CN110387373A

CN110387373A - 环颈雉催乳素蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110387373A
Application number: CN201910671743.4A
Authority: CN
Inventors: 何川; 孟和; 肖璐; 杨凌宇; 徐珂; 丁金梅; 周浩; 郑煜明; 韩铖潇; 罗怀希; 严菲月
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2019-10-29

Abstract

本发明涉及一种环颈雉催乳素蛋白及其编码基因与应用，属于生物工程技术领域。环颈雉催乳素蛋白的编码基因，是如下任意一种编码基因：A)所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；B)所述编码基因的核苷酸序列在高严谨条件下与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列杂交，且编码环颈雉催乳素蛋白。环颈雉催乳素蛋白，其是如下的蛋白：A)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；B)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得且具有调空环颈雉就巢行为的衍生蛋白质。所述环颈雉催乳素蛋白作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。与现有技术相比，本发明为研究环颈雉就巢行为提供了重要参考。

Description

环颈雉催乳素蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种环颈雉催乳素蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

催乳素(prolactin，PRL)是垂体前叶分泌的一种多肽激素，与生长激素、胎盘催乳素属于同一基因家族。催乳素在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类具有多种不同的功能，如电解质平衡、调节渗透压、生长和发育、内分泌和代谢、免疫调控和保护、繁殖功能和就巢行为等超过300种功能，因而也被誉为“万能激素催”。

母禽和大多数雌鸟在自然状态下产完一窝蛋后就会表现就巢行为，这是其孵化雏鸟必不可少的繁殖行为。现代商业养禽生产已普遍采用人工孵化技术，不需要也不欢迎这种就巢行为，因为就巢时终止产蛋。家禽中除了以白莱航鸡以及由此为基础育成的蛋鸡品系和鸭等无就巢习性外，大多数品种的鸡、火鸡和鹅都具有程度不同的就巢性。迄今的研究表明，具有就巢或抱窝习性的雌禽，在连续的产蛋过程中，伴随卵巢活动而分泌的雌激素和孕酮，通过作用于下丘脑，促进下丘脑多巴胺能(DA)和5-羟色胺(5-HT)能神经元活性增高，然后再促进血管活性肠肽(VIP)的分泌。当VIP分泌增强后，就促进垂体催乳素分泌。催乳素分泌达到一定程度后，就促进母禽在进巢产蛋不断加强，最后固定为持续占据产蛋巢的就巢行为。

环颈雉(美国七彩山鸡)是一种肉蛋兼用型品种，具有体型丰满、产蛋多、体重较大、肉质优、抗病力强、一致性好、遗传稳定等特点。环颈雉的就巢行为影响其蛋产量，因而影响催乳素的分泌或其活性，可以抑制就巢的发生，从而延长其产蛋时间提高产蛋繁殖性能。

经过对现有技术的文献检索发现，未发现环颈雉催乳素蛋白及其相应编码基因PRL的有关报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种环颈雉催乳素蛋白及其编码基因与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种环颈雉催乳素蛋白的编码基因，是如下任意一种编码基因：

A)所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，称之为PRL基因，序列长度为690bp，所述的PRL基因编码229个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；

B)所述编码基因的核苷酸序列在高严谨条件下与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列杂交，且编码环颈雉催乳素蛋白。

一种环颈雉催乳素蛋白，由所述编码基因编码。

所述环颈雉催乳素蛋白，其是如下的蛋白：

A)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

B)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得且具有调空环颈雉就巢行为的衍生蛋白质。

一种重组表达载体，包含所述的编码基因。

一种重组表达转化体，包含所述的重组表达载体。

一种所述环颈雉催乳素蛋白的应用，所述环颈雉催乳素蛋白作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。

一种所述重组表达载体的应用，所述重组表达载体作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。

一种所述重组表达转化体的应用，所述重组表达转化体作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。

一种获取环颈雉催乳素蛋白的编码基因的方法，进行PCR反应的正向引物为

SEQ ID No.3：5’-ACTCCAATCCCACTGCTA-3’；

反向引物为：

SEQ ID No.4：5’-CAGCCCAGAGGTACTTAG-3’。

通过RT-PCR扩增，可从雉鸡的血液、组织基因组DNA中扩增得到PRL基因。通过克隆到大肠杆菌表达载体pMD18-T上，转化到表达宿主细胞中，挑选白色菌落，该转化子为PRL表达工程菌株。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

克隆并测序得到了环颈雉催乳素蛋白PRL基因的cDNA序列，为催乳素蛋白提供了重要的基因资源。通过基因工程获得的蛋白，能够为研究和调控环颈雉就巢行为提供基础资料。

附图说明

图1为不同物种PRL氨基酸序列系统进化树；

图2为构建系统发生树所用PRL氨基酸同源性比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：环颈雉PRL基因cDNA序列的克隆

1.血液采集

样品选用环颈雉屠宰后新鲜肝脏组织，迅速放入液氮中冷冻，保存于-70℃备用。

2.总RNA提取

所有用到的枪头、EP管和匀浆管经0.1％浓度的DEPC水浸泡过夜后，高压灭菌30分钟，60℃烘干使用。取100mg在液氮中冻存的组织样，放入有1ml Trizol(Trizol reagent,Invitrogen)的匀浆管中匀浆。4℃ 12000g离心10分钟，吸取上清液，室温孵育5分钟；加0.2ml氯仿，盖上盖子，剧烈震荡15秒，室温孵育2-3分钟；4℃ 12000g离心15分钟，吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀；室温孵育10分钟，4℃ 12000g离心10分钟，倒掉上清，加1ml75％乙醇洗涤，4℃ 7500g离心10分钟，真空干燥。溶于RNase free无菌水中，-70℃保存。

3.RT-PCR扩增

参考鸡的PRL基因同源序列设计引物，用于环颈雉肝脏组织中总RNA为模板的RT-PCR扩增，以获得环颈雉PRL基因cDNA序列。用Primer Premier 5.0设计，生物公司合成。引物序列信息如下：

PCR的正向引物为：

SEQ ID No.3：5’-ACTCCAATCCCACTGCTA-3’；

反向引物为：

SEQ ID No.4：5’-CAGCCCAGAGGTACTTAG-3’。

按照Takara反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT-PCR Kit)流程进行反转录。反应液组成如下：1μl dNTP Mixture，1μl反向引物，1μl模板RNA，7μl RNase Free无菌水。在PCR仪上进行变性退火反应65℃ 5分钟。向反应液中加入4μl 5×PrimeScript Buffer，0.5μlRNase Inhibitor，0.5μl PrimeScript RTase溶液和5μl RNase Free水。在PCR仪上按下列条件进行反转录：30℃ 10分钟，50℃ 25分钟，95℃5分钟。取反转录反应液5μl，加入5μl 10×PCR Buffer II，2μl dNTP Mixture，0.5μl正向引物溶液，0.5μl反向引物溶液和0.5μlTaKaRa Ex Taq HS溶液，加入灭菌水稀释至50μl。98℃ 10秒，68℃ 1分钟，30个循环。4℃保存。

4.克隆和测序

按照Takara胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)流程回收扩增获得的DNA片段。对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出片段长度约690bp的PCR产物位置的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积量的胶块溶解液Buffer GM，均匀混合后室温溶解，转移到吸附柱中，12000rpm离心1分钟。加入700μl的Buffer WB，室温12000rpm离心30秒，弃滤液，重复一次。将吸附柱置于新的EP管中，室温12000rpm离心一分钟洗脱DNA。

回收片段采用TaKaRa pMD18-T载体克隆试剂盒同T载体连接。流程为：在离心管中加入1μl pMD 18-T载体，0.2pmol DNA，加灭菌水至5μl，最后加入5μl的Solution I溶液。16℃反应30分钟。加入至100μl感受态细胞中，冰浴30分钟。42℃加热45秒后，冰浴1分钟。加入890μl SOC培养基，37℃震荡培养60分钟。在含有X-Gal，IPTG，Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

质粒回收采用天根质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)，按照试剂盒流程说明操作。取20μl重组质粒于离心管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。

实施例2：环颈雉PRL基因编码序列同源性比较

本发明新的环颈雉PRL基因CDS区长度为690bp，其中1-3位为起始密码子ATG，688-690位为终止密码子TAA，详细序列见SEQ ID No.1。根据全长CDS推导出环颈雉的氨基酸序列共229个氨基酸残基，详见SEQ ID No.2。根据在线预测工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测结果，PRL基因产生的蛋白质等电点为5.92，分子量为25689.30道尔顿。

在Ensembl上搜索并获得人、鼠、鸡、鸭、火鸡、鹌鹑的PRL基因编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID No.2序列，利用分子生物学软件MEGA 7构建了极大似然进化树，见图1、图2。结果显示，环颈雉与火鸡亲缘关系最近，与鸡和鹌鹑亲缘关系次之，证明了序列的可靠性。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 环颈雉催乳素蛋白及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 环颈雉(Phasianus colchicus)

<400> 1

atgagcaaca caggggcttc actgaaaggt ttgttgctgg cggttcttct ggtgtccaac 60

atgcttctga ccaaggaagg agtgacctcc ttgccaatct gctccagtgg atctggcaac 120

tgccaagttt cccttgggga actttttgat cgggcagtta gactttcaca ttccctacac 180

ttcctctctt cagaaatatt caatgaattt gatgaacgct atgctcaagg tcggggtttc 240

attgcaaaag ctgttaatgg ctgccacact gcctccttaa ccactcctga agataaggag 300

caaactcagc agattcatca cgaagagcta ctgaatttga tactgggagt gctgcgttcc 360

tggaatgatc ccctgatcca tctggcctcc gaagtgcaaa gaatcaaaga agctccagac 420

accatcctct ggaaggctgt agagattgaa gagcaaaaca agaggcttct agaaggaatg 480

gagaaaatag ttgggcggat tcattctgga gatgctggaa atgaagtttt ctctcagtgg 540

aacggccttc catccctgca actcgctgat gaggactcca gactctttgc tttttacaac 600

ctgctgcatt gcctccgcag agattcccac aaaatcgaca actatcttaa agttttgaag 660

tgccgcctaa tccacgataa caattgctaa 690

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 环颈雉(Phasianus colchicus)

<400> 2

Met Ser Asn Thr Gly Ala Ser Leu Lys Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu

1 5 10 15

Leu Val Ser Asn Met Leu Leu Thr Lys Glu Gly Val Thr Ser Leu Pro

20 25 30

Ile Cys Ser Ser Gly Ser Gly Asn Cys Gln Val Ser Leu Gly Glu Leu

35 40 45

Phe Asp Arg Ala Val Arg Leu Ser His Ser Leu His Phe Leu Ser Ser

50 55 60

Glu Ile Phe Asn Glu Phe Asp Glu Arg Tyr Ala Gln Gly Arg Gly Phe

65 70 75 80

Ile Ala Lys Ala Val Asn Gly Cys His Thr Ala Ser Leu Thr Thr Pro

85 90 95

Glu Asp Lys Glu Gln Thr Gln Gln Ile His His Glu Glu Leu Leu Asn

100 105 110

Leu Ile Leu Gly Val Leu Arg Ser Trp Asn Asp Pro Leu Ile His Leu

115 120 125

Ala Ser Glu Val Gln Arg Ile Lys Glu Ala Pro Asp Thr Ile Leu Trp

130 135 140

Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met

145 150 155 160

Glu Lys Ile Val Gly Arg Ile His Ser Gly Asp Ala Gly Asn Glu Val

165 170 175

Phe Ser Gln Trp Asn Gly Leu Pro Ser Leu Gln Leu Ala Asp Glu Asp

180 185 190

Ser Arg Leu Phe Ala Phe Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg Arg Asp

195 200 205

Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Val Leu Lys Cys Arg Leu Ile

210 215 220

His Asp Asn Asn Cys

225

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

actccaatcc cactgcta 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cagcccagag gtacttag 18

Claims

1.一种环颈雉催乳素蛋白的编码基因，其特征在于，是如下任意一种编码基因：

A)所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2.一种环颈雉催乳素蛋白，其特征在于，由权利要求1所述编码基因编码。

3.根据权利要求2所述一种环颈雉催乳素蛋白，其特征在于，其是如下的蛋白：

A)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的编码基因。

5.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种如权利要求2或3所述环颈雉催乳素蛋白的应用，其特征在于，所述环颈雉催乳素蛋白作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。

7.一种如权利要求4所述重组表达载体的应用，其特征在于，所述重组表达载体作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。

8.一种如权利要求5所述重组表达转化体的应用，其特征在于，所述重组表达转化体作为制备调控环颈雉就巢行为的药剂、添加剂或食物的应用。

9.一种获取环颈雉催乳素蛋白的编码基因的方法，其特征在于，进行PCR反应的正向引物为

SEQ ID No.3：5’-ACTCCAATCCCACTGCTA-3’；

反向引物为：

SEQ ID No.4：5’-CAGCCCAGAGGTACTTAG-3’。