CN110168373A - 确定癌症预后 - Google Patents

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Abstract

本文提供了确定癌症(例如非小细胞肺癌(NSCLC))的侵袭性、预后和对治疗的响应的方法，其包括确定来自受试者的外泌体样品中一种或多种差异表达的蛋白质标志物的表达水平。还提供了用于治疗癌症的方法和药剂。

Description

确定癌症预后
技术领域
本发明涉及癌症。更具体地，本发明涉及确定癌症、特别是肺癌的预后的方法。
背景技术
在许多国家，肺癌是导致癌症死亡和疾病负担的主要原因。举例来说，在澳大利亚，肺癌在男性每14例死亡中占1例，并且在任何原因的女性每25例死亡中占1例。目前，对于肺癌，患者无法分为响应和不响应类别。
对于足够适合手术切除的人来说，手术被认为是治疗早期肺癌的最佳方法。尽管如此，临床分期并不完美，因为由治疗意图(curative intent)治疗的人仍然有很大的复发机会。例如，在I期、II期或IIIA期非小细胞肺癌(NSCLC)中，尽管有潜在的治愈性手术，但大约40％至50％的IB期NSCLC患者、55％至70％的II期NSCLC患者以及更大百分比的IIIA期NSCLC患者最终会疾病复发并死亡。最近，更多活跃的铂基组合和一些大型临床试验证明了，辅助化疗对切除的NSCLC的有效性已经导致使用辅助化疗来改善完全切除NSCLC的患者的结果。
目前，病理性(TNM)分期是决定肺癌复发可能性的最重要的预后因素。已经对基因组生物标志物的潜在预后价值进行了研究3-5，但是与乳腺癌不同，此时并没有生物标志物常规用于临床上，在乳腺癌的情况下FDA批准的测试越来越多地用于患者(例如，OncotypeDX)。类似地，已提出包括蛋白质表达和蛋白质组学的其他生物标志物用于肺癌，但它们尚未在临床上常规应用。
因此，在用治疗意图治疗后仍然迫切需要准确的预后生物标志物，因为明显可治愈的肺癌相当大比例的NSCLC患者在经历作为主要治疗的完全切除或化放疗之后最终仍会复发和再发。需要预后因素来指导临床医生确定哪些患者可能从辅助化疗中受益，以及谁将遭受潜在的化学疗法相关的不良反应而无任何获益。
除上述之外，传统的经验证的预后生物标志物通常需要进行侵入性活组织检查。然而，在NSCLC患者中，共病和一般健康问题使得20％的患者不适合进行此类活组织检查。此外，活组织检查本身可能导致损伤和炎症，增加NSCLC患者的发病率和死亡率。因此，需要一种评估微创取样(例如血液检查)的患者结果的改进方法。
发明内容
本发明广泛地涉及确定一种或多种外泌体蛋白的表达水平作为受试者中癌症发展的预后标志物。在一些方面，本发明还广泛地涉及使用此类外泌体蛋白治疗癌症以告知治疗选择或决策。在特定形式中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌。
在第一方面，本发明提供了一种确定受试者中的癌症侵袭性的方法，所述方法包括确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的表达水平表明癌症的侵袭性水平或与之相关。
在第二方面，本发明提供了一种确定受试者中的癌症预后的方法，所述方法包括确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的表达水平表明所述癌症的不太有利或更有利的预后或与之相关。
在上述方面的方法的一个实施方案中，所述一种或多种标志物的相对降低的表达水平表明更有利的预后和/或侵袭性较小的癌症或与之相关；和/或所述一种或多种标志物的相对增加的表达水平表明更不利的预后和/或高度侵袭性癌症或与之相关。
适当地，第一和第二方面的方法还包括诊断所述受试者具有以下情形的步骤：(i)高度侵袭性癌症或侵袭性较小的癌症；和/或(ii)不太有利的预后或更有利的预后。
在前述方面的方法的一个实施方案中，癌症预后或侵袭性至少部分地用于确定所述受试者中癌症转移的可能性。适当地，所述一种或多种标志物的相对降低的表达水平表明所述癌症转移的可能性降低或与之相关；和/或所述一种或多种标志物的相对增加的表达水平表明所述癌症转移的可能性增加或与之相关。
在第三方面，本发明提供了一种预测癌症对受试者中的抗癌治疗的响应性的方法，所述方法包括确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的改变或调节的表达水平表明癌症对抗癌治疗的相对增加或降低的响应性或与之相关。
关于第一、第二和第三方面的发明，该方法适当地包括治疗受试者中的癌症的其他步骤。
在第四方面，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且基于所做的确定，开始、继续、改变或中断抗癌治疗。
适当地，对于第三和第四方面的方法，抗癌治疗包括向受试者施用治疗有效量的降低所述一种或多种标志物的表达和/或活性的抗癌剂。
在第三和第四方面的方法的一个实施方案中，抗癌治疗包括向受试者施用治疗有效量的预防或抑制所述癌症转移的抗癌剂。
关于第三和第四方面的方法，抗癌剂合适地是抗体或小分子(例如，小的有机或无机分子拮抗剂)。
适当地，前述方面的方法还包括从受试者获得外泌体样品的步骤。
关于前述方面的方法，所述一种或多种标志物适当地选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、中性α-葡糖苷酶AB、60kDa热休克蛋白、赖氨酰氧化酶同源物2、腱生蛋白C、脂肪酸合成酶、集聚蛋白、天冬氨酰氨肽酶、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-5、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-2、蛋白酶体亚基β型-3、蛋白酶体亚基β型-4、蛋白酶体亚基β型-5、蛋白酶体亚基β型-6、蛋白酶体亚基β型-7、蛋白酶体亚基β型-8、血小板反应蛋白-1、潜在转化生长因子β结合蛋白3及其任何组合。在一个具体实施方案中，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、血小板反应蛋白-1及其任何组合。
适当地，前述方面的方法还包括将外泌体样品中的所述一种或多种标志物的表达水平与相应的一种或多种标志物的参照外泌体表达水平进行比较的步骤。
在第五方面，本发明提供了一种鉴定或产生用于治疗受试者癌症的药剂的方法，其包括以下步骤：
(a)将表达表1和/或表2中列出的标志物的细胞与候选药剂接触；和
(b)确定候选药剂是否调节标志物的表达和/或活性。
在某些实施方案中，候选药剂至少部分地减少、消除、遏制或抑制标志物的表达和/或活性。
适当地，前述方面的癌症是或包括肺癌。优选地，肺癌包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞癌和间皮瘤。甚至更优选地，肺癌是非小细胞肺癌。
适当地，上述方面的受试者是哺乳动物，优选人。
除非上下文另有要求，否则术语“包括(comprise/comprises/comprising)”或类似术语旨在表示非排他性的包括，使得所列出的要素或特征列表并不仅仅包括那些所陈述或列出的要素，而是可能包括未列出或陈述的其他要素或特征。
这里使用不定冠词“一(a/an)”来表示或涵盖单个或多个要素或特征，并且不应被视为表示或定义“一个”或“单个”要素或特征。例如，“一”细胞包括一个细胞、一个或多个细胞和多个细胞。
附图说明
图1.外泌体由NSCLC细胞分泌。A外泌体的蛋白质鉴定证明了存在外泌体标志物，并且不存在非外泌体钙联接蛋白。B由NSCLC分泌的外泌体具有预期的尺寸分布。C缺氧增加外泌体的分泌，但不改变外泌体大小范围。D缺氧显著增加NSCLC细胞的外泌体分泌。CL：细胞裂解物；E：外泌体裂解物。
图2.缺氧改变外泌体含量。从来自在常氧(21％O2)或缺氧(2％O2)条件下培养24小时的细胞的条件培养基中收获外泌体。A扫描电子显微镜显示经典的外泌体形态。B定量质谱显示55种蛋白质在缺氧条件下通常上调，n＝5，FDR为1％。C，D用蛋白质印迹和ELISA验证蛋白质靶标。
图3.上调的蛋白质与患者疾病发展相关。A从NSCLC患者分离的外泌体显示出预期的大小范围和形态。B，C体外鉴定的缺氧蛋白质标志物在前18个月内复发的患者中有所上调。D组合蛋白质标记(signature)(GANAB、VCP和半乳糖凝集素-3-结合蛋白)的ROC曲线用于鉴定在12个月内复发的患者。E患者的无病存活率与其外泌体含量有关。与仅在其外泌体中表达一种标志物或不表达标志物的患者相比，具有至少2种上述高度表达的标志物的患者发展迅速。
图4.在缺氧外泌体中鉴定的其他上调蛋白具有预后价值。TNC在缺氧条件下被上调，并且在迅速发展的NSCLC患者的外泌体中含量更高。
图5.患者标记中所用的蛋白质的个体ROC和存活曲线。
图6.NSCLC细胞衍生的外泌体的蛋白质组成的缺氧诱导的变化。a，使用透射电子显微镜评估分离的外泌体的形态。常氧和缺氧SKMES1衍生的外泌体(尺寸条200nm)的图像也表明外泌体浓度的明显上调。b，使用从4种不同NSCLC细胞系分离的外泌体的TRPS进行纳米颗粒分析，证明大多数外泌体具有30至150nm的大小范围。c，定量质谱法鉴定了在H358和SKMES1外泌体中通常上调的32种蛋白质(FDR<0.1％；n＝5)。d，e，对于VCP使用蛋白质印迹分析(FLOT1用作上样对照)，并对于H358、SKMES1、H23和H1975NSCLC细胞系中的MAC2BP、TNC、PSMA2和THBS1使用ELISA(●–H358，■–SKMES1，▲–H23，◆–H1975)，证实了质谱结果。*p<0.05，**p<0.01。
图7.缺氧外泌体标记预测NSCLC患者的疾病发展。a，b，外泌体可以基于如TEM所示的形态学(尺寸条200nm)和20-150nm的尺寸分布从NSCLC血浆中分离。c，TRPS证明，在健康对照组或18个月内发展的患者或18个月未复发的患者的血浆中的外泌体浓度没有差异。d，从NSCLC患者中分离的外泌体显示，与没有复发的患者和健康对照组(FLOT1用作上样对照)相比，在18个月内发展的患者中富含VCP。e，在来源于在18个月内发展的患者的外泌体中，缺氧外泌体标记被上调。f，缺氧蛋白质标志物的数量超过约登指数阈值证实了在18个月内发展的患者或在18个月内不复发的患者之间的明显区分。g，Kaplan-Meier显示基于来自缺氧外泌体标记的蛋白质的丰度，患者DFS的明显区分(≥3种标志物超过约登指数值)。h，ROC曲线证实，缺氧外泌体标记是NSCLC患者的疾病发展(<18个月)的完美预后标志物，而外泌体浓度则没有预后价值。i，Kaplan-Meier曲线证实缺氧外泌体标记也与NSCLC患者的总体存活率相关。
图8.缺氧外泌体标记源自经历过EMT的肺细胞。a，GSEA确认了标志性上皮至间充质转变基因集与来源于缺氧NSCLC细胞的外泌体显著相关。b，正常肺上皮细胞(30KT)和转化的肺间充质细胞(30KTp53/KRAS/LKB1)的免疫荧光，其证明致癌诱导的表型转变为间充质表型。c，细胞裂解物中的蛋白质印迹证实在30KTp53/KRAS/LKB1细胞中上皮标志物E-钙粘蛋白的损失和间充质标志物波形蛋白的增加。d，来源于上皮(30KT)和间充质(30KTp53/KRAS/LKB1)肺细胞的外泌体中VCP的蛋白质印迹(CD9用作上样对照)。e，来源于上皮(30KT)和间充质(30KTp53/KRAS/LKB1)肺细胞的外泌体中MAC2BP、TNC、PSMA2和THBS1的ELISA。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。f，原发性肿瘤的免疫组织化学证明E-钙粘蛋白表达的丧失与分类为高标记组的患者相关(≥3个标志物超过约登指数值)。
图9.确认缺氧外泌体标记可预测NSCLC患者的疾病复发。a，b，在c中在指定点跟踪的2名患者(确认组)的18F-FDG PET/CT图像。c，支持发现组，与18个月后复发的患者相比，在18个月内复发的患者的外泌体浓度是相似的，特别指出患者44和53。d，超过约登指数阈值的缺氧蛋白质标志物的数量证实了在18个月内发展的患者或在18个月内未复发的患者之间的明显区分。e，具有低丰度或高丰度的缺氧外泌体蛋白的NSCLC患者的DFS的Kaplan-Meier曲线图表明DFS中的明显区分。f，ROC曲线分析再次显示了将在18个月内发展的患者的完美分类。g，Kaplan-Meier曲线图证实该标记也是NSCLC患者的总体存活率的预后标志物。
图10.缺氧增加了NSCLC细胞的外泌体分泌。a，从NSCLC细胞系分离的外泌体表达经典外泌体标志物HSP70、FLOT1和CD63。细胞标志物CANX仅存在于细胞裂解物中，而不是外泌体裂解物中。b，缺氧增加NSCLC细胞系的外泌体分泌。n＝3±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图11.发现组证明外泌体蛋白与NSCLC患者的疾病发展相关。a-e，缺氧外泌体标记中每种蛋白质的单个Kaplan-Meier和ROC曲线。
图12.基因集富集分析(GSEA)鉴定了在来源于缺氧NSCLC细胞的外泌体中显著升高的基因集。A，EMT基因集中鉴定的蛋白质的热图。b-e，使用针对标志基因集的总外泌体蛋白表达数据集的GSEA揭示了缺氧外泌体富含与糖酵解、MYC靶标、E2F靶标和异生物质代谢相关的蛋白质(FDR<0.05)。NES-归一化富集评分。
图13.降低的E-钙粘蛋白表达与超过约登指数阈值的标记蛋白的数量相关。a，参考标记评分的IHC评分表。b，低E-钙粘蛋白IHC评分与18个月内复发的患者的关联性更强。
图14.确认组中的上调标记蛋白与DFS相关。a，VCP的蛋白质印迹证实，与18个月后发展的患者相比，在18个月内发展的患者的上调(FLOT1用作上样对照)。b，患者44和53的个别标记值显示与患者44相比，在18个月内发展的患者53具有显著升高的标记蛋白的基线水平。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：在体外鉴定的缺氧诱导的外泌体蛋白是患者中的癌症发展和侵袭性的准确的预后生物标志物。
在一个方面，本发明提供了一种确定受试者中的癌症侵袭性的方法，所述方法包括确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的表达水平表明癌症的侵袭性水平或与之相关。
在一个相关方面，本发明提供了一种确定受试者中的癌症预后的方法，所述方法包括确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的表达水平表明所述癌症的不太有利或更有利的预后或与之相关。
关于上述方面，所述一种或多种标志物适当地选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、中性α-葡糖苷酶AB、60kDa热休克蛋白、赖氨酰氧化酶同源物2、腱生蛋白C、脂肪酸合成酶、集聚蛋白、天冬氨酰氨肽酶、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-5、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-2、蛋白酶体亚基β型-3、蛋白酶体亚基β型-4、蛋白酶体亚基β型-5、蛋白酶体亚基β型-6、蛋白酶体亚基β型-7、蛋白酶体亚基β型-8、血小板反应蛋白-1、潜在转化生长因子β结合蛋白3及其任何组合。在一个具体实施方案中，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、血小板反应蛋白-1及其任何组合。
如本文通常使用的，除非另有说明，否则以下一种或多种的表达水平可以指编码所述蛋白质的核酸(例如，RNA、mRNA和cDNA)、蛋白质本身或两者的表达水平：(a)表1中鉴定为上调的55种标志物蛋白；和(b)表2中鉴定为上调的32种标志物蛋白。
如本文通常使用的，术语“癌症”、“肿瘤”、“恶性”和“恶性肿瘤”是指疾病或病症，或与疾病或病症相关的细胞或组织，其特征在于异常或反常的细胞增殖、分化和/或迁移，通常伴随有异常或反常的分子表型，其包括一种或多种遗传突变或与肿瘤发生相关的其他遗传变化、肿瘤标志物的表达、肿瘤抑制因子表达或活性的丧失和/或异常或反常的细胞表面标志物表达。
“侵袭性”和“侵袭性的”是指癌症由于特征或因素的组合中的一种或多种而具有相对差的预后的性质或倾向，所述特征或因素包括：对可用于癌症治疗的治疗的至少部分抗性；侵袭力；转移可能性；治疗后复发；和低的患者存活可能性，但不限于此。
在具体的实施方案中，本文提供的蛋白质(例如表1和表2中提供的蛋白质)是侵袭性疾病的预后，特别是较短的病理复发时间和/或较短的患者存活时间。在其他实施方案中，本文提供的蛋白质(例如表1和表2中提供的蛋白质)与转移性癌症相关或指示转移性癌症，更具体地是转移性NSCLC。在这方面，显而易见的是，表2中提供的32种蛋白质中的许多也列于表1中，除了例如LTBP3。
癌症可以包括任何侵袭性或潜在侵袭性癌症、肿瘤或其他恶性肿瘤，例如在http://www.cancer.gov/cancertopics/alphalist的NCI癌症索引中列出的，包括所有主要癌症形式，例如肉瘤、癌、淋巴瘤、白血病和胚细胞瘤，但不限于此。这些癌症可能包括乳腺癌、肺癌(包括肺腺癌和间皮瘤)、生殖系统癌症(包括卵巢癌、宫颈癌、子宫癌和前列腺癌)、脑和神经系统癌症、头颈癌、胃肠癌(包括结肠癌、结肠直肠癌和胃癌)、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如黑素瘤和皮肤癌)、血细胞癌(包括淋巴癌和骨髓单核细胞癌)、内分泌系统癌症(例如胰腺癌和垂体癌)、肌肉骨骼癌(包括骨癌和软组织癌)，但不限于此。
在具体实施方案中、癌症包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、脑和神经系统癌、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、胰腺癌、垂体癌或肾上腺癌。更优选地，癌症是或包括肺癌，例如NSCLC。
在具体实施方案中，本文公开的方面的癌症是或包括肺癌。为此，显而易见的是，肺癌可包括本领域已知的任何侵袭性肺癌和癌症亚型，例如非小细胞癌(即鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌)、小细胞癌和间皮瘤。在一个优选的实施方案中，肺癌是或包含非小细胞肺癌(NSCLC)。
术语“预后”和“预后性”在本文中用于包括预后，其可以预测临床结果(有或没有医学治疗)、选择适当的治疗过程(或治疗是否有效)和/或监测当前治疗并可能改变治疗。这可以至少部分地基于通过本发明的方法确定一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达水平，其可以与确定另外的蛋白质和/或其他核酸生物标志物的表达水平组合。预后还可以包括预测、预见或预报在癌症成功治疗或以其他方式解决之后受试者所遭受的癌症的任何持久或永久的身体或心理影响。此外，预后可包括以下一种或多种：确定转移可能性或发生，确定治疗响应性，实施适当治疗方案，确定治疗后癌症复发的概率、可能性或潜在性，以及预测对已建立疗法(例如化学疗法)的抗性发展。应当理解，积极预后(positiveprognosis)典型地是指有益的临床结果或前景，例如没有受试者癌症复发的长期存活，而消极预后(negative prognosis)典型地是指负面的临床结果或前景，例如癌症复发或发展。
在前述两个方面的方法的一个实施方案中，所述一种或多种标志物的相对降低的表达水平表明更有利的预后和/或侵袭性较小的癌症或与之相关；和/或所述一种或多种标志物的相对增加的表达水平表明更不利的预后和/或高度侵袭性癌症或与之相关。
在一个具体实施方案中，癌症预后或侵袭性至少部分地用于确定所述受试者中癌症转移的可能性。
如本文所用，“转移”或“转移性”是指恶性肿瘤细胞或肿瘤经由循环系统或淋巴系统或经由天然体腔迁移或转移，典型地从肿瘤、癌症或瘤形成的原发病灶迁移或转移到体内的远端位点，并且一个或多个新位置的一个或多个继发性肿瘤或其集落随后继续发展。“转移”是指由于转移而形成的继发性肿瘤或集落，并且涵盖微转移以及区域性(包括淋巴结)和远处转移。
适当地，所述一种或多种标志物的相对降低的表达水平表明所述癌症转移的可能性降低或与之相关；和/或所述一种或多种标志物的相对增加的表达水平表明所述癌症转移的可能性增加或与之相关。
在一个实施方案中，癌症预后或侵袭性至少部分地用于确定受试者是否将受益于癌症的治疗。举例来说，具有有利的预后和/或侵袭性较小的癌症的患者不太可能遭受癌症和/或转移的快速局部发展，并且可以免于侵入性更大的监测和/或治疗。
在另一个实施方案中，癌症预后或侵袭性至少部分地用于制定受试者的治疗策略。
在一个实施方案中，癌症预后或侵袭性至少部分地用于确定受试者中的疾病发展或复发。
在一个实施方案中，癌症预后或侵袭性至少部分地用于确定估计的存活时间。
出于本发明的目的，“分离的”是指已从其天然状态移除或以其他方式经受人为操作的材料。分离的材料可以大体上或基本上不含在其天然状态下通常伴随它的组分，或者可以被操作以便与在其天然状态下通常伴随它的组分一起处于人工状态。分离的材料可以是天然的、化学合成的或重组的形式。
如本文所用，“基因”是核酸，其是基因组的结构遗传单元，其可包括一个或多个编码氨基酸的核苷酸序列和一个或多个非编码核苷酸序列，包括启动子和其他5'非翻译序列、内含子、多腺苷酸化序列和其他3'非翻译序列，但不限于此。在大多数细胞生物体中，基因是包含双链DNA的核酸。
如本文所用的术语“核酸”表示单链或双链DNA和RNA。DNA包括基因组DNA和cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸也可以是DNA-RNA杂合体。核酸包含核苷酸序列，其典型地包括包含A、G、C、T或U碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可包括其他碱基，例如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，但不限于此。
还包括“变体”核酸，其包括这样的核酸，所述核酸包含分别编码本文提供的一种或多种标志物的核酸的天然存在的(例如，等位基因)变体和直向同源物(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。优选地，核酸变体与本文公开的核苷酸序列具有至少70％或75％，优选至少80％或85％或更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
还包括核酸片段。“片段”是核酸的区段、结构域、部分或区域，其分别构成核苷酸序列的小于100％。非限制性实例是扩增产物或引物或探针。在具体实施方案中，核酸片段可包含例如所述核酸的至少10、15、20、25、30 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000和7500个连续核苷酸。
如本文所用，“多核苷酸”是具有八十(80)个或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”具有少于八十(80)个连续核苷酸。“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，例如，为了在RNA或DNA印迹中检测互补序列而被适当地标记。“引物”通常是优选具有15-50个连续核苷酸的单链寡核苷酸，其能够与互补核酸“模板”粘接并通过DNA聚合酶(例如Taq聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶或SequenaseTM)的作用以模板依赖性方式延伸。“模板”核酸是进行核酸扩增的核酸。
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。如本领域所熟知的，氨基酸可以是天然或非天然氨基酸、D-氨基酸或L-氨基酸。如本领域技术人员所理解的，术语“蛋白质”在其范围内还包括磷酸化形式的蛋白质(即磷蛋白)和/或糖基化形式的蛋白质(即糖蛋白)。“肽”是具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。“多肽”是具有超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。
还提供了蛋白质“变体”，例如天然存在的变体(例如等位基因变体)和本文提供的一种或多种标志物的直向同源物或同种型，例如表1和表2中列出的那些。优选地，蛋白质变体与本文公开的或本领域已知的一种或多种标志物的氨基酸序列具有至少70％或75％，优选至少80％或85％或更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。为此，表1和表2还包括涉及所述蛋白质标志物的蛋白质序列的实例的登录号，如本领域熟知的并且通过引用并入本文。
还提供了蛋白质片段，包括包含少于100％的完整氨基酸序列的肽片段。在具体实施方案中，蛋白质片段可包含例如所述蛋白质的至少10、15、20、25、30 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150和1200个连续氨基酸。
本领域技术人员可以理解，外泌体是小型的(即，通常30-150nm)胞吞起源的由细胞衍生的膜囊泡。它们可含有脂质、核酸和蛋白质，并在与质膜融合后释放到细胞外环境中。通常，外泌体由标志物蛋白(包括CD63、CD9、HSP70、脂阀结构蛋白1和TSG101)的存在以及它们的形态和大小进行表征。
根据本发明的方法，含有一个或多个外泌体的外泌体样品可包含或获自大多数生物流体，包括但不限于血液、血清、血浆、腹水、囊液、胸膜液、腹膜液、脑脊髓液、泪液、尿液、唾液、痰液、乳头吸出物、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、母乳、器官内系统液体或其组合。为此，可以从生物流体或样品(例如上面提供的那些)中分离或纯化外泌体样品，以便于去除污染性蛋白质、脂蛋白等。
为此，可以通过本领域已知的任何方法分离外泌体或外泌体样品，例如但不限于超速离心、尺寸排阻色谱、外泌体沉淀(例如，来自System Biosciences的ExoQuick)、外泌体的基于亲和力的捕获(例如，用针对CD63、CD81、CD82、CD9、Alix、膜联蛋白、EpCAM和Rab5的抗体进行亲和纯化)及其任何组合。
如本领域技术人员所理解的，与对照或参考样品中的表达水平相比，或与阈值表达水平相比，本文提供的一种或多种蛋白质的基因和/或蛋白质表达水平可以相对(i)更高、增加或更大；或者(ii)更低、降低或减小。在一个实施方案中，如果表达水平超过参考群体的平均和/或中值表达水平，则表达水平可以被分类为更高、增加或更大。在一个实施方案中，如果表达水平小于参考群体的平均和/或中值表达水平，则表达水平可以被分类为更低、降低或减小。在这方面，参考群体可以是与确定表达水平的所述哺乳动物具有相同癌症类型、亚组、阶段和/或等级的受试者组。
如本文所用，诸如“更高”、“增加”和“更大”的术语是指与对照或参照水平或量相比，核酸和/或蛋白质(例如在外泌体样品中)的升高的量或水平。一种或多种标志物的核酸和/或蛋白质的表达水平可以是相对的或绝对的。在一些实施方案中，如果一种或多种标志物的表达水平比对照或参照水平或量的相应或对应蛋白质的基因和/或蛋白质表达水平高出约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％或至少约500％以上，则一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达是更高、增加或更大的。
如本文所用，术语“更低”、“减少”和“减小”是指与对照或参照水平或量相比，核酸和/或蛋白质(例如在外泌体样品中)的更低的量或水平。本文提供的一种或多种标志物的核酸和/或蛋白质的表达水平可以是相对的或绝对的。在一些实施方案中，如果一种或多种标志物的表达水平是对照或参照水平或量的相应或对应蛋白质的基因和/或蛋白质表达水平或量的小于约95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％，或甚至小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％，则一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达是更低、减少或减小的。
术语“对照样品”典型地是指来自未患有癌症的(健康的)非患病个体的生物样品，例如外泌体样品。在一个实施方案中，对照样品可以来自已知无癌症的受试者或在较早时间点从受试者获得的样品。或者，对照样品可以来自处于癌症缓解期的受试者。对照样品可以是合并的样品、平均样品或单个样品。内部对照是来自所测试的相同生物样品(例如，外泌体样品)的标志物。
如本文所用，基因和/或蛋白质表达水平可以是其绝对量或相对量。因此，在一些实施方案中，将本文提供的一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达水平与对照表达水平(例如在受试者的外泌体样品中的一种或多种“管家”基因和/或蛋白质的基因和/或蛋白质表达水平)进行比较。
在其他实施方案中，将一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达水平与阈值表达水平(例如外泌体样品中的基因和/或蛋白质表达水平)进行比较。阈值表达水平通常是本发明的一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达的量化水平。典型地，外泌体样品中一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达水平超过或低于阈值表达水平可预测特定的疾病状态或结果。阈值表达水平的性质和数值(如果有的话)典型地基于被选择用于确定一种或多种基因或其产物的表达的方法而变化，所述一种或多种基因或其产物用于在受试者中确定例如预后和/或对抗癌疗法的响应。
本领域技术人员能够使用本领域已知的任何测量基因或蛋白质表达的方法(例如本文所述的那些)确定外泌体样品中基因和/或蛋白质表达的阈值水平，其可以用于确定例如预后和/或对抗癌疗法的响应。在一个实施方案中，阈值水平是参考群体中一种或多种标志物的平均和/或中位基因和/或蛋白质表达水平(中值或绝对值)，所述参考群体例如与确定表达水平的所述受试者具有相同的癌症类型、亚组、阶段和/或等级。另外，阈值表达水平的概念不应限于单个值或结果。在这方面，阈值表达水平可以涵盖多个阈值表达水平，其可以表示例如受试者癌症的转移的高、中或低概率。
在一个实施方案中，本文提供的一种或多种标志物的较低基因和/或蛋白质表达水平表明癌症对抗癌治疗的相对增加的响应性或与之相关。在替代实施方案中，本文提供的一种或多种标志物的较低基因和/或蛋白质表达水平表明癌症对抗癌治疗的相对降低的响应性或与之相关。
术语“确定”、“测量”、“评估”、“评定”和“测定”在本文中可互换使用，并且可包括本领域已知的任何形式的测量，例如下文描述的那些。
确定、评定、评估、测定或测量本文提供的一种或多种标志物的相应核酸(例如RNA、mRNA和cDNA)可以通过本领域已知的任何技术进行。这些可以是包括核酸序列扩增、核酸杂交、核苷酸测序、质谱和任何这些的组合的技术。
核酸扩增技术典型地包括以下重复循环：在适当条件下将一个或多个引物粘接至“模板”核苷酸序列，并使用聚合酶合成与靶标互补的核苷酸序列的，从而“扩增”靶核苷酸序列。核酸扩增技术是本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)；链置换扩增(SDA)；滚环复制(RCR)；基于核酸序列的扩增(NASBA)、Q-β复制酶扩增；解旋酶依赖性扩增(HAD)；环介导的等温扩增(LAMP)；切口酶扩增反应(NEAR)和重组酶聚合酶扩增(RPA)，但不限于此。如本文通常使用的，“扩增产物”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
PCR包括定量和半定量PCR、实时PCR、等位基因特异性PCR、甲基化特异性PCR、不对称PCR、巢式PCR、多重PCR、渐降式PCR(touch-down PCR)、数字PCR以及对“基础”PCR扩增的其他变化和修改。
可以使用从细胞或组织来源提取、分离或以其他方式获得的DNA或RNA进行核酸扩增技术。在其他实施方案中，核酸扩增可以直接在经过适当处理的细胞或组织样品上进行。
核酸杂交典型地包括在适当条件下将核苷酸序列(典型地以探针形式)与靶核苷酸序列杂交，由此随后检测杂交的探针-靶核苷酸序列。非限制性实例包括RNA印迹、狭线印迹、原位杂交和荧光共振能量转移(FRET)检测，但不限于此。可以使用从细胞或组织来源提取、分离、扩增或以其他方式获得的DNA或RNA或直接在经过适当处理的细胞或组织样品上进行核酸杂交。
还应理解，可以使用核酸扩增和核酸杂交的组合。
确定、评定、评估、测定或测量一种或多种外泌体蛋白的蛋白质水平可以通过本领域已知的任何技术进行，所述技术能够检测无论是在表面上还是在外泌体内部表达的这些蛋白质，或从受试者的外泌体样品中分离、提取或以其他方式获得的蛋白质。这些技术包括使用一种或多种结合蛋白质的抗体的基于抗体的检测、电泳、等电聚焦、蛋白质测序、色谱技术和质谱及它们的组合，但不限于此。基于抗体的检测可包括使用荧光标记的抗体的流式细胞术、ELISA、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)和免疫细胞化学，但不限于此。
应理解，确定本文提供的一种或多种标志物的表达可包括确定其核酸水平(例如通过核酸扩增和/或核酸杂交)及其蛋白质水平两者。因此，检测和/或测量来自受试者的外泌体样品的一种或多种标志物的表达可以通过本文所述的任何那些方法或其组合进行(例如，测量mRNA水平或其扩增的cDNA拷贝和/或通过测量其蛋白质产物)，但不限于此。
鉴于前述内容，还应理解，本文提供的一种或多种标志物的表达水平可以是表达基因或其基因产物(包括例如RNA、mRNA和cDNA的核酸，和/或蛋白质)的绝对或相对量。
适当地，上述方面的方法还包括诊断所述受试者具有以下情形的步骤：(i)高度侵袭性癌症或侵袭性较小的癌症；和/或(ii)不太有利的预后或更有利的预后。
在另一方面，本发明提供了一种预测癌症对受试者中的抗癌治疗的响应性的方法，所述方法包括确定受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的改变或调节的表达水平表明癌症对抗癌治疗的相对增加或降低的响应性或与之相关。
如本领域技术人员所理解的，当与对照或参照样品或表达水平(例如阈值水平)相比，表达水平更高/增加或更低/降低时，基因或蛋白质的表达水平可被认为是“改变的”或“调节的”。在一个实施方案中，如果表达水平大于参考群体的平均和/或中位数相对表达水平，则表达水平可以被分类为高水平，并且如果表达水平小于参考群体的平均和/或中位数表达水平，则表达水平可以被分类为低水平。在这方面，参考群体可以是与确定表达水平的所述哺乳动物具有相同癌症类型、亚组、阶段和/或等级的受试者组。此外，表达水平可以是相对的或绝对的。
适当地，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、中性α-葡糖苷酶AB、60kDa热休克蛋白、赖氨酰氧化酶同源物2、腱生蛋白C、脂肪酸合成酶、集聚蛋白、天冬氨酰氨肽酶、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-5、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-2、蛋白酶体亚基β型-3、蛋白酶体亚基β型-4、蛋白酶体亚基β型-5、蛋白酶体亚基β型-6、蛋白酶体亚基β型-7、蛋白酶体亚基β型-8、血小板反应蛋白-1、潜在转化生长因子β结合蛋白3及其任何组合。在一个具体实施方案中，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、血小板反应蛋白-1及其任何组合。
在一个实施方案中，所述一种或多种标志物的较高表达水平表明癌症对抗癌治疗的相对增加的响应性或与之相关。在替代实施方案中，所述一种或多种标志物的较高表达水平表明癌症对抗癌治疗的相对降低的响应性或与之相关。
关于前述方面的发明，该方法适当地包括治疗受试者的癌症的其他步骤。
本发明的其他方面涉及受试者中癌症的治疗。
在一个特定方面，癌症治疗与以下步骤一起进行：确定受试者的外泌体样品中的一种或多种标志物的表达水平，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并基于所做出的决定，开始、继续、改变或中断癌症治疗。
适当地，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、中性α-葡糖苷酶AB、60kDa热休克蛋白、赖氨酰氧化酶同源物2、腱生蛋白C、脂肪酸合成酶、集聚蛋白、天冬氨酰氨肽酶、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-5、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-2、蛋白酶体亚基β型-3、蛋白酶体亚基β型-4、蛋白酶体亚基β型-5、蛋白酶体亚基β型-6、蛋白酶体亚基β型-7、蛋白酶体亚基β型-8、血小板反应蛋白-1、潜在转化生长因子β结合蛋白3及其任何组合。在一个具体实施方案中，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、血小板反应蛋白-1及其任何组合。
在这方面，应当理解，本文描述的用于预测癌症对抗癌剂的响应性的那些方法可以进一步包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗癌治疗如抗癌剂的步骤。在一个优选的实施方案中，当本文所述的一种或多种标志物的基因和/或蛋白质表达水平表明癌症对抗癌剂的相对增加的响应性或与之相关时，施用抗癌治疗。
适当地，将一种或多种药剂作为药物组合物施用于受试者，所述药物组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在这方面，任何剂型和给药途径(例如其中提供的那些)都可用于向受试者提供本发明的组合物。
癌症治疗可以包括药物治疗(例如小的有机或无机分子)、化疗、抗体、核酸和其他生物分子疗法、放射疗法、手术、营养疗法、放松或中介疗法以及其他天然或整体疗法，但不限于此。通常，药物(例如，小的有机或无机分子)、生物分子(例如抗体、抑制性核酸，例如siRNA)或化疗剂在本文中称为“抗癌治疗剂”或“抗癌剂”。
治疗癌症的方法可以是预防性的、防范性的或治疗性的，并且适合于治疗哺乳动物，特别是人类的癌症如本文所用，“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指在癌症和/或其症状至少开始出现后至少改善癌症症状的治疗干预、作用过程或方案。如本文所用，“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“预防(prevention)”是指在癌症和/或癌症症状发作之前开始的治疗干预、作用过程或方案，以便预防、抑制或延迟癌症或症状的发展或进展。
术语“治疗有效量”描述了足以在用指定药剂治疗的受试者中实现期望效果的该药剂的数量。例如，这可以是减少、缓解和/或预防癌症或癌症相关疾病、病症或病状所必需的化疗剂的量。在一些实施方案中，“治疗有效量”足以减少或消除癌症的症状。在其他实施方案中，“治疗有效量”是足以实现所需生物效应的量，例如有效降低或预防癌症生长和/或转移的量。
理想地，药剂的治疗有效量是足以诱导所需结果而不会在受试者中引起实质细胞毒性作用的量。用于减少、缓解和/或预防癌症的药剂的有效量将取决于所治疗的受试者、任何相关疾病、病症和/或病状的类型和严重性(例如，任何相关的转移的数量和位置)和治疗组合物的给药方式。
适当地，将抗癌治疗剂以包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式施用于哺乳动物。
“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可以安全地用于全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据具体的给药途径，可以使用本领域熟知的各种载体。这些载体可选自包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、脂质体及其他基于脂质的载体、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐(例如无机酸盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸，例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)以及无热原水的组。
描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用的参考文献是Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)，其通过引用并入本文。
可以采用任何安全的给药途径为患者提供本发明的组合物。例如，可以使用口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、透皮途径等。肌肉内和皮下注射是合适的，例如，用于施用免疫治疗组合物、蛋白质疫苗和核酸疫苗。
剂型包括片剂、分散剂、悬浮剂、注射剂、溶液剂、糖浆剂、锭剂、胶囊剂、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型还可包括注射或植入专门为此目的设计的控制释放装置或经修改以另外以这种方式起作用的其他形式的植入物。治疗剂的控制释放可以通过例如用疏水聚合物包衣治疗剂来实现，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。另外，控制释放可以通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现。
适于口服或肠胃外给药的本发明组合物可以作为离散单元(例如胶囊、小袋或片剂，各自含有预定量的一种或多种本发明的治疗剂)，作为粉末或颗粒或作为水性液体、非水液体、水包油乳液或油包水型液体乳液中的溶液或悬浮液提供。此类组合物可通过任何药学方法制备，但所有方法都包括使一种或多种如上所述的药剂与构成一种或多种必需成分的载体结合的步骤。通常，通过将本发明的药剂与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后在必要时将产物成型为期望的形式来制备组合物。
上述组合物可以以与剂量制剂相容的方式和药学上有效的量施用。在本发明的上下文中，施用于受试者的剂量应足以在适当的时间段内在受试者中实现有益的反应。待施用的药剂的数量可取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，这些因素将取决于从业者的判断。
在具体实施方案中，抗癌治疗和/或药剂可以针对抑制一种或多种标志物的作用和/或降低其表达.
在其他实施方案中，抗癌治疗和/或药剂可以针对预防或抑制癌症的转移。
在替代实施方案中，抗癌治疗和/或药剂可以针对除本发明的一种或多种标志物之外的基因或基因产物。举例来说，抗癌治疗可以靶向已知与一种或多种标志物直接或间接相互作用的基因或基因产物。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种关于癌症治疗的“伴随诊断”，其中本发明的一种或多种标志物的表达水平向临床医生等提供信息，所述信息用于所述癌症治疗的安全和/或有效施用。
适当地，癌症是上文所述的类型，但不限于此。
参考前述方面，该方法适当地包括从受试者，例如从上文所述的那些生物样品和/或分离方法获得外泌体样品的初始步骤。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定或产生用于治疗受试者癌症的药剂的方法，其包括以下步骤：
(a)将表达表1和/或表2中列出的标志物的细胞与候选药剂接触；和
(b)确定候选药剂是否调节标志物的表达和/或活性。
在某些实施方案中，候选药剂至少部分地减少、消除、遏制或抑制标志物的表达和/或活性。
适当地，该药剂具有或显示很少或没有显著的脱靶和/或非特异性作用。
优选地，该药剂是抗体或小分子。
适当地，标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、中性α-葡糖苷酶AB、60kDa热休克蛋白、赖氨酰氧化酶同源物2、腱生蛋白C、脂肪酸合成酶、集聚蛋白、天冬氨酰氨肽酶、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-5、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-2、蛋白酶体亚基β型-3、蛋白酶体亚基β型-4、蛋白酶体亚基β型-5、蛋白酶体亚基β型-6、蛋白酶体亚基β型-7、蛋白酶体亚基β型-8、血小板反应蛋白-1、潜在转化生长因子β结合蛋白3及其任何组合。在一个具体实施方案中，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、血小板反应蛋白-1及其任何组合。
在涉及抗体抑制剂的实施方案中，抗体可以是多克隆的或单克隆的、天然的或重组的。适用于抗体生产、纯化和使用的众所周知的方案可以在例如Coligan等人,CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons NY,1991-1994)的第2章和Harlow,E.&Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Cold Spring HarborLaboratory,1988中找到，它们都通过引用并入本文。
通常，本发明的抗体与标志物的分离的蛋白质、片段、变体或衍生物结合或缀合。例如，抗体可以是多克隆抗体。此类抗体可以例如通过将标志物蛋白质产物的分离的蛋白质、片段、变体或衍生物注射到生产物种(其可以包括小鼠或兔子)中，以获得多克隆抗血清来制备。产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的。可以使用的示例性方案描述于例如Coligan等人,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,同上，和Harlow&Lane,1988,同上中。
单克隆抗体可以使用标准方法(例如在&Milstein,1975,Nature 256,495的文章中所描述，该文章通过引用并入本文)或者通过其最近的修改版本(例如在Coligan等人,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,上文中所描述)，通过使来源于生产物种的脾或其他抗体生产细胞永生化来生产，所述生产物种已经接种有一种或多种分离的标志物蛋白质产物和/或其片段、变体和/或衍生物。
典型地，候选抑制剂抗体的抑制活性可以通过体外和/或体内测定来评定，所述体外和/或体内测定检测或测量在抗体存在下标志物蛋白的表达水平和/或活性。
在一些实施方案中，可以合理地设计调节剂如抑制剂。这些方法可包括标志物的结构分析，和与标志物结合、相互作用或以其他方式调节标志物活性的分子的设计和/或构建。这些方法可以尤其包括候选调节剂和标志物之间的相互作用的计算机辅助三维建模。
在其他实施方案中，调节剂例如是小有机分子抑制剂，这可能涉及筛选大型化合物文库，数量达到数十万至数百万种候选抑制剂(化合物，包括合成有机小分子或天然产物，例如抑制性肽或蛋白质)，其可以在数百个分子靶标中的任何一个上筛选或测试其生物活性，以便找到潜在的新药物或先导化合物。筛选方法可包括但不限于基于计算机(“电子(in silico)”)的筛选和基于体外测定的高通量筛选。
典型地，然后通过一系列其他体外和/或体内测试依次测试来自该初始筛选过程的活性化合物或“命中物”，以进一步表征活性化合物。选择在每个阶段的逐渐减少数量的“成功”化合物用于后续测试，最终导致选择一种或多种候选药物以进行人临床试验中的测试。
在临床水平，筛选候选药剂可包括在受试者暴露于测试化合物之前和之后从测试受试者获得样品。然后可以测量和分析标志物蛋白质的样品(例如外泌体样品)中的水平，以确定标志物蛋白质的水平和/或活性在暴露于候选药剂后是否发生变化。举例来说，样品中的蛋白质产物水平可以通过质谱法、蛋白质印迹、ELISA、电化学和/或通过本领域技术人员已知的任何其他适当方式来确定。
在这方面，然后可以将鉴定为能够降低、消除、遏制或抑制标志物的表达水平和/或活性的候选药剂施用于患有癌症的患者。例如，如果生物标志物的活性增加至少部分地造成癌症的发展和/或发作，则施用抑制或降低标志物的活性和/或表达的候选药剂可以治疗癌症和/或降低癌症的风险。
关于前述方面，术语“受试者”包括但不限于哺乳动物，其包括人、表演动物(例如马、骆驼、灰狗)、牲畜(例如牛、羊、马)和伴侣动物(例如猫和狗)。优选地，受试者是人。
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均通过引用并入本文。
对于本发明，本文提供的针对基因或蛋白质的数据库登录号或唯一标识符(例如表1和表2中所示的那些)以及与其相关的基因和/或蛋白质序列通过引用并入本文。
因此，可以充分理解本发明的优选实施方案并将其付诸实践，参考以下非限制性实施例。
实施例
最近的数据表明，肿瘤缺氧是促进转移性传播的因子的分泌的强大动力8,9。被认为参与增强转移的分泌因子的关键组分是外泌体的释放。越来越多的证据表明，由肿瘤衍生的外泌体携带的蛋白质组学和基因组信息的丰富阵列是癌细胞改变周围基质和恶性细胞行为的新机制10。外泌体可以影响参与新血管生成11、免疫抑制中12的信号传导过程并诱导抗药性和致癌转移13-15。此外，外泌体诱导系统性变化的能力被认为可促进转移性传播，其造成患者死亡的绝大部分16。
还报道了外泌体可转移致癌蛋白14。胶质瘤细胞中的外泌体转移最近已被证明通过递送突变表皮生长因子受体(EGFRvIII)同种型来增强肿瘤发生，导致抗凋亡基因表达增加和增殖增强14。类似地，具有突变形式的KRAS的结肠癌细胞能够通过用外泌体将突变KRAS转移到野生型细胞来增强野生型KRAS结肠细胞的三维生长。此外，非转移性黑素瘤细胞可通过摄取衍生自高度转移性黑素瘤细胞系的外泌体而被诱导变得更具转移性17。然而，转移可能性的这种变化是否是永久性的仍然不清楚。
外泌体的蛋白质和RNA含量典型地根据它们来源的细胞类型、组织和微环境而显著变化。因此，癌症分泌的外泌体及其分子内容物代表了癌症中生物标志物和治疗靶标的潜在来源。因此，该实施例的总体目标是建立一种使用外泌体从血液中非侵入性地预测NSCLC患者的疾病发展的手段。
目前，对于开发用于各种实体恶性肿瘤的非侵入性和信息性诊断标志物存在大量未满足的需求。肿瘤衍生的外泌体中包含的蛋白质组学和RNA信息已经引起了关于使用外泌体作为非侵入性诊断工具的明显关注。由于外泌体分离技术现已确立，并且因为外泌体在包括血清、尿液和唾液的体液中是稳定的，所以它们显示出作为疾病发展的可靠生物标志物的巨大潜力23。鉴于外泌体可以提供其起源细胞的分子标记，蛋白质组学和RNA分析也可以提供用于确定致癌突变的有效手段。最近，研究表明基于外泌体的蛋白质(在这种情况下磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1存在)可以预测胰腺癌患者的短期无病生存24。
此外，来源于患者的外泌体被证实可用于理解疾病的发展和治疗选择。已经用从黑素瘤患者中分离的外泌体证明了这一点，所述外泌体表现出高蛋白质含量和升高的TYRP2、VLA 4和HSP70(它们是预后不良的患者所富含的蛋白质)表达16。此外，许多不同的小组已鉴别了在微泡中的逆转录转座子RNA转录物、单链DNA(ssDNA)、线粒体DNA和致癌基因扩增(即，cMyc)以及在外泌体中的双链DNA(dsDNA)25。在外泌体中的致癌基因中，cMet(黑素瘤)16、突变KRAS和胰腺癌中的p5326至今已有报道。因此，鉴于存在这些特异性外泌体生物分子以及已知它们由肿瘤细胞释放，外泌体可能证明是单一或多重诊断生物标志物的临床上有用的富集模板27，由28综述。
材料和方法
细胞系和细胞培养
人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。通过短串联重复(STR)分析证实所有细胞系，并且发现其对支原体是阴性的。将所有细胞保持在含有5％CO2的37℃加湿培养箱中。将SKMES1细胞在补充有10％FBS(Gibco，Thermo FisherScientific)和青霉素-链霉素的DMEM中培养。所有其他细胞在补充有10％FBS和青霉素-链霉素的RPMI中培养。对于缺氧实验，将细胞在含有2％O2和5％CO2的37℃加湿培养箱中培养。
外泌体分离
通过用PBS洗涤细胞两次并用15mL无血清培养基替换来除去血清培养基。将培养基在常氧(21％O2)或缺氧(21％O2)条件下调节24小时。将条件培养基等分到falcon管中，并通过在4℃下以300×g离心10分钟除去漂浮细胞和碎片。将得到的上清液通过0.22μm过滤器过滤以除去剩余的大颗粒。使用Centricon Plus-70离心过滤器(Ultracel-PL膜，100kDa)装置在3,500g在4℃下将澄清的条件培养基浓缩至300-500μL。然后使用OptiPrepTM密度梯度纯化外泌体。将浓缩的培养基覆盖在不连续的碘克沙醇梯度上，并在4℃下以100,000gavg(k因子：277.5)离心16小时。用可调电阻脉冲感测(TRPS)鉴定含有外泌体的级分，在PBS中稀释至20mL，并在4℃下以100,000gavg离心2小时。将得到的沉淀重悬于PBS中用于进一步分析。
电子显微镜
使用透射电子显微镜(TEM)使外泌体可视化。将3μL外泌体悬浮液固定在50-100μL的2％多聚甲醛中。然后将2微升等分试样转移到2个用Formvar-碳涂覆的电子显微镜栅格的每一个上，然后覆盖20分钟。将栅格洗涤并转移至50μL的pH值为7的草酸铀酰溶液中维持5分钟，然后转移至在冰上的50μL的甲基纤维素-UA滴(4％乙酸铀酰和2％甲基纤维素的混合物，比例为100μL/900μL)中维持10分钟。除去栅格并干燥，然后用JEM 1,011透射电子显微镜在80kV下观察。
可调电阻脉冲感测(TRPS)
使用TRPS(qNano，Izon Science Ltd)使用NP100纳米孔在45mm拉伸下分析外泌体浓度和大小。使用以已知浓度的70nm羧化聚苯乙烯珠粒进行的多压校准来标准化外泌体浓度和大小。
蛋白质印迹
以下抗体用于蛋白质印迹：TSG101(Santa Cruz，sc-6037)，CD63(Abcam，ab8219)，脂阀结构蛋白1(BD Transduction Laboratories，610821)，HSP70(TransductionLaboratories，610608)，钙联接蛋白(Cell Signaling Technology，2679S)，VCP(Abcam，ab11433)，GANAB(Abcam，ab179805)。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗购自ThermoScientific。将样品在还原样品缓冲液[0.25M Tris_HCl(pH 6.8)、40％甘油、8％SDS、5％2-巯基乙醇和0.04％溴酚蓝]或非还原样品缓冲液(不含2-巯基乙醇)中裂解并在95℃下煮沸10分钟。通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯膜上，在含5％脱脂奶粉的PBS-T(0.5％吐温-20)中封闭，并用抗体探测。使用X射线胶片和增强化学发光试剂(AmershamECL Select)检测蛋白质。
ELISA
Duoset ELISA购自R&D systems，并根据制造商的说明使用。简而言之，将捕获抗体在PBS中稀释至工作浓度，并在室温下置于96孔微量培养板中过夜。然后除去捕获抗体，并用洗涤缓冲液洗涤板平3次。然后用试剂稀释剂封闭平板2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。然后将标准品和样品在平板中温育2小时，然后如前所述洗涤。然后将平板与检测抗体一起温育2小时，然后如前所述洗涤。然后加入链霉抗生物素蛋白-HRP持续20分钟，随后再次洗涤平板。通过加入底物溶液20分钟显色，然后通过加入终止溶液终止反应。用设置在450nm的酶标仪和540nm的波长校正测定每个孔的光密度。
TNC ELISA试剂盒购自RayBiotech并根据制造商的说明使用。
血浆
将血浆在冰上解冻并在4℃下以1,500g离心10分钟。除去上清液，并用另一个离心步骤以10,000g在4℃下历时20分钟进一步除去大囊泡。然后将500μL覆盖在qEV尺寸排阻柱(Izon)上，接着用PBS洗脱。合并外泌体阳性级分并在Ultra-4 10kDa离心过滤装置中浓缩至最终体积为50-100μL。
质谱
将来自破坏的外泌体的蛋白质进行蛋白水解消化，并在与Waters NanoAcquity超高压液相色谱仪组合的LTQ-OrbitrapElite仪器上进行分析。通过许多特定目的的软件包处理定量基础上不同外泌体内可识别的离散蛋白质的数量。
统计分析
GraphPad Prism版本6.0和MedCalc版本16.8.4用于所有计算。未配对的学生t检验用于计算来自外泌体的蛋白质的表达值的差异。受试者工作特征(Receiver operatorcharacteristic，ROC)曲线用于确定预测值的灵敏度和特异性。使用约登指数(Youdenindex)选择阈值。使用对数秩检验的单变量分析用于评估无病存活(Kaplan-Meier曲线)。
结果
本研究首次证明外泌体是由NSCLC细胞系H358、SKMES1、H23和H1975分泌。图1a显示了使用上述方案分离的外泌体中经典外泌体蛋白的存在和内质网蛋白钙联接蛋白的缺失。此外，分离的外泌体显示出与纯外泌体制剂一致的预期形态和尺寸分布(图1b和2a)。
然后在缺氧条件下培养这些NSCLC细胞系，并监测对外泌体分泌的影响。如在图1c、1d和2a中可以观察到的，缺氧条件诱导了自所研究的四种细胞系中的每一种分泌外泌体，但外泌体大小和形态的范围未改变。
然后，本研究试图确定缺氧是否改变了NSCLC细胞系分泌的外泌体的蛋白质含量或标记。定量质谱法证明了来自H358和SKMES-1细胞系的外泌体在缺氧条件下分别具有83和156种上调蛋白质，其中总共55种上调蛋白质对于两种细胞系是共同的(图2b，表1)。然后，本研究试图验证这种质谱数据。为此，通过质谱鉴定的两种上调蛋白质(即中性α-葡糖苷酶AB(GANAB)和过渡性内质网ATP酶(VCP))通过蛋白质印迹和ELISA(图2c和2d)被证实在来自四种NSCLC细胞系的缺氧外泌体中被上调，从而支持质谱数据。
然后，本研究试图确定在缺氧条件下上调的这些蛋白质是否与NSCLC中的患者疾病发展相关。从图3a中可以看出，从NSCLC患者的血浆中分离的外泌体显示出典型的大小范围和形态。然后通过蛋白质印迹证实，GANAB、VCP、半乳糖凝集素-3结合蛋白、TNC和PMSA2的缺氧外泌体蛋白质标志物在预后较差的NSCLC患者(即，在治疗后的前12个月内发展或复发的那些)中显著上调(图3c)。图3d中的ROC曲线进一步证明，GANAB、VCP和半乳糖凝集素-3-结合蛋白的组合蛋白质标记在鉴定预后不良的NSCLC患者方面具有高的总体准确性。这得到图3e的支持，图3e显示，与在其外泌体中GANAB、VCP和半乳糖凝集素-3结合蛋白这些标志物中仅一种高度表达或无任何一种高度表达的患者相比，这些标志物中的至少两种上调的外泌体表达的NSCLC患者显示出显著更短的无病生存期。
除了GANAB、VCP和半乳糖凝集素-3-结合蛋白的外泌体蛋白质标志物之外，来自NSCLC细胞系中鉴定的原始55种缺氧蛋白质标记的其他蛋白质也可能具有预后价值。例如，图4表明，在治疗后更可能发展的NSCLC患者的外泌体中，腱生蛋白C(TNC)蛋白水平也被上调。另外，图4中的ROC曲线表明，就鉴定预后不良的NSCLC患者而言，其自身表现出相当高的准确性。
图5中提供了关于图3d和3e中所示的GANAB、VCP和半乳糖凝集素-3-结合蛋白(MAC2BP)的患者外泌体蛋白的数据的单个蛋白质ROC和存活曲线。该数据证实，即使靠它们自身，这3种蛋白质中的每一种都是NSCLC患者中疾病发展的准确预后标志物。
结论
这些数据表明，在体外在缺氧外泌体中鉴定的上述蛋白质标志物代表了NSCLC癌症患者中疾病发展或复发的潜在预后生物标志物。因此，此类外泌体生物标志物可代表多种实体恶性肿瘤的可靠和非侵入性预后标志物。
表1-UH358和SKMES-1细胞系共同的上调节蛋白质。
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实施例2
尽管有显著的治疗进展，但肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因1。非小细胞肺癌(NSCLC)患者的整体五年存活率非常差，低至15％2。活组织检查用于诊断和分型NSCLC，并且TNM分期是预测生存和指导临床干预的最重要因素2。然而，尽管通过手术放疗或化放疗进行了治疗意图治疗，但很大比例的早期和局部限制的NSCLC患者患有治疗难治性疾病或发展为转移性疾病，这表明仅TNM分期不足以指导疾病管理。因此，对于鉴定对当前治疗反应差并且允许定制治疗干预的这些患者存在显著未满足的临床需求。预后生物标志物，特别是非侵入性液体生物标志物可以允许临床医生对需要加强治疗或辅助治疗干预的患者进行分类。
称为外泌体的小型细胞外囊泡已被证明可作为鉴定胰腺癌结果的非侵入性方法3。外泌体是分泌的由膜封闭的囊泡，直径尺寸范围为30-150nm4。起源于多泡体的向内出芽，外泌体含有多种来源于其起源细胞的核酸、脂质和蛋白质4。在与质膜融合后，外泌体释放到细胞外环境中并能够进入循环4。正是由于这个原因，与现有临床技术相比，从患者体液中分离外泌体可作为新标志物的潜在来源，所述新标志物可用于更详细地表征NSCLC。
已确定缺氧在肿瘤发展早期发生并引起侵袭性、侵入性和转移性表型5,6。我们假设暴露于缺氧条件的NSCLC细胞将分泌具有不同蛋白质组图谱的外泌体，表明起源细胞的侵袭性表型。为了解决缺氧是否引起外泌体蛋白质含量变化的问题，我们使用公知方法分离了在常氧(21％O2)或缺氧(2％O2)条件下培养的人NSCLC细胞系(H358、SKMES1、H23和H1975)所分泌的外泌体(图6A和B和图10)7,8。当通过可调电阻脉冲感测(TRPS)测量时，外泌体显示出典型的尺寸分布，并且包含经典外泌体标志物HSP70、FLOT1和CD63(图6B；图10A)。有趣的是，透射电子显微镜(TEM)和TRPS纳米颗粒分析显示NSCLC细胞响应缺氧显著增加外泌体分泌(图6A和B；图10B)。使用质谱法评估来自腺癌H358和鳞状细胞癌SKMES1细胞的常氧和缺氧来源的外泌体的蛋白质组。通过光谱计数的无标记定量(label-freequantification)鉴定了在低氧张力下在H358和SKMES1外泌体中都上调的32种蛋白质(16种细胞质型、10种分泌型和6种跨膜型)(图6C；表2和3)。基于先前与癌症发展的关联，选择基于这些蛋白质中的5种(2种细胞质型[VCP9，PSMA210]、2种分泌型[TNC11,12，THBS113]和1种跨膜型蛋白质[MAC2BP14])的外泌体标记。证实所有5种蛋白质在来自额外的缺氧NSCLC细胞系的外泌体中都以更高的丰度被包含(图1D和E)。
然后我们假设缺氧诱导的外泌体变化可以用作早期NSCLC的疾病发展的预后生物标志物。从在诊断时采样的32名患者的初治I-III期NSCLC发现组的血浆中分离外泌体(图7A和B)。尽管缺氧增加了NSCLC细胞的外泌体分泌(图10B)，但我们惊奇地发现，NSCLC患者血浆中的外泌体浓度作为分类变量对于18个月内的临床复发没有预后价值(图7C)。有趣的是，组合的5种蛋白质外泌体标记(VCP、MAC2BP、TNC、PSMA2和THBS1)在来源于复发的NSCLC受试者的外泌体中特异性地增加(图7D)。来自外泌体标记的每种蛋白质分别是疾病复发的极好的预后生物标志物(图11)。有趣的是，基于超过约登阈值(≤2＝无复发；≥3＝复发)的这5种外泌体蛋白的丰度，我们能够在患者的无病生存期(DFS)中产生明确的分离(图7F和G)。重要的是，受试者工作特征(ROC)曲线表明，这5种外泌体蛋白具有在该发现组内以100％特异性和灵敏度预测疾病发展的能力(图7F)。此外，外泌体标记能够区分发现组中的患者总体存活(OS)(图7I)，表明复发和OS都与外泌体标记的丰度相关。
基于外泌体标记的预后价值，我们研究了支持这种外泌体标记的潜在机制。我们最近证明了外泌体的蛋白质含量可以反映起源细胞的表型15，我们对来源于常氧或缺氧条件的外泌体中的总蛋白质丰度进行了基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)。在缺氧条件下分离的来自NSCLC细胞的外泌体中显著富含许多基因集(图12)，包括糖酵解、MYC靶标、E2F靶标和异生物质代谢。有趣的是，缺氧外泌体中富含的排名最高的基因集与EMT相关(图8A；图12A)。鉴于缺氧是癌细胞中EMT的强诱导剂16，我们假设单独的间充质表型足以引起外泌体标记分泌。为了确定5种外泌体蛋白是否由正常或转化的肺上皮细胞分泌，我们从同基因人支气管上皮细胞(HBEC)系中分离出外泌体。引人注目的是，通过p53敲低、Kras v12过表达和LKB1敲低(30KTp53/KRAS/LKB1)17经历致癌诱导的EMT(图8B和C)的HBEC即使在常氧条件下也能分泌升高的外泌体标记蛋白(图8D和E)。为了验证分泌外泌体标记的间充质肺癌细胞的关联，我们然后分析来自发现组的患者肿瘤活组织检查中的E-钙粘蛋白表达。肿瘤活组织检查的免疫组织化学显示，与外泌体标记评分≤2(图8F)的患者相比，具有≥3的高外泌体标记评分的患者的肿瘤中E-钙粘蛋白表达降低的显著关联(R2＝0.458，p<0.001)(图13)。这些数据支持这样的观点，即致瘤转化的肺细胞中的EMT是在NSCLC患者中在我们的体外和体内外泌体标记中发现的升高的蛋白质水平的原因。
将上皮细胞的表型去极化为细长的间充质细胞不仅可以促进癌细胞的侵袭性和转移性表型，还可以促进化疗耐药性17,18。因此，为了进行独立验证，我们评估了20名接受标准护理化放疗的局部晚期NSCLC受试者(确认组)，所述标准护理化放疗由适形放疗(60Gy/30部分，6周)和伴随化疗(顺铂/依托泊苷或卡铂/紫杉醇)组成。在基线、第10天、第24天和第90天用18F-FDG PET/CT监测患者，并且通过标准CT扫描每三个月监测患者一次，持续12个月，之后改为每六个月一次(图9A和B；表5)。使用TRPS在基线测量外泌体浓度。在18个月内复发的受试者在循环外泌体丰度方面没有显著差异(图9C)。与发现组一致，与18个月内未复发的受试者相比，外泌体蛋白质标记在18个月内复发的受试者中显示出显著的升高和预后价值(图9D；图14)。使用在发现组中确定的相同的阈值和算法(≤2个标志物＝在18个月内复发风险低；≥3＝在18个月内复发风险高)，该标记明确区分了在18个月内复发的患者和在18个月后复发的患者(图9D和E)。ROC曲线分析进一步证实了外泌体标记对疾病复发的特异性和灵敏性(图9F)。与发现组进一步一致，外泌体标记可以基于OS区分患者，表明外泌体蛋白质标记是早期复发且总体存活率较差的受试者的理想分类指标。
考虑到EMT与转移和化学抗性的关联16-20，这些数据确定了本研究中两组NSCLC患者中很短的无疾病生存期的机制。这项工作表明缺氧/EMT相关的外泌体生物标志物非常有希望鉴定有早期复发和临床结果差的风险的早期NSCLC患者。缺氧在促进肿瘤生长和转移方面具有多种功能5,6,21，包括诱导发育EMT程序(developmental EMT program)16，从而促进癌细胞的转移和化学抗性16-20,22。重要的是，非侵入性地和可靠地检测NSCLC中的缺氧和/或EMT的能力可以作为早期NSCLC中的潜在的预后筛查工具，从而促进治愈性治疗并降低总体死亡率。我们的结果为新发现的外泌体蛋白质标记作为NSCLC疾病发展的标志物提供了强有力的初步证据。将进行进一步的工作以确定外泌体标记是否是化学放射环境中的预测性生物标志物，或外泌体标记是否是一般的NSCLC环境中的预后生物标志物。尽管TNM分期在患者管理方面提供了显著的益处，并且仍将是NSCLC患者临床管理的关键，但外泌体标记具有补充TNM分期的潜力，并允许具体定制治疗干预以改善临床结果。
材料和方法
细胞培养
人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(腺癌和鳞状细胞癌)H358、SKMES1、H23和H1975购自ATCC。使用短串联重复分析(short tandem repeat profiling)进行细胞系鉴定。将NSCLC维持在补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM或RPMI中，并在37℃下在5％CO2中孵育。同基因正常人支气管上皮细胞(HBEC)由Jill Larsen博士馈赠19,23。将HBEC在37℃和5％CO2下在补充有EGF(5μg/L)和牛垂体提取物(50mg/L)的角化细胞无血清培养基(KSFM)中培养。从在无血清培养基中在常氧(21％O2)或缺氧(2％O2)条件下培养的细胞收集来自NSCLC细胞系的细胞条件培养基(CCM)。通过在100,000gavg过夜离心，从在牛外泌体被消耗的KSFM中在常氧或缺氧条件下调节的HBEC细胞中收集CCM。
抗体和试剂
以下抗体用于蛋白质印迹：钙联接蛋白(Cell Signaling Technology，2679S)、CD9(Abcam，ab92726)、CD63(Abcam，ab8219)、脂阀结构蛋白1(BD TransductionLaboratories，610821)、HSP70(Transduction Laboratories，610608)、TSG101(SantaCruz，sc-6037)、VCP(Abcam，ab11433)。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二抗购自ThermoScientific。MAC2BP、PSMA2和THBS1 ELISA DuoSets购自R&D Systems，TNC ELISA试剂盒购自Abcam。qEV柱购自Izon并储存在4℃的PBS(0.1％叠氮化钠)中。OptiPrepTM购自Sigma-Aldrich。qPCR如先前描述的进行24。
患者
独立确认组包括20名患者，他们提供了知情同意书以在治疗意图化放疗之前，期间和之后参加ERB批准的顺序FDG PET/CT前瞻性试验。如先前报道，该试验的资格包括美国东部肿瘤协作组(ECOG)的表现状态为0-125的I-III期NSCLC的分期18F-FDG PET/CT、组织学或细胞学确认。排除标准包括先前的胸部放疗和完全外科肿瘤切除。患者根据两种标准化方案接受同时进行的化放疗。RT由历经6周的60Gy/30个部分组成。施用以下两种化疗方案中的一种：对于老年患者或具有显著合并症的患者，每周一次施用卡铂[曲线下面积，2，静脉内]和紫杉醇[45mg/m2，静脉内]；或者对于年轻的合适患者，在第1天、第8天、第29天和第36天施用顺铂[50mg/m2，静脉内]，并在第1周和第5周施用依托泊苷[50mg/m2，静脉内]。在基线、第10天、第24天和第90天获得18F-FDG PET/CT扫描。使用标准CT成像进行持续监测，每三个月进行一次，持续12个月，之后每六个月进行一次。
外泌体分离和分析
如前所述分离并分析外泌体7,17,26。对于来自体外细胞培养物的外泌体分离物，将CCM在4℃下以300g离心10分钟，并通过0.22μm过滤器过滤以除去漂浮细胞和大的细胞外囊泡。然后将澄清的CCM浓缩至500μL并覆盖在不连续的碘克沙醇密度梯度上，并在4℃下以100,000gavg离心16小时。将含有外泌体的级分在PBS中稀释至20mL，并在4℃下以100,000gavg离心2小时。将得到的沉淀重悬于PBS中并储存在-80℃直至使用。为了从人血浆中分离外泌体，在室温下解冻3mL血浆，并通过分别以1,500g和10,000g离心10分钟和20分钟除去剩余的血小板和大囊泡来制备。随后将制备的血浆在含有2mM EDTA的PBS中稀释至20mL，并在4℃下以100,000gavg离心2小时。将得到的沉淀重悬于500μL PBS中，并覆盖在尺寸排阻柱上，然后用PBS洗脱。收集含有外泌体的级分并使用Ultra-4 10kDA标称分子量离心过滤单元浓缩至100μL。将浓缩的外泌体储存在-80℃直至使用。如前所述，用蛋白质印迹、可调电阻脉冲感测(TRPS)和透射电子显微镜证实来自细胞培养物和人血浆的外泌体分离物7,17,26。
蛋白质印迹分析
如前所述进行蛋白质印迹7,24。简言之，通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜，在含5％脱脂奶粉的PBS-T(0.5％吐温-20)中封闭，并用抗体探测。用增强化学发光试剂(Amersham ECL Select)检测蛋白质条带。用ImageJ定量蛋白质条带并根据上样对照归一化。为了控制凝胶之间的可变性，在根据作为上样对照的脂阀结构蛋白1归一化之前，根据来自相同凝胶的5μg缺氧衍生的SKMES1外泌体校准患者VCP水平。
免疫组织化学
使用自动染色和优化方法对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品进行IHC分析。为了评估肿瘤细胞内E-钙粘蛋白的表达，对免疫染色的肿瘤细胞的染色强度进行评分：0(负)，1+(弱)，2+(中等)和3+(强)。
质谱
通过在2％SDS、蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich，P8340)和50mM Tris.HCl pH 8.8的存在下加入10mM二硫苏糖醇(4℃1小时，22℃2小时)来减少外泌体制剂。然后通过加入碘乙酰胺达到25mM(22℃1小时)将样品烷基化，并在-20℃下用胰蛋白酶(1:100酶:底物)将样品与甲醇共沉淀过夜。将沉淀重悬于10％乙腈、40mM碳酸氢铵中，并通过在2小时后另外加入胰蛋白酶(1:100酶:底物)在37℃下消化8小时。
通过在Elite Orbitrap ETD质谱仪(Thermo Fisher Scientific)前面连接NanoAcquity UPLC(Waters)进行酸化消化物(三氟乙酸)的LCMS分析。将2微克消化物加载到20mm×180μm Symmetry C18捕集器(Waters)上，并使用以下一系列线性梯度(缓冲液A：0.1％甲酸水溶液；缓冲液B：含0.1％甲酸的乙腈)在200mm×75μm,BEH130 1.7μm柱(Waters)上经120分钟分离：2％B至5％B历经5分钟，30％B历经75分钟，50％B历经10分钟，95％B历经5分钟，并保持6分钟，在2％B中再平衡。通过10μm P200P涂覆的二氧化硅发射器(New Objective)和Nanospray-Flex源(Proxeon Biosystems A/S)将来自柱的洗脱液引入质谱仪中。源电压1.8kV，加热毛细管温度275℃，使用top15方法，在轨道阱中以120 000分辨率AGC 1E6获取的MS，在离子阱AGC 1E4中的MS2，50ms最大注入时间。使用了MS1锁定质量445.120024。
使用MaxQuant(版本1.4.1.2)27进行蛋白质鉴定和无标记定量。MaxQuant用于从Xcalibur原始文件(Thermo Fisher Scientific，德国)中提取峰列表，并且嵌入式数据库搜索引擎Andromeda28用于指定肽与谱匹配(PSM)。搜索的数据库由智人的完整蛋白质组(从www.uniprot.org下载的88,378个规范序列，2013年8月)组成。还搜索了反向序列和MaxQuant污染物数据库。进行无标记定量，仪器类型设置为Orbitrap，第一次搜索的前体质量容差设置为20ppm，主要搜索的前体质量容差设置为4.5ppm，片段离子质量容差设置为0.5Da，酶特异性设置为胰蛋白酶/P，允许最多两次错过裂解(missed cleavage)，将氨基甲酰基甲基半胱氨酸指定为固定修饰，并将蛋白质N-末端的乙酰化、天冬酰胺/谷氨酰胺的脱酰胺和甲硫氨酸的氧化指定为可变修饰。使用默认设置启用第二次肽搜索和运行之间的匹配。为了鉴定，PSM和蛋白质水平FDR设置为0.01。默认设置适用于所有其他参数。如前所述29，通过光谱计数(包括归一化)进行蛋白质推断和无标记定量。
基因集富集分析
基因集富集分析(GSEA)30，版本2.2.3，用于鉴定如前所述15从缺氧SKMES1细胞分离的外泌体中的富集途径。使用Molecular Signatures Database(MSigDB)分析衍生自常氧或缺氧SKMES1外泌体的外泌体中所有蛋白质的非log2转化的蛋白质强度值。使用Hallmark基因集数据库(版本5.2)、Signal2Noise排名度量、1000个基因集置换和加权富集统计进行分析。结果被认为是显著的，错误发现率(FDR)<0.05。
统计分析
GraphPad Prism版本6.0、EdgeR版本2.6.1031、MedCalc版本16.8.4和SPSS统计数据用于所有计算。未配对的学生t检验用于计算来自体外外泌体的蛋白质的表达值的差异。Mann Whitney检验用于源自患者的外泌体中。使用负二项精确检验来评估质谱衍生的光谱计数，其中应用Benjamini-Hochberg调整来控制FDR。受试者工作特征(ROC)曲线用于确定预后值的灵敏度和特异性。使用约登指数选择阈值。使用对数秩检验的单变量分析用于评估无病存活(Kaplan-Meier曲线)。p值小于0.05的差异被认为是显著的(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，除了光谱计数和GSEA数据的FDR阈值分别为0.001和0.05。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，并不将本发明限制于任何一个实施方案或特征的具体集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所例示的具体实施方案进行各种修改和改变。
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均通过引用并入本文。
表2-在NSCLC缺氧外泌体中通常上调的蛋白质在H358和SKMES1缺氧外泌体中上调的蛋白质的列表(FDR<0.01％)。
表3-在NSCLC缺氧外泌体中通常上调的蛋白质的亚细胞定位(FDR<0.01％)。
表4-发现组的患者信息。
表5-确认组的患者信息。
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Claims (22)

1.一种确定受试者中的癌症侵袭性的方法，所述方法包括确定所述受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的表达水平表明所述癌症的侵袭性水平或与所述癌症的侵袭性水平相关。
2.一种确定受试者中的癌症预后的方法，所述方法包括确定所述受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的表达水平表明所述癌症的更不利或更有利的预后或与所述癌症的更不利或更有利的预后相关。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种标志物的相对降低的表达水平表明更有利的预后和/或侵袭性较小的癌症或与更有利的预后和/或侵袭性较小的癌症相关；和/或所述一种或多种标志物的相对增加的表达水平表明更不利的预后和/或高度侵袭性癌症或与更不利的预后和/或高度侵袭性癌症相关。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括诊断所述受试者具有以下情形的进一步步骤：(i)高度侵袭性癌症或侵袭性较小的癌症；和/或(ii)更不利的预后或更有利的预后。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症预后或侵袭性至少部分地用于确定所述受试者中癌症转移的可能性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种标志物的相对降低的表达水平表明所述癌症转移的可能性降低或与之相关；和/或所述一种或多种标志物的相对增加的表达水平表明所述癌症转移的可能性增加或与所述癌症转移的可能性增加相关。
7.一种预测受试者中癌症对抗癌治疗的响应性的方法，所述方法包括确定所述受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平的步骤，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种，并且所述一种或多种标志物的改变或调节的表达水平表明所述癌症对所述抗癌治疗的相对增加或降低的响应性或与所述癌症对所述抗癌治疗的相对增加或降低的响应性相关。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括治疗所述受试者中的所述癌症的进一步步骤。
9.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：确定所述受试者的外泌体样品中一种或多种标志物的表达水平，其中所述标志物包括表1和/或表2中列出的那些蛋白质中的一种或多种并且基于所做的确定，开始、继续、改变或中断抗癌治疗。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗包括向所述受试者施用治疗有效量的降低所述一种或多种标志物的表达和/或活性的抗癌剂。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，所述抗癌治疗包括向所述受试者施用治疗有效量的预防或抑制所述癌症转移的抗癌剂。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述抗癌剂是抗体或小分子。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括从所述受试者获得所述外泌体样品的步骤。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将所述外泌体样品中的所述一种或多种标志物的表达水平与相应的一种或多种标志物的参照外泌体表达水平进行比较的步骤。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是或包括肺癌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肺癌是或包括非小细胞肺癌。
17.一种鉴定或产生用于治疗受试者的癌症的药剂的方法，其包括以下步骤：
(a)使表达表1和/或表2中列出的标志物的细胞与候选药剂接触；和
(b)确定所述候选药剂是否调节所述标志物的表达和/或活性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述候选药剂至少部分地减少、消除、遏制或抑制所述标志物的表达和/或活性。
19.一种通过权利要求17或权利要求18的方法产生的药剂，其用于根据权利要求10至16中任一项的方法。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法或根据权利要求19所述的药剂，其中所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、中性α-葡糖苷酶AB、60kDa热休克蛋白、赖氨酰氧化酶同源物2、腱生蛋白C、脂肪酸合成酶、集聚蛋白、天冬氨酰氨肽酶、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-5、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-2、蛋白酶体亚基β型-3、蛋白酶体亚基β型-4、蛋白酶体亚基β型-5、蛋白酶体亚基β型-6、蛋白酶体亚基β型-7、蛋白酶体亚基β型-8、血小板反应蛋白-1、潜在转化生长因子β结合蛋白3及其任何组合。
21.根据权利要求20所述的方法或药剂，其中所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、血小板反应蛋白-1及其任何组合。
22.根据权利要求20所述的方法或药剂，其中所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-3-结合蛋白、过渡性内质网ATP酶、腱生蛋白C、蛋白酶体亚基α型-2、中性α-葡糖苷酶AB及其任何组合。
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