CN110111029A - 一种鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法,所述方法包括如下步骤:步骤一、将待鉴定的鹿科动物毛发浸泡于无水乙醇中进行清洗;步骤二、清洗后的毛发制作鳞片压模片,测量毛发形态指标鳞片长和鳞片宽,计算鳞片长宽比;步骤三、以物种及鳞片长宽比在SPSS Statistics 17.0软件中建立三种鹿科动物毛发数据库;步骤四、将待鉴定毛发的鳞片长宽比值放入步骤三建好的三种鹿科动物毛发数据库中,通过SPSS Statistics 17.0软件中判别分析功能进行判别,得到该毛发物种的正确分类。本发明具有量化指标、结果客观、操作简单、准确率高、对鉴定人员和设备要求低、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法,具体涉及一种基于毛发鳞片长宽比指标鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法。
背景技术
鹿科动物是大型食肉动物的主要猎物,鹿科等有蹄类动物的丰度也是评估大型猫科动物分布区栖息地质量的重要标准之一。基于毛发形态学对粪便中残余的毛发样本进行鉴别是食肉动物的食性分析最为常用的方法并广泛的应用在食肉动物的食性研究中。尽管基于DNA技术的物种鉴别方法的应用,尤其是近年来二代测序技术的快速发展,DNA技术大量逐步应用到食性分析中。但是,DNA技术对检测的样本要求较高,而野外样本易受到环境污染且消化过程会有一定的影响,所以由粪便毛发提取的DNA质量较差。特别是对于鹿科动物的毛发样本而言,鹿毛较脆,在动物进食和胃肠蠕动过程中毛发通常被破坏,难以获得带毛囊的毛发样本,使得DNA的提取和扩增难度加大。另外,DNA技术对仪器设备、技术要求较高,加之测试成本等诸多原因,因此,基础毛发形态学对食肉动物的食性研究仍然被广泛的应用。
鹿毛与其它动物毛发具有截然不同的形态特征:鹿科动物的被毛通常由粗大的粗毛(coarse hair)组成,绒毛缺乏。毛的外形不呈典型的纺锤形,毛尖到毛根粗细变化不明显,但在毛根处骤然变细。毛干较粗,大多数鹿毛超过200μm以上,颜色浅,髓质极其发达,髓质指数超过90%,皮质层薄,毛脆易断。因此,我们在粪便中发现的通常都是不完整的鹿科动物毛发。基于上述特征,在食肉动物的粪便中很容易区分鹿毛和其它动物的毛发。
然而,鹿科动物是世界性分布物种,在中国也具有广泛的分布,共分布有13种鹿科动物,很多种鹿科动物均同域分布,是大型食肉动物的主要猎物。中国东北林区分布有马鹿、梅花鹿、狍、驼鹿、驯鹿等五种鹿科动物,是该区域大型食肉动物的主要猎物。东北虎和东北豹是全球最濒危的大型猫科动物,东北虎仅存500余只,东北豹数量更少,仅分布于俄罗斯远东和中国东北地区。为了研究该区域东北虎、豹对鹿科动物的可获得性,对其食性分析是最为基础的工作。东北虎、豹的粪便中经常发现鹿科动物的毛发,由于鹿科动物毛发的外形非常相似,髓质花纹均为网格B型,因此通过常规的髓质花纹不能进行科内的分类,也就是说,通过直接通过毛的单一外形结构或鳞片和髓质类型是无法对鹿科动物的毛发进行有效鉴别的。
毛发鳞片是毛发最外层的结构,鳞片的形态从毛尖到毛根随着毛细度的变化具有多态性,比如:黄鼬的针毛从毛尖到毛根具有6种典型的鳞片。鹿科动物粗毛主要由镶嵌型鳞片构成,由于毛干粗细变化不明显,鳞片形态的变化也较少,鳞片形态具有一定的稳定性,这为利用鳞片形态做为鹿科动物分类的依据奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于毛发鳞片长宽比指标鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法。本发明选择东北虎、豹分布区内的3种鹿科动物马鹿、狍及梅花鹿的毛发样本,测定毛细度、髓质细度、鳞片长、鳞片宽,计算髓质指数、鳞片长宽比等6个指标,通过判别分析建立判别模型,并在对含鹿科动物毛发的32份东北虎、豹粪便进行食性分析时应用,得出针对东北虎、豹粪样中鹿科动物毛发判别的最优判别函数和最适毛发形态指标。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法,包括如下步骤:
步骤一、将待鉴定的鹿科动物毛发浸泡于无水乙醇中进行清洗;
步骤二、清洗后的毛发制作鳞片压模片,测量毛发形态指标鳞片长和鳞片宽(同数据库测量标准),计算鳞片长宽比,每根毛发至少测量10个完整的鳞片,后取平均值作为这一根毛发的鳞片长宽比;
步骤三、以物种及鳞片长宽比在SPSS Statistics 17.0软件中建立三种鹿科动物毛发数据库;
步骤四、将待鉴定毛发的鳞片长宽比值放入步骤三建好的三种鹿科动物毛发数据库中,通过SPSS Statistics 17.0软件中判别分析功能进行判别,得到该毛发物种的正确分类。
相比于现有技术,本发明具有如下优点:
1、与传统的单纯的根据毛发外观特征进行判别的方法,本发明具有量化指标、结果客观的优点。根据毛发外观特征判别猎物的方法对研究人员的要求很高,研究人员需要有扎实的毛发形态学知识,且马鹿、狍及梅花鹿的毛发在外观上差异很小,判别过程中主观性较强,而本发明将毛发的指标量化建模,使判别结果更为客观,且具有可重复性。
2、与通过多变量毛发形态指标进行物种鉴定相比,本发明操作简单,准确率高。本发明仅通过鳞片长宽比一项指标,大大减轻了工作量,却能得到多变量毛发形态指标更高的判别率,判别率达到89%以上,能满足动物食性分析中的物种鉴定所需的精度。
3、相比DNA分子鉴定技术,本发明具有操作过程简单、对鉴定人员和设备要求低、成本低的优点。本发明在应用时只需制作鳞片压模片、测量鳞片长宽比,应用SPSSStatistics 17.0软件的判别分析功能即可实现三种鹿科动物的鉴别。
附图说明
图1为数据库选取毛样;
图2为粪便中洗出的毛样;
图3为鳞片长宽比示意图;
图4为三种鹿科动物毛发形态指标分类树;
图5为各模型对三种鹿科动物的判别率。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种基于毛发鳞片长宽比指标鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法,所述方法测量马鹿、狍及梅花鹿三种鹿科动物共125根毛发的6项毛发形态指标建立数据库,利用SPSS Statistics 17.0软件对数据库进行统计分析,基于分析结果,通过判别分析建立判别模型。各模型对数据库进行回判,遴选最优判别模型,得到最简单有效的鳞片长宽比之一指标。并采集东北虎豹粪便中32份具有疑似鹿科动物毛发的粪便样本,通过本发明及DNA分子技术两种方法鉴别该32份粪样中的鹿科动物毛发。以DNA分子技术结果为对照,检验所得最优判别模型及最简单有效的判别指标在实际应用中的成效。具体步骤如下:
1、建立数据库
1.1样本采集
在东北林业大学野生动物资源学院标本室采集马鹿、狍及梅花鹿的典型粗毛(图1)共125根构建数据库,分别为40根、35根及50根。
1.2指标测量
清洗马鹿、狍及梅花鹿的粗毛,后置于有机玻璃片上,上下两片无机玻璃片铁夹固定,烘箱110℃、120min烘干印模,再用解剖针将毛从有机玻璃片上小心挑出,置于载玻片上,中性树胶封片,得到鳞片压模片和髓质花纹片。
鹿科动物毛发有中空、易折的特点,经肠胃消化后动物粪便中鹿科动物毛发常不完整,导致部分形态学指标无法获得。考虑实际应用中以判别食肉动物粪样中的鹿科动物毛发居多,所以只研究断裂毛发可测量的指标。断裂毛发可获得指标共6项,包括毛细度、髓质细度、髓质指数、鳞片长、鳞片宽及鳞片长宽比,利用光学显微镜及TCapture 5.1N软件进行测量:
(1)毛细度:测量毛干处的直径(μm)。
(2)髓质细度:测量(1)处髓质的直径(μm)。
(3)髓质指数:。
(4)鳞片长:沿毛长方向单个鳞片长度(μm)。
(5)鳞片宽: 沿毛细度方向单个鳞片宽度(μm)。
(6)鳞片长宽比:单个鳞片长度与宽度的比值(图3)。
每根毛发至少测量10个完整的鳞片,后取平均值作为这一根毛发的鳞片指标。以物种及6项毛发指标在SPSS Statistics 17.0软件中建立数据库。
2、遴选最优判别函数
采用分类树(Classification Trees)分析三种鹿科动物毛发形态是否存在差异,及各指标在区分三种鹿科动物时的重要性差异。基于分类树及重要性分析结果,进行数据降维和变量筛选。筛选出的指标进行双变量相关性分析,根据分析结果,通过判别分析(Discriminant Analysis)功能组合建模,对数据库本身进行回判,得到各模型对数据库中马鹿、狍及梅花鹿的判别率,对比各模型的判别率,遴选出最优判别函数。
2.1数据降维和变量筛选
以物种为因变量,6项毛发形态指标为自变量,利用SPSS Statistics 17.0软件中的分类功能,使用CRT(Classification Regression Tree,分类回归树)增长方式建立数据库的分类树,并分析各变量的重要性。在CRT计算中,使用Gini系数测量杂质;设定父节点最小个案数为12(总样本的 10%)、子节点最小个案数为6(父节点的1/2);设定最大风险差值(标准误)为0对分类树进行修剪以防止过拟合,得到拥有最小风险的简单树及各变量的重要性。
经修剪得到拥有最小风险的分类树(图4),该分类树的风险估计值为0.040,标准误差0.018,分类正确率96.0%,共7个节点,4个终端节点,树深为3,没有纯节点。图4表明,三种鹿科动物马鹿、狍及梅花鹿的毛发形态存在差异,且使用CRT增长时,仅鳞片长、鳞片长宽比及毛细度三项指标参与分析。自变量在CRT增长方式中的重要性如表1所示。
表1 自变量的重要性
基于分类树和自变量重要性结果,进行数据降维和变量筛选,仅分析鳞片长宽比、鳞片长及毛细度三项指标的相关性,结果显示鳞片长与鳞片长宽比间存在极强相关性(Spearman相关系数=0.959,p<0.001)。
2.2遴选最优判别模型
基于上述结果,利用SPSS Statistics 17.0软件的判别分析功能,三项指标共建立5个典型判别函数模型。通过对数据库自身的判别,得到各模型对数据库的判别率。结果如表1所示。
表2模型的变量组成及模型的回判率
表2表明,模型e对数据库的回判正确率最高,说明模型e的变量鳞片长宽比在三种鹿科动物间存在显著差异,能够有效区分马鹿、狍及梅花鹿。模型e为最优判别模型,其判别函数为:
;
其中,X为鳞片长宽比。函数经Wilks' Lambda检验(Wilks' Lambda=0.206,df=2,p<0.001),显示该函数可有效表达观测数据的组间差异。
3、实际应用检验
3.1野外粪样采集
2010~2016年在黑龙江省和吉林省东北虎豹分布区内,通过冬季野外足迹跟踪、有蹄类动物调查及日常巡护,共收集含鹿科动物信息的粪样共32份,其中东北虎13份,东北豹19份。
3.2模型e进行物种判别
蒸馏水清洗粪便样品,1.5mm筛网过滤,得到剩余残留物。用镊子从清洗后的毛发中挑出10根最粗的毛发(不完整的毛发居多,图2),无水乙醇清洗,经蒸馏水冲洗,后置于有机玻璃片上,上下两片无机玻璃片铁夹固定,烘箱110℃、120min烘干印模,得到鳞片压模片。
将鳞片压模片至于显微镜下,测量毛发形态指标鳞片长和鳞片宽(同数据库测量标准),计算鳞片长宽比。每根毛发至少测量10个完整的鳞片,取平均值作为这一根毛发的鳞片长宽比,考虑到食肉动物粪样中基本只会含有一种鹿科动物,默认同一粪样中的鹿科动物毛发来自同一个体,在此基础上,为简化判别过程,取粪样中10根毛发鳞片长宽比的均值为此粪样中鹿科动物的鳞片长宽比。
将粪样中鹿科动物的鳞片长宽比值放入数据库,通过SPSS Statistics 17.0软件的判别分析功能进行判别分析,得到粪样中猎物的确切信息。
3.3模型e对野外粪样中未知鹿科动物毛发的判别率
以DNA分子鉴定结果为依据,对比毛发鳞片长宽比的鉴定结果与DNA分子技术的鉴定结果,得到各模型对野外粪样中未知鹿科动物毛发的判别率。
将粪便样本浸泡于无水乙醇中,直至毛发与粪便中其他杂质脱离。毛发置于新鲜无水乙醇中用无菌镊子分离,进一步清洗,蒸馏水冲洗、晾干,-20℃下保存。
无水乙醇清洗毛发0.2g,放在灭菌吸水纸上,使其干燥;用灭菌剪刀剪取毛囊部分,严格按照TIAN微量样本试剂盒提取步骤提取毛发DNA,见表3。
后采用20μL反应体系包括引物各0.6μm、Buffer-10μL 、4μL-dNTPs、2.5μL-ddH2O、0.3μL-酶,模板-2μL。PCR程序为94℃/2min 、35个循环(94℃/15s,55℃/40s,68℃/30s)、68℃/20min,得到PCR产物,琼脂糖凝胶电泳,测序。其中引物采用mcb398 和mcb869引物对,L14841 和 H15149引物对(表4)。
表3TIAN微量样本试剂盒提取方法
表4引物对序列
以数据库为模板,利用模型e判别粪样中未知毛发,并对比DNA分子鉴定结果,得到鳞片长宽比对粪样中马鹿、狍及梅花鹿的判别率为0.875。
为检验其它模型是否对粪样中马鹿、狍及梅花鹿的更高判别率的可能性,在检验过程中,上述所建5个模型均对此批野外粪样进行了判别,结果如表5:
表5模型的变量组成及对粪样中马鹿、狍及梅花鹿的判别率
表5表明,依然是模型e对粪样中未知毛发的判别率最高。
综上,说明本发明的方法能够有效的区分马鹿、狍及梅花鹿毛发,且能够在食肉动物的食性分析中应用。
Claims (2)
1.一种鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法,其特征在于所述方法包括如下步骤:
步骤一、将待鉴定的鹿科动物毛发浸泡于无水乙醇中进行清洗;
步骤二、清洗后的毛发制作鳞片压模片,测量毛发形态指标鳞片长和鳞片宽,计算鳞片长宽比;
步骤三、以物种及鳞片长宽比在SPSS Statistics 17.0软件中建立三种鹿科动物毛发数据库;
步骤四、将待鉴定毛发的鳞片长宽比值放入步骤三建好的三种鹿科动物毛发数据库中,通过SPSS Statistics 17.0软件中判别分析功能进行判别,得到该毛发物种的正确分类。
2.根据权利要求1所述的鉴定马鹿、狍及梅花鹿毛发的形态学方法,其特征在于所述步骤二中,每根毛发至少测量10个完整的鳞片,后取平均值作为这一根毛发的鳞片长宽比。
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