂，可以使用在检测核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体，及病毒、细胞及细胞器等时通常使用的溶剂。第一溶液S1可以为选自例如：由水、醇、醚、酮、腈类溶剂、二甲亚砜(DMSO)、及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)组成的组中的至少1个或包含它们的混合物等，优选为水。作为醇，可列举例如：乙醇、甲醇、丙醇、甘油等。作为醚，可列举例如：四氢呋喃、聚氧乙烯、1，4-二噁烷等。作为酮，可列举例如：丙酮、甲乙酮等。作为腈类溶剂，可列举例如：乙腈等。
第一溶剂可以包含缓冲物质。作为缓冲物质，没有特别限定，可与荧光染料的pKa配合而使用MES(2-吗啉代乙磺酸)、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)、PIPES(哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)等所谓Good′s缓冲液(Good′s Buffer)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、DEA(二乙醇胺)等。
另外，第一溶剂可以包含表面活性剂。通过包含表面活性剂，由此第一溶液S1变得易于被导入溶液导入到空间11a及容器112内。作为表面活性剂，没有特别限定，例如可列举：TWEEN20(CAS编号：9005-64-5，单月桂酸聚氧乙烯山梨糖醇酐)及Triton X-100(CAS编号：9002-93-1，统称聚乙二醇单-4-辛基苯基醚(n≈10))等。对在第一溶剂20中的表面活性剂的添加浓度没有特别限定，优选为0.01～1％。
进一步，作为表面活性剂，可以广泛使用：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂、天然来源的表面活性剂等。
作为阴离子性表面活性剂，例如分类为：羧酸型、硫酸酯型、磺酸型、磷酸酯型。其中，具体而言，可列举例如：十二烷基硫酸钠、月桂酸钠、α-磺脂肪酸甲酯钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基乙氧基硫酸钠等，其中，优选使用十二烷基苯磺酸钠。
作为阳离子性表面活性剂，例如分类为：季铵盐型、烷基胺型、杂环胺型。具体而言，可列举例如：硬脂基三甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基二甲基苄基氯化铵等。
作为非离子表面活性剂，可列举例如：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯单脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、烷基多糖苷、N-甲基烷基葡糖酰胺等。其中，优选：十二烷基醇乙氧基化物、壬酯苯酚乙氧基化物、月桂酰二乙醇酰胺，除此以外，以Triton X(Triton X-100等)、Pluronic(注册商标)(Pluronic F-123、F-68等)、Tween(Tween 20、40、60、65、80、85等)、Brij(注册商标)(Brij35、58、98等)、Span(Span 20、40、60、80、83、85)的名字市售的那些。
作为两性表面活性剂，有例如：月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱、十二烷基氨基甲基二甲基磺丙基甜菜碱、3-(十四烷基二甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐等，优选使用3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)等。
作为天然来源的表面活性剂，优选为例如：卵磷脂、皂素，在被称为卵磷脂的化合物中，具体而言，优选为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油等。另外，作为皂素，优选皂树(Quillaja)皂素。
包含靶标物质3和生色底物4的第一溶液S1从插销2的溶剂导入路径25的进口251注入，从出口252导入溶液导入到空间11a。
第一溶液S1的导入量可根据溶液导入空间11a的容积而适当设定，例如为1～50μl左右、优选为5～20μl左右。
对溶剂导入路径25的直径、形状没有特别限定。例如形状可以为圆筒，其内径为1～5mm左右，典型为2.5mm左右。
导入到溶液导入空间11a中的第一溶液S1，利用毛管现象前进到容器底面111与插销2的下表面22之间，填充到溶液导入空间11a中(参考图2(D))。由此，靶标物质3和生色底物4也被导入到容器112内。
在第一溶液S1中的靶标物质3的浓度较低的情况下，在各容器112中，靶标物质3成为被1分子导入或完全没有被导入中的一种情况。生色底物4优选以与靶标物质3的浓度相比足够高的浓度包含在第一溶液S1中。因此，生色底物4在几乎全部的容器112中导入了1分子或者2分子以上。
[物质封入步骤]
在本步骤中，将包含与第一溶液S1为非混合性的第二溶剂的第二溶液S2导入溶液导入到空间11a(参考图2(E))。由此，将溶液导入空间11a内的第一液体S1向溶液排出空间11b挤出而使其排出，在容器112内形成第一液体S1的液滴。该第一液体S1的液滴被第二溶液S2包覆，且包含靶标物质3和生色底物4。
对第二溶剂而言，只要是与第一溶液S1为非混合性即可，优选可以使用例如选自由：饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅油、六氟丙烯环氧化物类聚合物、具有氢氟醚结构的聚合物、全氟聚醚、具有三氟氯乙烯聚合物及全氟化碳结构的聚合物组成的组中的至少1种，或包含其的混合物等。作为饱和烃，可列举例如烷烃、环烷烃等。作为烷烃，可列举例如癸烷、十六烷等。作为不饱和烃，可列举例如角鲨烯等。作为芳香族烃，可列举例如苯、甲苯等。作为六氟丙烯环氧化物类聚合物，可列举例如：Krytox143(杜邦公司制)、Krytox GPL(杜邦公司制)等。作为具有氢氟醚结构的聚合物，可列举例如：Asahi Klin AE3000(旭硝子公司制)、Novec7000(住友3M公司制)等。作为具有全氟化碳结构的聚合物，可列举例如：Fluorinert FC-40、Fluorinert FC-43(住友3M公司制)等。
第二溶剂优选使用与第一溶剂或者包含其的第一溶液S1相比，比重更高的那些。
第二溶液S2从插销2的溶剂导入路径25的进口251注入，从出口252导入到溶液导入空间11a。
第二溶液S2的导入量可根据溶液导入空间11a的容积适当设定，使为第一溶液S1的导入量的1.1～5倍左右、优选为1.5～2倍左右。
导入到溶液导入空间11a中的第二溶液S2，利用毛管现象进到容器形成面111与插销2的下表面22之间。在这种情况下，在溶液导入空间11a内填充的第一溶液S1通过间隙231被向溶液排出空间11b挤出，从而置换为第二溶液S2。由此，在容器112内形成被第二溶液S2包覆，且包含生色底物4的第一溶液S1的液滴D(参考图2(F))。在容器112中形成的液滴D中的一定的比例中，与生色底物4一起封入了靶标物质3。
对溶液排出空间11b的容积而言，使其为能够容纳对保持在溶液导入空间11a内及容器112内的第一液体S1中的保持在溶液导入空间11a内的第一液体S1而言足够的容积。溶液排出空间11b的容积，可以根据溶液导入空间11a的容积及容器112的数量、容积以及第一液体S1的导入量而适当设定。
在以下检测步骤中，对液滴D内存在的靶标物质3进行光学、电和/或磁性检测。在此说明的例子，是通过对生色底物4的吸光度变化和/或荧光进行检测而对靶标物质3进行光学检测的，更具体而言，是将靶标物质3为在表面或内部具有相对于生色底物4的底物切割活性的酶的病毒、而生色底物4为利用该酶切割而使作为生色团的反应产物游离的物质的情况为例进行说明的。其中，生色底物4只要是在与酶发生反应后生成具有与反应前不同的光学特性的反应产物的那些即可，可以为在反应前后吸光度、旋光度发生变化的物质、在反应后变得呈现荧光的物质。
作为这样的病毒与酶的组合，可例示以下。
[表1]
在容器112中已形成的液滴D中，进行在极小容积中共存的靶标物质3(病毒)的颗粒表面或内部存在的酶与生色底物4的反应，生成反应产物。参考图3进行详细说明。在病毒的颗粒表面或内部中存在酶31(图中示出酶31存在于病毒表面的情况)。生色底物4与酶31发生接触而反应时，生成反应产物6。生色产物6显示与生色底物4不同的光学特性，显示吸光度、旋光度的移位、荧光(或发光)。
利用酶31与生色底物4的反应而在液滴D的极小容积中生成、蓄积反应产物6。由此，使得反应产物6的生成迅速进行直至能够在下个检测步骤检测出的浓度为止，因此，使得能够实现反应产物6的高灵敏度检测。
病毒为流感病毒(参考表1)，生色底物4使用4-甲基伞形酮-α-D-神经氨酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid：4MU-NANA)的情况为例进行进一步具体说明。
在流感病毒的颗粒表面存在神经氨酸苷酶(酶31)。4MU-NANA(生色底物4)与神经氨酸苷酶接触而反应时，生成作为源自基于4MU-NANA的神经氨酸苷酶的水解而呈现荧光的生色团的4-甲基伞形酮(反应产物6)。4-甲基伞型酮在液滴D的极小容积中进行蓄积，蓄积的4-甲基伞型酮发出增强的荧光。
需要说明的是，对于反应产物6而言，虽然也是在本步骤前如果在第一溶液S1中生色底物4与酶31发生接触则能够生成的物质，但在本步骤中形成包含靶标物质3和生色底物4的第一溶液S1的液滴D前，生成的反应产物6并不在极小容积中蓄积。因此，在反应产物6的检测中，在本步骤前生成的反应产物6的影响小到了可以忽视的程度。
[检测步骤]
在本步骤中，对液滴D内存在的靶标物质3进行光学、电和/或磁性检测(参考图2(G))。在此说明的具体例中，通过对在液滴D内生成的反应产物6(4-甲基伞型酮)发出的荧光进行检测，而检测作为靶标物质3的流感病毒。
光学检测能够利用检测器7进行，所述检测器7具备：光源、将来自光源的光聚光至容器112内且将从容器112内产生的光聚光至传感器的光学路径、和传感器。在本发明涉及的微小物质检测用装置中，除了阵列1和插销2以外，可以包含检测器7。来自光源的光从阵列1的下方侧(与孔11的开口面为相反面侧)照射至容器112内，从容器112内产生的光也从同侧进行聚光。在光源与阵列1之间、及阵列1与CMOS图像传感器等传感器之间，配置有通常使用的透镜、滤波片等。
另外，本发明涉及的微小物质检测用装置中，可以包含控制阵列1的温度的温度调节器。在温度调节器中，可采用专利文献2中公开的加热机构或温度调节机构。温度调节器可以为例如利用帕尔帖元件、焦耳-汤姆逊元件等能控制温度的加热块。
如上所述，对于反应产物6而言，虽然也是在物质封入步骤前可能在第一溶液S1中生成的物质，但对在物质封入步骤前生成的反应产物6中的多数而言，在物质封入步骤中，利用第二溶液S2被从溶液导入空间11a排出到溶液排出空间11b中。因此，在本步骤中的从阵列1的下方侧的反应产物6的检测中，在物质封入步骤前生成的反应产物6并不成为噪声，能够选择性地检测出来自在液滴D的极小容积在中生成、蓄积的反应产物6的信号。为了避免检测到来自排出到溶液排出空间11b中的反应产物6的噪声，优选插销2的第一凸缘23为不透光性。对光透过性而言，可以通过将第一凸缘23或包含其的插销2整体利用不透明的材料形成而赋予。
进行液滴D中的4-甲基伞型酮(反应产物6)的荧光检测，使用获得的荧光强度和预先制作的规定荧光强度与神经氨酸苷酶活性的关系的标准曲线，从而计算出神经氨酸苷酶的酶活性。进一步，使用算出的酶活性和预先制作的规定酶活性与病毒颗粒数的关系的标准曲线，从而进行有无流感病毒的存在的判定或者颗粒数的定量。由此，能够检测作为靶标物质3的流感病毒，也可以定量地确定病毒量。
如上所述，在第一溶液S1中，靶标物质3被稀释至足够低的浓度的情况下，进入1个容器112中的靶标物质3的数量可以为0或最大为1。在物质封入步骤中，由于在第一溶液S1的液滴D中能够将反应产物6蓄积至高浓度，因此，即使在作为靶标物质3的病毒仅有1个颗粒进入容器112的情况下，也能够以高灵敏度进行反应产物6的检测。因此，根据本发明涉及的物质检测方法，即使是病毒等极其微量的靶标物质3，也能够以高灵敏度检测，能够实现高精度地确定其存在量。
另外，在本步骤中，也可以使用检测到靶标物质3的容器112的数量，与没有检测到靶标物质3的容器112的数量的比率，基于预先制作的规定第一溶液S1中的靶标物质3的浓度与该比率的关系的标准曲线，确定靶标物质3的浓度。
根据本实施方式，能够实现具有多个孔11及容器112的大面积的阵列1。例如，即使是具有100万个左右的容器112的阵列1，也能够以简便的操作有效地将靶标物质3封入各容器112中。从物质导入步骤到物质封入步骤为止需要的时间，典型为1分钟～10分钟左右而非常短，操作简便。
根据实施方式，则能够高灵敏度地检测靶标分子3，因此，即使是10aM左右的非常低浓度的靶标分子3也能够实现检测，能够应用于例如数字ELISA、ELISA-PCR等应用中。
[第一实施方式的变形例]
在上述第一实施方式中，对第二凸缘24作为在将插销2向孔空间11内插入时，以使得下表面22与容器形成面111不接触的方式进行保持的支持部起作用的例子进行了说明(参考图1及图2(A))。在本发明中，插销2的支持部可以为如图4及图5(A)所示那样的在下表面22配置的突起26。使突起26的高度h(即，溶液导入空间11a的高度)低于孔11的深度H。对突起26的数量没有特别限定，但为了进行稳定的定位，优选配置3～4个左右。
另外，对在上述第一实施方式中，插销2的下表面22与第一凸缘23的下表面构成同一平面的例子进行说明(参考图1及图2(A))。在本发明中，第一凸缘23如图5(B)所示设在插销2的插入方向下端的附近即可，并不必须位于下方末端。
进一步，在上述第一实施方式中，说明了孔11的溶液导入空间11a和溶液排出空间11b，利用在第一凸缘23与孔11的内壁之间形成的间隙231而以能够液体流通的方式联系。在本发明中，溶液导入空间11a和溶液排出空间11b也可以如图6及图7所示那样，构成为使得利用在插销2的第一凸缘23设置的缺口232而以液体能够流通的方式联系。在这种情况下，插销2的第一凸缘23不必须具有小于容器形成面111的面积。对缺口232的大小和数目没有特别限定，优选以使得在物质封入步骤中，被导入到溶液导入空间11a中的第二溶液S2挤出的第一溶液S1能够通过缺口232迅速地向溶液排出空间11b移动的方式而言足够的大小和数目进行配置。
此外，在上述第一实施方式中，说明了在物质导入步骤中第一溶液S1被向位于插销2与阵列1之间(具体而言，由制成筒管形状的插销2的第一凸缘23、第二凸缘24、插销2主体部、与孔11的插销2主体部相对的面所划分的区域)的溶液排出空间11b排出的例子。在本发明中，插销2也可以为缺少第二凸缘24的构成(参考图8)。在这种情况下，阵列2的容器形成面111和与其对向配置的插销2的下表面22之间，也形成溶液导入空间11a。然后，在这种情况下，对用于将导入到溶液导入空间11a中的第一溶液S1排出的溶液排出部11b而言，可以在位于与孔11的插销2主体相对的面，且插销2的下表面22的上方的面设有凹陷。将插销2的下表面22按照作为对位于其下方的溶液导入空间11a、和位于上方的溶液排出空间11b进行划分的含义而定义为“阈值水平(threshold level)”。
在本发明中，“设置于阵列1内的溶液排出部11b”，也包括如上所述那样，使孔11的向着插销2主体的相对面的一部分凹陷而设置的溶液排出部11b。
需要说明的是，即使在使为插销2缺少第二凸缘24的结构的情况下，也能够不使基板1的向着插销2的相对面凹陷而将溶液排出空间11b设在插销2与阵列1之间(参考图9)。
<第二实施方式>
在上述第一实施方式中，说明了将溶液排出空间11b设在插销2与阵列1之间(具体而言，由包含插销2主体部、孔11向着插销2主体部的相对面划分的区域)的例子。在本发明中，在“设置于阵列1内的溶液排出部11b”中，在阵列1中可以设有与向插销2的相对面为独立的区域。其中，在这种情况下，也需要将溶液排出部11b与溶液导入空间11a以液体能够流通的方式连通。
以下，参考图10对使用了第二实施方式涉及的微小物质检测用装置的微小物质封入方法进行说明。
[插销插入步骤]
在本步骤中，在阵列1的容器形成面111的上方配置插销2，插销2与阵列1的相对位置根据设置于插销2的第二凸缘24进行定位，将插销2的下表面22和阵列1的容器形成面111对向配置，由此在插销2的下表面22与阵列1的容器形成面111之间设置溶液导入空间11a。同时，设置以液体能够流通的方式与溶液导入空间11a连通的溶液排出空间11b，使所述溶液排出空间11b位于插销2的下表面22的上方，且在阵列1内。
首先，与第一实施方式同样，将插销2从阵列1的孔11的开口114插入孔11空间内。
图10所示的插销2采用了缺少第一凸缘23的结构。向孔空间11内插入时，第二凸缘24与孔11的开口缘锁合，将下表面22保持在与容器形成面111不接触的位置。另外，向孔空间11内插入时，插销2的下表面22与容器形成面111相对而在与容器形成面111之间形成溶液导入空间11a。
优选在插销2向孔空间11内插入时，第二凸缘24与基板1嵌合。由此，通过使得暂时插入的插销2不会再次脱离，由此消除误操作，并能够防止由插销发生意外脱离而孔空间11内的溶液溢出导致的污染。
[物质导入步骤]
接着，将包含靶标物质3和第一溶剂的第一溶液S1导入到溶液导入空间11a。
包含靶标物质3和生色底物4的第一溶液S1从插销2的溶剂导入路径25的进口251注入，从出口252导入溶液导入到空间11a。导入到溶液导入空间11a中的第一溶液S1，利用毛管现象前进到容器底面111与插销2的下表面22之间，填充到溶液导入空间1la中。由此，靶标物质3和生色底物4被导入到容器112内。优选在各个容器112内各导入1个靶标物质3。
[物质封入步骤]
与第一实施方式同样，根据需要进行了冷却步骤之后，将包含与第一溶液S1为非混合性的第二溶剂的第二溶液S2导入到溶液导入空间11a。
在本实施方式涉及的阵列1中，在插销2的下表面22的下方设有与溶液导入空间11a连通的区域，该区域中的插销2的下表面22的下方与溶液导入空间11a成为一体。该区域为向阵列1的上方的扩张，该区域的插销2的下表面22的上方作为溶液排出空间11b发挥功能。将插销2的下表面22按照作为对位于其下方的溶液导入空间11a、和位于上方的溶液排出空间11b进行划分的含义而定义为“阈值水平(threshold level)”。
需要说明的是，虽然在图10中示出了在阵列1内设有4个溶液排出空间11b的情况，但对溶液排出空间11b的数量没有特别限定。
第二溶液S2从插销2的溶剂导入路径25的进口251注入，从出口252导入到溶液导入空间11a。导入到溶液导入空间11a中的第二溶液S2，利用毛管现象进到容器形成面111与插销2的下表面22之间。在这种情况下，在溶液导入空间11a内填充的第一溶液S1被向溶液排出空间11b挤出，从而置换为第二溶液S2。由此，在容器112内形成被第二溶液S2包覆，且包含生色底物4的第一溶液S1的液滴D(参考图10)。
[第二实施方式的变形例]
在上述第二实施方式中，溶液排出空间11b除了被添加到阵列1内以外，也可以设在插销2与阵列1之间(参考图11)。
<第三实施方式>
进一步，在本发明中，溶剂排出空间11b可以设在插销2内。在这种情况下，溶液排出部11b以使得在插销2向孔11空间内插入时，以液体能够流通的方式与溶液导入空间11a连通的方式构成。
以下，参考图12对使用了第三实施方式涉及的微小物质检测用装置的微小物质封入方法进行说明。
[插销插入步骤]
在本步骤中，在阵列1的容器形成面111的上方配置插销2，插销2与阵列1的相对位置根据设置于插销2的突起26进行定位，将插销2的下表面22和阵列1的容器形成面111对向配置，由此在插销2的下表面22与阵列1的容器形成面111之间设置溶液导入空间11a。同时，设置以液体能够流通的方式与溶液导入空间11a连通的溶液排出空间11b，使所述溶液排出空间11b位于插销2的下表面22的上方，且在插销2内。
首先，与第一实施方式同样将插销2从阵列1的孔11的开口114插入孔11空间内。
图12所示的插销2采用了缺少第一凸缘23的结构。另外，在插销2中采用了突起26，突起26在向孔空间11内插入时作为使得下表面22与容器形成面111不接触的方式保持的支持部，配置于下表面22。向孔空间11内插入时，插销2的下表面22与容器形成面111相对，在与容器形成面111之间形成溶液导入空间11a。
优选在插销2向孔空间11内插入时，第二凸缘24与基板1嵌合。由此，通过使得暂时插入的插销2不会再次脱离，由此消除误操作，并能够防止由插销发生意外脱离而孔空间11内的溶液溢出导致的污染。
[物质导入步骤]
接着，将包含靶标物质3和第一溶剂的第一溶液S1导入到溶液导入空间11a。
包含靶标物质3和生色底物4的第一溶液S1从插销2的溶剂导入路径25的进口251注入，从出口252导入溶液导入到空间11a。导入到溶液导入空间11a中的第一溶液S1，利用毛管现象前进到容器底面111与插销2的下表面22之间，填充到溶液导入空间11a中。由此，靶标物质3和生色底物4被导入到容器112内。
[物质封入步骤]
与第一实施方式同样，根据需要进行了冷却步骤之后，将包含与第一溶液S1为非混合性的第二溶剂的第二溶液S2导入到溶液导入空间11a。
在本实施方式涉及的插销2中，设有向孔空间11内插入时与溶液导入空间11a连通的区域，在该区域中的插销2的下表面22的上方作为溶液排出空间11b发挥功能。将插销2的下表面22按照作为对位于其下方的溶液导入空间11a、和位于上方的溶液排出空间11b进行划分的含义而定义为“阈值水平(threshold level)”。
需要说明的是，对在插销2中设置的溶液排出空间11b的数量没有特别限定。
第二溶液S2从插销2的溶剂导入路径25的进口251注入，从出口252导入到溶液导入空间11a。导入到溶液导入空间11a中的第二溶液S2，利用毛管现象进到容器形成面111与插销2的下表面22之间。在这种情况下，在溶液导入空间11a内填充的第一溶液S1被向溶液排出空间11b挤出，溶液导入空间11a内的第一溶液S1被置换为第二溶液S2。由此，在容器112内形成被第二溶液S2包覆，且包含生色底物4的第一溶液S1的液滴D(参考图12)。
[第三实施方式的变形例]
在上述第三实施方式中，溶液排出空间11b除了被添加到插销2内以外，也可以设在插销2与阵列1之间(参考图13)。
实施例
将本发明使用的插销的参考例的俯视图示于图14(A)，正视图示于图14(B)，剖面图示于图14(C)。本参考例的插销是利用3D打印机法制造的。在以插入方向为轴的情况下，插销的轴体部为朝向插入方向(放置阵列的方向)缓慢变细地形成，整体上形成为锥状。在插销的两端具备凸缘23、24，整体上具有筒管结构。插销的上侧凸缘(第2凸缘24)作为向开口插入时相对于阵列的支持部。上侧凸缘的下部侧具备薄的高度差，其高度差部与阵列的具有圆形状的开口嵌合，以对之后的一系列的操作不造成障碍的程度利用自重半固定至阵列的开口。插销能够容易地插入阵列的开口。高度差部防止了被向排出空间排出的溶剂从上侧凸缘的侧部向外部漏出。
能够适合标准的96孔阵列的插销的一个实例的机械尺寸如下所述。插销的上侧凸缘为外径直径为约8.3mm的薄的圆筒形状，且上侧凸缘的厚度为约2mm。下侧凸缘(第1凸缘23)以其下表面部的外径直径大于上表面部，其侧面部稍显锥状的方式形成。下侧凸缘的最下表面的外径直径为约5.9mm，最上表面的外径直径为约5.4mm。下侧凸缘的厚度为约1mm。除去上侧凸缘下部的高度差部，上侧凸缘的最下表面与下侧凸缘的最上表面之间的距离为约10.9mm。插销整体在轴方向的长度为约13.9mm。在将本发明涉及的插销用于标准的384孔阵列中的情况下，只要将上述的机械尺寸配合开口的尺寸进行分别缩小设定即可。
在插销中，形成了从上侧凸缘的中央部通过轴体部的中心的锥状的贯穿孔，作为第1溶液、第2溶液等的溶剂导入路径25发挥功能。上侧凸缘的上表面部中的贯穿孔的直径为约2.5mm。从插销的最下表面到距约3.8mm的距离的位置(内径改变点)为止，通孔的内径从上侧凸缘的最上表面向着最下表面缓慢变细，通孔在整体上被形成为锥状。从上述的内径改变点到下侧凸缘的最下表面为止，通孔为圆柱形状。上侧凸缘的最上表面中的孔部为用于导入溶剂等的进口251，下侧凸缘的最下表面中的孔部为用于将溶剂等导入到溶液导入空间的出口252。在本参考例的插销的情况下，插销的轴体部比凸缘部更明显变细地形成的，使得在轴体部的周围形成了与阵列的开口的内壁之间具有略宽的体积的溶剂排出空间。
将插销插入阵列的开口，利用上侧凸缘下部的高度差部与开口嵌合而进行半固定。插销向开口的插入可以利用手动操作而以一个单位进行，也可以用夹具同时插入多个。另外，也能够利用机器人系统相对阵列的多列、96孔的全部同时插入插销。在被检验物中含有感染性的病原体时，为了防止污染操作者、外部环境，优选将插销的操作自动化。另外，将含有感染性的病原体的溶剂从溶剂导入空间向排出空间排出时，该溶剂向阵列的开口的外部的漏出成为问题。为了抑制该不良情况，优选在插销2的轴体部的外侧设置吸附性物质5。这是因为能够在该处吸附从溶液导入空间向排出空间排出的该溶剂(参考图15)。
插销的材质可以使用利用3D打印机法进行的容易成型加工的热塑性树脂或热固性树脂。有聚丙烯(PP)、ABS树脂、聚碳酸酯等。另外，也可以利用广泛使用的树脂注塑成型法制造插销。像这样，对插销的材料而言，优选在成型后具有给定的刚性，适于精密成型，并且具有耐热性、低吸附性、低透湿性、耐化学品性等给定的物性。另外，特别优选被认可的药物、生物用途下的使用。例如，在药物、生物关系的用途中熟知的环状烯烃聚合物(COP)。进一步，也优选为高耐热性而适于进行灭菌处理的PPSU/PPSF树脂等。
在本发明中，由于光学性地以高精度检测在溶剂中包含的被检验物的数量，因此，优选插销在使用的光波长中显示遮光性或光吸收性。尤其是以从阵列的下侧对容器内的被检验物进行光测量为主。因此，优选插销的下侧凸缘为黑色。在本参考例中，使用了黑色的热塑性树脂材料。
在本发明中，能够采用具有96孔、384孔等典型的孔数和配置构成的阵列。对其开口的全部形状而言，基本上为平底型。阵列的表面为平坦性，适于用于使液体流动。阵列的在平面方向的开口的形状为圆形，适于用于捕获包含被检验物的溶剂、珠。另外，为了以高精度检测包含捕获的被检验物的溶剂、珠，需要以短时间对设置于开口的底部的无数的容器的全部进行测量。在进行该光学的测量时，从插销、阵列本身发出的不需要的光等的背景噪声较低是重要的。
并且，一个开口的体积为1～400μL左右。作为阵列的材料，可列举：聚丙烯、聚苯乙烯、COP等树脂。其中，优选使用适于药物、生物用途的材料。一个开口的外径为7mm，深度为10～12mm左右。例如，熟知的有将一些阵列的外径形成为126×85×20mm的长方形的长方形形状的那些。
进一步，在各个的开口的底部设有微小的容器。其孔径在底部的表面中为约4～8μm，标准而言为5μm。另外，一个容器的深度为约6～12μm。一个容器的容积为fL(10-15L)大小。
对本发明能够使用的8×16的96孔阵列的一个实例进行说明。将阵列整体和其开口的局部放大照片、及设置于开口的底部的容器的局部放大照片示于图16。将多个容器几何学排列，根据其单个的尺寸(直径)、排列间距或排列密度，每一个开口中能够配置数十万个的容器。在本参考例中，容器为以在每一列中错开其大小的一半的方式配置而成的曲折的Z字形。
在本发明中，可以利用手动操作对于阵列插入插销。适于在实验室内的实验和单次实验等。或者，也可以使用手动操作和插入用的专用装置，对于96孔半自动地插入96个插销。在图17中，示出了将2列的插销预先连接，而将该16个以一体形式插入阵列中的情形。另外的一个部位是利用手动操作而插入了一个插销而成。在图18中，示出了从阵列的宽度方向拍摄的向阵列的开口插入一个插销而成的状态的照片。
图19为示出从在插入阵列中的2列连接插销的一个的端部，利用移液器注入溶剂的情形的照片。插销在被插入阵列的之后，利用插销的上部凸缘得以支撑而不在左右方向上摇动，牢固地固定于阵列。进一步从在插销的中央设置的进口依次注入第1液体，之后是第2液体。也可以对阵列附加设置如专利文献2那样的加热、冷却机构。或者，也可以构建自动地进行阵列和插销的处理的机器人系统，执行自动处理。
附图标记
1：阵列、11：孔、11a：下方空间、11b：上方空间、111：容器形成面、112：容器、113：侧壁、114：开口、2：插销、21：上表面、22：下表面、23：第一凸缘、231：间隙、232：缺口、24：第二凸缘、25：溶剂导入路径、251：进口、252：出口、26：突起、3：靶标物质、31：酶、4：生色底物、5：吸附性物质、6：反应产物、7：检测器、D：液滴、S1：第一溶液、S2：第二溶液。

Claims (29)

1.在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入微小物质的方法，其包括：
(1)第一步骤，在所述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与所述基板的相对位置根据设置于所述插入体的支持部进行定位，将所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面对向配置，由此在所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与所述溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间、所述基板内和/或所述插入体内；以及
(2)第二步骤，将包含所述微小物质和第一溶剂的第一溶液导入所述溶液导入空间内；以及
(3)第三步骤，将包含与所述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入所述溶液导入空间，将被导入到所述溶液导入空间和所述凹部内的所述第一溶剂中的被导入到所述溶液导入空间的所述第一溶剂向所述溶液排出空间排出，由此在所述凹部内形成被所述第二液体包覆且包含所述微小物质的所述第一液体的液滴。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一步骤中，将所述溶液排出空间设置在所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一步骤中，将所述溶液排出空间设置在所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一步骤中，将所述溶液排出空间设置在所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间并在所述基板内。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一步骤中，将所述溶液排出空间设置在所述插入体的所述下表面的上方，且在所述插入体内。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一步骤中，将所述溶液排出空间设置在所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间并在所述插入体内。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在所述第二步骤中，将所述第一溶液通过流动路径导入到所述溶液导入空间，所述流动路径形成于所述插入体和/或所述基板并在所述溶液导入空间具有出口。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，所述插入体具有在插入方向的两端具备凸缘的筒管状形状，
使该插入体的所述下表面为与所述基板的所述凹部形成面具有大致相同形状的第一凸缘，
该第一凸缘将所述基板的所述凹部形成面的上方空间划分为以下两个空间：位于该第一凸缘与所述凹部形成面之间的所述溶液导入空间、和位于该第一凸缘上方的所述溶液排出空间。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，在所述第二步骤与所述第三步骤之间，进一步包括控制所述基板温度的步骤，所述基板形成有孔。
10.在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入微小物质的方法，其包括：
(A)将插入体配置于所述基板的凹部形成面的上方，使得该插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面相对，向由此形成的所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面之间的溶液导入空间，导入包含所述微小物质和第一溶剂的第一溶液的步骤，以及
(B)将包含与所述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入所述溶液导入空间，将被导入到所述溶液导入空间和所述凹部内的所述第一溶剂中的被导入到所述溶液导入空间的所述第一溶剂，向与所述溶液导入空间连通的溶液排出空间排出，由此在所述凹部内形成被所述第二液体包覆且包含所述微小物质的所述第一液体的液滴的步骤。
11.检测在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入的微小物质的方法，其包括
(1)第一步骤，在所述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与所述基板的相对位置根据设置于所述插入体的支持部进行定位，将所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面对向配置，由此在所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与所述溶液导入空间连通的溶剂排出空间，使所述溶剂排出空间位于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间、所述基板内和/或所述插入体内；以及
(2)第二步骤，将包含所述微小物质和第一溶剂的第一溶液导入所述溶液导入空间内；以及
(3)第三步骤，将包含与所述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入所述溶液导入空间内，将被导入到所述溶液导入空间和所述凹部内的所述第一溶剂中的被导入到所述溶液导入空间的所述第一溶剂向所述溶液排出空间排出，由此在所述凹部内形成被所述第二液体包覆且包含所述微小物质的所述第一液体的液滴；以及
(4)第四步骤，光学、电和/或磁性检测在所述液滴内存在的所述微小物质。
12.基于生色底物的吸光度变化和/或荧光，光学检测在基板的表面互相分开形成的多个凹部的至少一部分中封入的微小物质的方法，其包括：
(1)第一步骤，在所述基板的凹部形成面的上方配置插入体，该插入体与所述基板的相对位置根据设置于所述插入体的支持部进行定位，将所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面对向配置，由此在所述插入体的下表面与所述基板的所述凹部形成面之间设置溶液导入空间，且，
设置与所述溶液导入空间连通的溶剂排出空间，使所述溶剂排出空间位于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间、所述基板内和/或所述插入体内；以及
(2)第二步骤，将包含所述微小物质和所述生色底物和第一溶剂的第一溶液导入所述溶液导入空间内；以及
(3)第三步骤，将包含与所述第一溶剂为非混合性的第二溶剂的第二液体导入所述溶液导入空间，将被导入到所述溶液导入空间和所述凹部内的所述第一溶剂中的被导入到所述溶液导入空间的所述第一溶剂向所述溶液排出空间排出，由此在所述凹部内形成被所述第二液体包覆且包含所述微小物质的所述第一液体的液滴；以及
(4)第四步骤，检测将在所述液滴内存在的所述生色底物的吸光度变化和/或荧光。
13.微小物质检测用装置，其包含：具备互相分开而形成多个封入微小物质的凹部的表面的基板、和在所述基板的凹部形成面的上方配置的插入体，
所述插入体具备用于定位与所述基板的相对位置的支持部，
在所述基板的所述凹部形成面与在其上方对向配置的所述插入体的下表面之间，设置溶液导入空间，
设置与所述溶液导入空间连通的溶液排出空间，使所述溶液排出空间位于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间、所述基板内和/或所述插入体内；且，
在所述插入体和/或所述基板形成有在所述溶液导入空间具有出口的流动路径。
14.根据权利要求13所述的装置，其被构成为能够使得在所述溶液导入空间内保持的第一溶剂置换为与所述第一溶剂为非混合性的第二溶剂，并向所述溶液排出空间排出，所述第二溶剂通过所述流动路径被导入所述溶液导入空间内。
15.根据权利要求14所述的装置，其被构成为使得在所述溶液导入空间内及所述凹部内保持的包含所述微小物质和所述第一溶剂的第一液体中的在所述溶液导入空间内保持的该第一液体，利用第二液体向所述溶液排出空间排出，在所述凹部内形成被所述第二液体包覆且包含所述微小物质的所述第一液体的液滴，所述第二液体通过所述流动路径被导入所述溶液导入空间内，并包含与所述第一溶剂为非混合性的第二溶剂。
16.根据权利要求13所述的装置，其中，所述溶剂排出空间设置于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间。
17.根据权利要求13所述的装置，其中，所述溶剂排出空间设置于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板内。
18.根据权利要求13所述的装置，其中，所述溶剂排出空间设置于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间并在所述基板内。
19.根据权利要求13所述的装置，其中，所述溶剂排出空间设置于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述插入体内。
20.根据权利要求13所述的装置，其中，所述溶剂排出空间设置于所述插入体的所述下表面的上方，且在所述基板与所述插入体之间并在所述插入体内。
21.根据权利要求13所述的装置，其中，所述插入体具有在插入方向的两端具备凸缘的筒管状形状，
使该插入体的所述下表面为与所述基板的所述凹部形成面具有大致相同形状的第一凸缘，
该第一凸缘将所述基板的所述凹部形成面的上方空间划分为以下两个空间：位于该第一凸缘与所述凹部形成面之间的所述溶液导入空间、和位于该第一凸缘的上方的所述溶液排出空间。
22.根据权利要求21所述的装置，其中，所述支持部为在所述插入体的上端侧环绕设置的第二凸缘，
该第二凸缘在向所述基板的凹部形成面的上方配置时与所述基板锁合，所述插入体的从所述第一凸缘到该第二凸缘的高度为所述溶液排出空间的高度。
23.根据权利要求21所述的装置，其中，所述支持部为配置于所述插入体的所述下表面的突起，所述突起的高度为所述溶液导入空间的高度。
24.根据权利要求21～23中任一项所述的装置，其中，在向所述凹部形成面的上方配置时，该第一凸缘与所述基板之间形成的间隙以液体能够流通的方式连通所述溶液导入空间与所述溶液排出空间。
25.根据权利要求20～22中任一项所述的装置，其中，所述插入体的所述第一凸缘具有缺口，
在向所述凹部形成面的上方配置时，该缺口以液体能够流通的方式连通所述溶液导入空间与所述溶液排出空间。
26.根据权利要求13～25中任一项所述的装置，其中，所述插入体至少在其下表面中为不透光性的。
27.根据权利要求13～26中任一项所述的装置，其中，在所述插入体向所述基板的凹部形成面的上方配置时，所述支持部与所述基板嵌合。
28.根据权利要求13～27中任一项所述的装置，其进一步具备控制所述基板的温度的温度调节器。
29.根据权利要求13～28中任一项所述的装置，其进一步具备对所述凹部内存在的所述微小物质进行光学、电和/或磁性检测的检测器。
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