CN110066861A - 一种图案化微阵列流动池、制作方法、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种图案化微阵列流动池、制作方法、检测方法及其应用，设计生物技术领域，用可光解链接链保护透明固体基底表面上通过活化形成的一层反应性功能基团，然后用图案化光解链接链分子后形成反应性微阵列，在反应性微阵列上共价固定一层反应性功能高分子形成三维反应性功能高分子微阵列，最后用反应性DNA引物和微阵列上的反应性功能高分子反应形成三维的DNA引物微阵列。采用图案化微阵列的流动池表面更进一步增加单克隆簇比例，进而产生更有效的测序信息，利用三维表面高分子来形成DNA引物三维表面结构可以形成高密度的DNA引物结构，这样的表面可以产生高信噪比的测序信息来进行DNA测序，制作过程会有效，简单，清洁。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种图案化微阵列流动池、制作方法、检测方法及其应用。
背景技术
高通量DNA测序的核心是测序仪的流动池，起先的流动池表面不是图案化制作的，按照泊松分布理论，单克隆簇最多大约30％。而且单克隆簇的位置是无序的，对于数据收集处理难度大。采用图案化流动池可以提高单克隆簇比例到60％以上，这样大大提高了测序通量，单克隆簇的位置也相对固定。
DNA测序已经有近半个世纪的历史，上个世纪70年代初华人生物化学家吴瑞采用DNA聚合酶催化，检测放射性标记寡核苷酸的DNA测序技术。随后Sanger的DNA测序也是用DNA聚合酶催化，检测放射性标记寡核苷酸的方法，非常有名的Sanger双脱氧终止剂DNA测序还是用DNA聚合酶催化，检测放射性标记寡核苷酸的技术。随着1985年PCR技术出现后，在1986年第一代DNA测序仪诞生(Smith等，Nature，321，1986，674-679)。第一代基因测序仪是基于Sanger的双脱氧终止剂DNA测序技术，用荧光标记的双脱氧终止剂来进行DNA测序。
第二代高通量基因测序仪有Roch454(2005推出，已经停产)，Illumina各种测序仪(从2006年的Genome Analyer到2018年的iSeq100共十几种)，ABI的SOLID(2007，基本停产)，Life/ThermoFisher的IonTorrent PGM和Proton I(半导体DNA测序技术，市场比例已经变小，从2016年的大约20％到现在的～7％)。第三代测序仪(Pac Bio和OxfordNanopore)通量低，成本高。目前市场主流测序仪是Illumina的各种测序仪，Illumina的各种测序仪的心脏是它们的流动池。早期的Illumina流动池是在活化玻片表面是铺上一层带反应基团的高分子后再共价固定反应性引物(reactive primers)。然后在流动池内进行就地桥式PCR扩增形成有几千或上万同一种DNA分子的超大量单克隆簇和两种以上DNA分子的多克隆簇。最后在流动池里进行SBS(Sequencing by Synthesis)得到DNA测序信息，但只有单克隆的簇才会产生有用的测序信息。Passion分布局限了只会有30％的簇是单克隆的，其他高于60％的簇产生的测序信息没有实用价值。随后Illumina开发了带有图案化微列阵的流动池，大大提高了流动池表面的单克隆簇比例，进而大大提高了测序仪的通量。
表面生物微阵列(比如DNA，蛋白质，抗体，半抗原，适体，碳水化合物微阵列)广泛用于即时检测(POCT)技术中定性和定量检测生物样品中某种生物分子。DNA微阵列广泛用于基因表达和基因分型，很多种基因测序技术也有用到DNA微阵列，这样可以同时高通量监测基因。Brisset等人，Applied Surface Science329:337-346(2015)。二氧化硅上的生物分子(探针)微列阵是被研究得非常多的固体表面，比如在各种玻璃，石英，熔融二氧化硅，和硅上的生物分子(分析物)微列阵。例如Y.Chen等人,Biosensors and Bioelcetrinics102:418-424(2018)；G.Li等人，Small 11(42):5642-5646(2015)；及Shi等人的第6,790,613号美国专利；Boles等人的第5,932,711号美国专利；Bardhan等人的第6,994,972号美国专利；Frutos等人的第7,781,203号美国专利；Lewis等人的第7,217,512和7,541,146号美国专利。也可以用金属表面做固相基底形成微阵列，比如I.Gallego等人,Adv.Mater.29(11):201603233(2017,10.1002/adma.201603233)。
为了增加单克隆簇比例，进而产生更有效的测序信息，同时增加制作过程的有效性，简单性和清洁性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种制作图案化微阵列流动池的方法，该方法采用可光解链接链实现图案化流动池的表面制作，采用图案化微阵列的流动池表面更进一步增加单克隆簇比例，进而产生更有效的测序信息，利用三维表面高分子来形成DNA引物三维表面结构可以形成高密度的DNA引物结构，这样的表面可以产生高信噪比的测序信息来进行DNA测序，制作过程会有效，简单，清洁。
本发明的第二目的在于提供一种流动池，该流动池可以用于高通量测序，产生高信噪比的测序信息。
本发明的第三目的在于提供一种流动池在基因检测和基因测序中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种核苷酸分子的序列检测方法，该测序方法简单、清洁快捷。
一种制作图案化微阵列流动池的方法，包括如下依次进行的步骤：
(1)在透明的固体基底表面形成反应基团；
(2)在固体基底表面共价固定可光解链接链；可光解链接链可以是不带反应基团，带反应基团和带保护后的反应基团中的任意一种；
(3)通过图案化光解使固体基底表面形成图案化的反应基团微阵列；
(4)在图案化的反应基团微阵列上共价固定反应性功能高分子形成三维图案化反应性功能高分子微阵列；
(5)在三维图案化反应性功能高分子微阵列上再共价固定DNA引物。
在本发明应用较佳的实施例中，步骤(1)中带反应基团的透明固体基底，可以是就地活化后带反应基团或预先带有反应基团的透明固体基底。
步骤(2)中反应基团可以是NH2，NHR，OH，SH和COOH中的任意一种。
步骤(2)中，带反应基团的链接链图案化光解后形成不反应的区域(圆圈外)，没光解的点阵形成反应性微阵列，反应式如下所示：
步骤(2)中，带不反应基团的链接链图案化光解后形成反应的区域(圆圈内)，光解后的点阵形成反应性微阵列，反应式如下所示：
步骤(3)中图案化的反应基团微阵列的阵点可以是圆点，方点，多边形点中的任意一种。微阵列的阵点的尺寸大小介于0.5-999μm。微阵列的阵点的间距为1-10μm。
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
其中R1，R2，R3可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种；X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，R1，R2，R3可以均为H；或R1为2-CH3，R2，R3为H；或R1为4-OH，R2，R3为H。形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
也可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
其中，R可以是硝基和-C(＝O)-烷基中的任意一种，R’和R”均可以是C原子数为0-3的任意一种烷基，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
也可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
其中，R可以是-H，-NO2和-OH中的任意一种，R’和R”均可以是H，CH3,COOH，OH，F，Cl,Br,I，CN，低碳烷基，卤代烷基和芳香基中的任意一种；R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
R可以是-NO2和-OH中的任意一种，R’和R”均可以是-H，-CH3和-NHCOMe中的任意一种，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
Ar为芳香基，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
Ar为芳香基，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
R1和R2均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
R1和R2均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述化合物可以是：
可在固体基底表面形成可光解链接链的化合物包括如下结构：
其中，R可以是H，Ph,Ar,CH3,其他烷基，取代烷基，CN,COOH中的任意一种；R1,R2,R3可以是H,烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，OH，F，Cl,Br,I，CN，卤代烷基，卤代烷氧基，不饱和烷基，NH2，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种。X可以是NH，NHR(R是CH3，CH2CH3，等低碳烷基)，O，S和磷酸酯中的任意一种。
图案化光解后形成图案化的HX-反应性微阵列，比如H2N-，HRN-，HO-等。HX-反应性微阵列和反应性功能高分子反应形成三维反应性功能高分子微阵列。三维反应性功能高分子微阵列上共价固定反应性DNA引物形成三维DNA引物微阵列。这种三维DNA引物微阵列可以用于基因检测和测序。
图案化光解的光波长可以是254-333nm，334-365nm，366-420nm中的任意一种，优选的，光波长为254，300nm，308nm，312nm，315nm，320nm，333nm，337nm，342nm，348nm，350nm，355nm，365nm，366nm，400nm和420nm中的任意一种。
一种利用上述制作方法制得的流动池，包括带有反应基团的固体基底以及与固体基底的反应基团共价固定的表面活性基团，表面活性基团与反应基团通过可光解链接链共价固定，反应基团可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基，表面活性基团可以是：
中的任意一种，其中R1，R2，R3可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种；R可以是-H，-NO2和-OH中的任意一种，R’和R”均可以是H，CH3,COOH，OH，F，Cl,Br,I，CN，低碳烷基，卤代烷基和芳香基中的任意一种；X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基。
表面活性基团也可以是 中的任意一种，其中R可以是-NO2和-OH中的任意一种，Ar为芳香基，R’和R”均可以是-H，-CH3和-NHCOMe中的任意一种，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基。
表面活性基团也可以是
中的任意一种，其中R1和R2均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基。
表面活性基团还可以是中的任意一种，其中R可以是-H，-Ph，-Ar，-CN，烷基，取代烷基和羧基中的任意一种，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基。
一种核苷酸分子的序列检测方法，将待测核苷酸分子上述流动池进行桥式PCR，然后加入测序引物，带荧光标记的dNTP和聚合酶，待合成结束后用水将多余的dNTP和酶进行洗脱，将洗脱后的流动池放到显微镜下进行激光扫描，根据发出的荧光判断其碱基序列。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种制作图案化微阵列流动池的方法，该方法采用可光解链接链实现图案化流动池的表面制作，采用图案化微阵列的流动池表面更进一步增加单克隆簇比例，进而产生更有效的测序信息，利用三维表面高分子来形成DNA引物三维表面结构可以形成高密度的DNA引物结构，这样的表面可以产生高信噪比的测序信息来进行DNA测序，制作过程会有效，简单，清洁。
本发明提供一种流动池，该流动池可以用于高通量测序，产生高信噪比的测序信息。
一种流动池在基因检测和基因测序中得到广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为裂解后形成反应表面(NH2基团)的图案化阵列；
图2为裂解后形成反应表面(NH2基团)的图案化阵列与反应性功能高分子最终形成三维DNA引物微阵列。
图标：10-反应性功能高分子聚合物。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1：
玻片表面活化处理。
取25毫米x75毫米x0.5毫米玻片在0.5wt％SDS水溶液里用超声处理20分钟后用去离子水彻底清洗干净。随后在29％氨水，30％过氧化氢(H2O2)，去离子水,1:1:5(体积比)溶液里超声处理20分钟后用去离子水彻底清洗干净。再在38％HCl和30％过氧化氢(H2O2)与去离子水体积比为1:1:6的溶液里超声处理20分钟后用去离子水彻底清洗干净。处理好的玻片放置于去离子水里盖紧保存，使用时取出用氩气吹干后在110℃烘烤5分钟。这种预先处理过的玻片水接触角小于10度。处理好的基底可以用于形成一层NH2基团，然后再固定一层可光解链接链于基底表面上。
实施例2
用3-氨基丙基三甲氧基硅烷在玻片表面上形成NH2基团。
向带螺旋盖的聚丙烯芯片管内加入30毫升无水乙醇，500微升3-氨基丙基三甲氧基硅烷和20微升三乙胺，放入5片经实施例1预先处理过的玻片，摇动3小时。把玻片取出，用足量95％乙醇清洗，用氩气吹干后放于110℃烘箱里退火处理5分钟。制备好的玻片要立刻用于下一步共价固定一层可光解链接链于基底表面上。
实施例3
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定1-(溴甲基)-2-硝基苯，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.16mg 1-(溴甲基)-2-硝基苯加入2毫升无水乙醇中(FW214.96，0.01mmol，5mM)，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2基团的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例3的共价固定反应过程如下所示：
实施例4
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定1-(溴甲基)-2,6-二硝基苯，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.59mg 1-(溴甲基)-2,6-二硝基苯加入2毫升无水乙醇(FW 259.04，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例4的共价固定反应过程如下所示：
实施例5
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定1-(1-溴乙基)-2-硝基苯，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.30mg 1-(1-溴乙基)-2-硝基苯加入2毫升无水乙醇(FW230.06，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例5的共价固定反应过程如下所示：
实施例6
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定1-(溴甲基)-4，5-二甲氧基-2-硝基苯，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.76mg 1-(溴甲基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯加入2毫升无水乙醇(FW276.09，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例6的共价固定反应过程如下所示：
实施例7
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定1-(1-溴乙基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.90mg 1-(1-溴乙基)-4，5-二甲氧基-2-硝基苯加入2毫升无水乙醇(FW290.11，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例7的共价固定反应过程如下所示：
实施例8
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定5-(溴甲基)-6-硝基苯并[D][1,3]二恶英，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.60mg 5-(溴甲基)-6-硝基苯并[D][1,3]二恶英加入2毫升无水乙醇(FW260.04，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例8的共价固定反应过程如下所示：
实施例9
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定5-(1-溴乙基)-6-硝基苯并[D][1,3]二恶英，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.74mg 5-(1-溴乙基)-6-硝基苯并[D][1,3]二恶英加入2毫升无水乙醇(FW274.07，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例9的共价固定反应过程如下所示：
实施例10
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定2-溴苯乙酮，使玻片表面上不带反应基团。
称取1.99mg 2-溴苯乙酮加入2毫升无水乙醇(FW 199.05，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例10的共价固定反应过程如下所示：
实施例11
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定2-溴代对硝基苯乙酮，使玻片表面上不带反应基团。
称取2.44mg 2-溴代对硝基苯乙酮加入2毫升无水乙醇(FW244.04，0.01mmol，5mM)中，加入2微升DIPEA(二异丙基乙胺，FW129.24，ρ＝0.782，0.012mmol，6mM)后滴加到带NH2的玻片(实施例2)表面上，静置3小时，用乙醇冲洗，用氩气吹干。实施例11的共价固定反应过程如下所示：
实施例12
图案化光解实施例3-11中经共价固定可光解链接链后的玻片，让玻片表面形成图案化NH2基团微阵列。
参照图1所示，只光照圆圈内1分钟，光照后圆圈内产生NH2基团，R＝NH2，只裂解圆圈内的区域来形成圈内反应性阵列，只有圆圈内有氨基NH2。
实施例13
共价固定N，N-二甲基丙烯酰胺-2-乙烯基-4，4’-二甲基阿扎内酯共聚物Poly(DMA-co-VAL)，50％DMA和50％VAL二元聚合物，于NH2微阵列基底表面上形成三维反应性高分子微阵列流动池。参照图2所示，PCL为形成可光解链接链的化合物，光裂解后，在NH基团上共价固定反应性功能高分子10形成三维反应性功能高分子微阵列。
室温下，实施例3-11中得到的NH2微阵列基底玻片做成的流动池中加入0.5毫升Poly(DMA-co-VAL)无水乙腈溶液。轻轻翻滚摇动19小时后取出流动池，用足量的乙腈冲洗后吹干。
Poly(DMA-co-VAL)无水乙腈溶液通过在25毫升乙腈溶液中添加15微升三乙胺，87.0毫克的N，N-二甲基丙烯酰胺-2-乙烯基-4，4’-二甲基阿扎内酯共聚物Poly(DMA-co-VAL)，50％DMA和50％VAL配制而成。
实施例14
制作寡核苷酸引物微阵列。
参照图2所示，加入寡核苷酸引物，使实施例13中的反应性功能高分子反应结合形成三维DNA引物微阵列。
具体操作为：将25uM 5’H2N标记的寡核苷酸引物(一种或两种以上)在50mM磷酸钠环境(pH8.5)中加入至三维反应性高分子微阵列流动池。然后在75％湿度下放4-18小时后用蒸馏水冲洗干净，吹干。
实施例15
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定胺基键，使玻片表面上不带反应基团。随后在365nm波长的光照下图案化光解形成反应性氨基NH2微阵列。R可以是H，OH，CONH2，COOH或CO(NCH3)2。
实施例15的共价固定反应过程如下所示：
实施例16
带NH2的玻片(实施例2)表面上共价固定氨基甲酸酯键，使玻片表面上不带反应基团。随后图案化光解形成反应性氨基NH2微阵列。R1，R2可以是H，OH，CONH2，COOH或CO(NCH3)2。
实施例16的共价固定反应过程如下所示：
实施例17
带NH2的玻片(实施例2)表面上被共价(氨基甲酸酯键)固定了另两种可光解链接链来保护，使玻片表面上不带反应基团。随后图案化光解形成反应性氨基NH2微阵列。R3，R4可以是H，OH，CONH2，COOH或CO(NCH3)2。
实施例17的共价固定反应过程如下所示：
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：
(1)在流动池的基底表面形成反应基团；
(2)使用化合物与所述反应基团形成可光解链接链。
2.根据权利要求1所述的制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括如下步骤：通过图案化光解使所述流动池的基底表面形成图案化的反应基团微阵列。
3.根据权利要求1所述的制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，形成所述可光解链接链的所述化合物具有如下结构：
式1：
式1中R1，R2，R3可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种；X可以是NHR，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R包括C原子数为0-3的烷基；
优选的，所述式1为2-溴苯乙酮；
或式(2)：
式(2)中，R可以是硝基和-C(＝O)-烷基中的任意一种，R’和R”均可以是C原子数为0-3的任意一种烷基，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
优选的，所述式(2)为：5-(溴甲基)-6-硝基苯并[D][1,3]二恶英和5-(1-溴乙基)-6-硝基苯并[D][1,3]二恶英中的任意一种；
或式(3)：
式(3)中，R可以是-H，-NO2和-OH中的任意一种，R’和R”均可以是H，CH3,COOH，OH，F，Cl,Br,I，CN，低碳烷基，卤代烷基和芳香基中的任意一种；R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(4)：
式(4)中，R可以是-NO2和-OH中的任意一种，R’和R”均可以是-H，-CH3和-NHCOMe中的任意一种，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(5)：
式(5)中，Ar为芳香基，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(6)：
式(6)中，Ar为芳香基，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(7)：
式(7)中，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(8)：
式(8)中，R1和R2均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(9)：
式(9)中，R1和R2均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(10)：
式(10)中，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(11)：
式(11)中，R1和R2均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
或式(12)：
式(12)中，R可以是-H，-Ph，-Ar，-CN，烷基，取代烷基和羧基中的任意一种，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
优选的，所述式(12)为：1-(溴甲基)-2-硝基苯，1-(1-溴乙基)-2-硝基苯，1-(溴甲基)-4，5-二甲氧基-2-硝基苯和1-(1-溴乙基)-4-5-二甲氧基-2-硝基苯中的任意一种；
或式(13)：
式(13)中，R可以是-H，-Ph，-Ar，-CN，烷基，取代烷基和羧基中的任意一种，R1，R2和R3均可以是H，烷基，环烷基，取代烷基，烷氧基，环烷氧基，羟基，F，Cl,Br,I，CN,卤代烷氧基，不饱和烷基，氨基，取代氨基，环烷基氨基，环氧烷基氨基，环氮烷基氨基，COO-烷基和芳香基中的任意一种，X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基；
优选的，所述式(13)为1-(溴甲基)-2,6-二硝基苯。
4.根据权利要求3所述的制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，所述式(1)-式(3)，式(5)，式(7)，式(8)和式(10)-式(13)中的X可以是NHR4，O，S和磷酸酯中的任意一种，其中，R4包括C原子数为0-3的烷基。
5.根据权利要求1所述的制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，所述图案化光解的光波长可以是254-333nm，334-365nm，366-420nm中的任意一种，优选的，光波长为254，300nm，308nm，312nm，315nm，320nm，333nm，337nm，342nm，348nm，350nm，355nm，365nm，366nm，400nm和420nm中的任意一种。
6.根据权利要求2所述的制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，还包括在所述图案化的反应基团微阵列上共价固定反应性功能高分子形成三维图案化反应性功能高分子微阵列。
7.根据权利要求6所述的制作图案化微阵列流动池的方法，其特征在于，还包括在所述三维图案化反应性功能高分子微阵列上再共价固定DNA引物。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制作图案化微阵列流动池的方法所制得的流动池。
9.权利要求8所述的流动池在基因检测或基因测序中的应用。
10.一种核苷酸分子的序列检测方法，其特征在于，将待测核苷酸分子与权利要求8所述的流动池进行桥式PCR，然后加入测序引物，带荧光标记的dNTP和聚合酶，待合成结束后用水将多余的dNTP和酶进行洗脱，将洗脱后的流动池放到显微镜下进行激光扫描，根据发出的荧光判断其碱基序列。
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|---|---|---|---|---|
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| US20040175741A1 (en) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Nigu Chemie Gmbh | Novel photolabile protective groups for improved processes to prepare oligonucleotide arrays |
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