CN110343739A - 一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物抗病鉴定技术领域，提供了一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，包括以下步骤：收集离心管盖、制备菌丝模块、田间接菌、表型观察统计。本发明利用离心管盖对包含菌丝的琼脂块进行保湿，并用保鲜膜包裹进一步保湿和固定，接菌之后不用进行连续7天的人工喷雾来保持田间湿度以促进发病，方法简单可靠，方便田间大规模接种；接种效率高，成功率高，结果稳定；能够有效保证田间接种后菌丝块的湿度和发病条件一致，适合对材料进行大规模接种鉴定。
Description
技术领域
本发明属于植物抗病鉴定技术领域，具体涉及一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法。
背景技术
油菜的菌核病是由核盘菌引起的真菌性病害。在油菜的生长过程中，核盘菌是影响油菜产量最重要的病害之一，每年由菌核病造成的产量损失严重时达80％以上。培育抗菌核病的品种是防治菌核病最有效的途径。目前最能反映油菜菌核病抗性的鉴定方法是在油菜的成株期进行茎秆接菌鉴定。成株期茎秆接种法有田间牙签接种法、离体茎秆接种法。其中田间牙签接种法、茎秆菌丝块捆绑法简单易行，适合大规模田间接种，但该方法容易受大田环境条件的影响，尤其是田间湿度低，接种失败率高，鉴定结果不稳定。离体茎秆接种法需要采集至少10个单株的茎秆进行温室接种，由于对植物造成了不可逆的伤害，不利于后期对油菜产量和品质性状的调查，不适用于大规模接种。因此本发明提出了一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，能确保不同品种的充分发病、可操作性强、简便易行，大幅度提高了诱发鉴定的效率。
发明内容
针对这种情况，本发明提供了一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，可有效解决现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)收集离心管盖子
收集实验室的废弃离心管，用剪刀将离心管的盖子剪下来，清洗掉盖子表面杂质，然后将所述盖子用消毒液浸泡1h后洗净，晾干；
2)制备菌丝模块
用打孔器在铺满核盘菌菌丝的PDA培养基的边缘打取PDA菌丝块，用镊子将所述PDA菌丝块装载在离心管盖子内，菌丝面向上，然后将所述离心管盖子分散地放在方盒中，盖紧上层盒盖，并用黑色袋子密封方盒，待菌丝模块萌发1h-5h备用；
3)田间接菌
将制备好的菌丝模块拿到田间，用大拇指和食指捏紧离心管柄或两侧，将所述菌丝模块贴近油菜茎秆，然后用保鲜膜将所述菌丝模块固定在茎秆上；
4)田间表型观察统计
离体茎秆接菌在接菌3天后测量菌斑长度，活体茎秆接菌在接种7天后测量菌斑长度。
优选的，所述步骤1)中离心管为实验室配置PCR、DNA提取等环节所产生的废弃1.5mL或2.0mL的离心管。
优选的，所述步骤2)中打孔器直径为8mm，制备的PDA菌丝块直径也为8mm。
优选的，所述步骤2)中方盒垫有2层12×16cm的湿草纸，所述方盒四壁呈倾斜状。
优选的，所述步骤2)中，PDA培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000ml。
优选的，所述步骤2)中，保存的核盘菌菌丝在PDA培养基上培养的温度为22℃。
优选的，步骤3)中菌丝模块固定在茎秆离地面50cm处。
本发明所具有的有益效果为：
(1)本发明的方法简单易行，接种效率高，能够有效保证田间接种菌丝块的湿度和发病条件一致，方便田间大规模接种鉴定。
(2)接菌7天后仍然能够保证菌丝块的湿度和完整性，而且无需连续进行田间喷雾来保证发病的湿度，增加了接菌成功率，结果稳定。
(3)实验中承载PDA菌丝块的装置是离心管盖子，是对废物的循环利用。
附图说明
图1是本发明操作步骤框图；
图2是本发明操作步骤的菌丝模块图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明具体实施例如下：
实施例1
1)收集用于其它试验废弃的离心管盖子
收集实验室用于配置PCR、DNA提取等环节所产生的废弃1.5mL或2.0mL的离心管，用剪刀将整个离心管的盖子剪下来，清洗掉表面杂质，再用84浸泡1h后冲洗干净，充分晾干备用。
2)PDA培养基的制备
购买新鲜的土豆，削皮去除芽点，称取200g的马铃薯，切成碎块后加1000mL ddH2O大火煮沸，再用小火煮30min，然后用两层湿纱布过滤所得的滤液加ddH2O至900mL。再加入琼脂20g(配置液体培养基时不加)，葡萄糖20g，搅匀使其溶解后定容至1000mL，灭菌分装于培养皿中密封备用，每个培养皿中分装的PDA培养基厚度不小于5mm。
3)核盘菌的培养与活化
从4℃冰箱中取出保存的核盘菌菌种，用打孔器取直径5mm的含有菌丝块的培养基，置于配置好的PDA培养基平板上，封好培养皿之后将其倒置防止培养基中的水汽影响菌丝的萌发，22℃暗光培养至菌丝长至培养皿的边缘，取该培养基边缘生长旺盛的菌丝再次在PDA平板上培养，22℃暗光培养至菌丝长至培养皿的边缘即可进行接菌实验。
4)室内制备菌丝模块
接菌时间选择油菜终花期，接菌实验当天，在实验室中用直径8mm的打孔器从培养皿上制备大小一致的菌丝块，再用镊子小心地装载在离心管盖子内，菌丝面向上，分散地放在垫有2层湿草纸12×16cm的方盒中。选择的盒子四壁带一点角度，以方便盒子与盒子之间能够叠放，又不会对底层的菌丝块造成挤压。最后，盖紧上层盒盖以保证盒内湿度，用黑色袋子对其遮光萌发1-5h备用。
5)菌丝模块接种
将制备好的菌丝模块拿到田间，每人一盒。在进行田间菌丝模块接种时，首先用大拇指和食指捏紧离心管柄或两侧，将菌丝块贴近油菜茎秆，然后用保鲜膜将菌丝模块固定在离地面50cm的茎秆处。注意操作过程中不能用手触及菌丝块表面。
实施例2
1.PDA培养基的制备
购买新鲜的土豆，削皮去除芽点，称取200g的马铃薯，切成碎块后加1000mL ddH2O大火煮沸，再用小火煮30min，然后用两层湿纱布过滤所得的滤液加ddH2O至900mL。再加入琼脂20g(配置液体培养基时不加)，葡萄糖20g，搅匀使其溶解后定容至1000mL，灭菌分装于培养皿中密封备用，每个培养皿中分装的PDA培养基厚度不小于5mm。
2.核盘菌的培养与活化
从4℃冰箱中取出保存的核盘菌菌种，用打孔器取直径5mm的含有菌丝块的培养基，置于配置好的PDA培养基平板上，封好培养皿之后将其倒置防止培养基中的水汽影响菌丝的萌发，22℃暗光培养至菌丝长至培养皿的边缘，取该培养基边缘生长旺盛的菌丝再次在PDA平板上培养，22℃暗光培养至菌丝长至培养皿的边缘即可进行接菌实验。
3.离体茎秆接种
在温室中，用离体茎秆接种法进行油菜茎秆接种。
实施例3
a.PDA培养基的制备
购买新鲜的土豆，削皮去除芽点，称取200g的马铃薯，切成碎块后加1000mL ddH2O大火煮沸，再用小火煮30min，然后用两层湿纱布过滤所得的滤液加ddH2O至900mL。再加入琼脂20g(配置液体培养基时不加)，葡萄糖20g，搅匀使其溶解后定容至1000mL，灭菌分装于培养皿中密封备用，每个培养皿中分装的PDA培养基厚度不小于5mm。
b.核盘菌的培养与活化
从4℃冰箱中取出保存的核盘菌菌种，用打孔器取直径5mm的含有菌丝块的培养基，置于配置好的PDA培养基平板上，封好培养皿之后将其倒置防止培养基中的水汽影响菌丝的萌发，22℃暗光培养至菌丝长至培养皿的边缘，取该培养基边缘生长旺盛的菌丝再次在PDA平板上培养，22℃暗光培养至菌丝长至培养皿的边缘即可进行接菌实验。
c.菌丝块捆绑法
在田间，用菌丝块捆绑法进行油菜活体茎秆接种。
表型观察和统计
为了比较离体茎秆接菌、仅保鲜膜固定的活体茎秆接菌和本方法所提供的活体茎秆之间的优劣，本研究对8种不同的甘蓝型油菜进行这3种方法的接菌实验，离体茎秆接菌在接菌3天后测量菌斑长度，活体茎秆接菌在接种7天后测量菌斑长度。实验结果显示，离体茎秆接菌的结果显著小于菌丝模块和菌丝琼脂块接菌；菌丝模块和菌丝琼脂块接菌的结果相比，两种方法的接菌结果相当，而菌丝模块接种法的重复性高，误差较小；三种方法中菌丝模块接菌与离体茎秆接菌的成功率相当，接菌成功率的变异区间均为95％-100％，比菌丝琼脂块直接接菌的成功率高，其变异区间为70％-95％(具体表现见表1)。
表1.三种接菌方法的接菌效果比较
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)收集离心管盖
收集实验室的废弃离心管，将离心管的盖子剪下来，清洗掉盖子表面杂质，然后将所述盖子用消毒液浸泡1h后洗净，晾干；
2)制备菌丝模块
用打孔器在铺满核盘菌菌丝的PDA培养基边缘打取PDA菌丝块，用镊子将所述PDA菌丝块装载在离心管盖子内，菌丝面向上，然后将所述离心管盖子分散地放在方盒中，盖紧上层盒盖，并用黑色袋子密封方盒；
3)田间接菌
将制备好的菌丝模块拿到田间，将所述菌丝模块贴近油菜茎秆，用保鲜膜将所述菌丝模块固定在茎秆上；
4)表型观察统计
离体茎秆接菌在接菌3天后测量菌斑长度，活体茎秆接菌在接种7天后测量菌斑长度。
2.根据权利要求1所述的一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，所述步骤1)中离心管为实验室配置PCR、DNA提取等环节所产生的废弃1.5mL或2.0mL的离心管。
3.根据权利要求1所述的一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中打孔器直径为8mm，打取的PDA菌丝块直径也为8mm。
4.根据权利要求1所述的一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中方盒大小为12×16cm，所述方盒四壁呈倾斜状，且垫有2层湿草纸。
5.根据权利要求1所述的一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中，PDA培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000ml，且分装后的PDA培养基平板厚度不低于5mm。
6.根据权利要求1所述的一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中保存的核盘菌菌丝在PDA培养基上培养的温度为22℃。
7.根据权利要求1所述的一种油菜田间茎秆接种核盘菌的方法，其特征在于，所述步骤3)中菌丝模块固定在茎秆离地面50cm处。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191018 |
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