CN109916887B

CN109916887B - 一种伯氨喹类药物的比色检测方法

Info

Publication number: CN109916887B
Application number: CN201910212683.XA
Authority: CN
Inventors: 刘芳; 邓涛; 伍盛鋆; 吴亚兰
Original assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2039-03-20
Also published as: CN109916887A

Abstract

本发明涉及一种伯氨喹类药物的比色检测方法，在酸性环境以及亚硝酸盐存在的条件下，对位含有取代基的苯胺可以与伯氨喹发生Griess反应，形成有色偶氮产物；确定上述有色产物的UV‑Vis吸收光谱以及最大吸光值；通过酶标仪检测不同浓度伯氨喹存在下，上述有色偶氮产物的形成及其吸光值的变化；建立伯氨喹浓度与偶氮产物吸光值的标准曲线；通过标准曲线上伯氨喹的浓度与偶氮产物吸收光值的对应关系，确定待测样品中伯氨喹类药物的浓度。该方法已成功用于定量分析合成尿液中伯氨喹的浓度，检出限低至0.63μM。该方法还能在临床相关的浓度范围内从血清样品中检测伯氨喹。

Description

一种伯氨喹类药物的比色检测方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种伯氨喹类药物的比色检测方法。

背景技术

伯氨喹(PMQ)属8-氨基喹啉类结构，是唯一获得许可用于防治间日疟原虫和卵形疟原虫的抗疟疾药物，也是唯一能够在配子体期有效杀灭疟原虫的强效药物。但是，PMQ的副作用在于常导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者的急性溶血性贫血，溶血的严重程度取决于G6PD缺乏程度、PMQ用药剂量和持续时间。G6PD基因突变的频率在疟疾流行地区为3-30％，分布较广，因此限制了PMQ的广泛使用。虽然世界卫生组织建议使用单一低剂量(0.25 mg/kg)来阻止疟疾传播，同时降低溶血风险，但由于地区、性别和年龄的差异，疟疾的治疗仍然面临G6PD患者对药物敏感性多变的问题。

人们迫切需要检测生物体液(包括尿液和血液)中的PMQ，对其药代动力学进行评估，进而调整用药剂量。迄今为止，临床检测PMQ的主要方法都是基于高效液相色谱(HPLC)。尽管HPLC的方法在药物测定中具有较高的灵敏度，但它们也具有不可避免的缺点。例如，HPLC通常不能直接测量生物体液中的药物浓度。通过HPLC确定尿液和血清中的药物浓度，需要通过额外的液相或固相萃取法来去除蛋白质、脂质和其他内源性分子。PMQ在260nm波长下具有最大吸收，HPLC方法中PMQ的UV检测通常也在该波长下进行。然而，许多内源性生物分子如氨基酸、维生素、核酸和尿色素等在260nm附近具有强吸收，会干扰PMQ的测定。因此，低成本且易操作、具有高灵敏度和选择性的PMQ 检测方法仍然是迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种伯氨喹类药物的比色检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：发明人研究发现带有取代基的苯胺在酸性条件下形成重氮盐，随后与伯氨喹偶联形成偶氮产物。通过伯氨喹的Griess反应，开发了一种伯氨喹比色检测法，该方法对伯氨喹测定表现出优异的灵敏度和选择性。其具体方案如下：

一种伯氨喹类药物的比色检测方法，包含以下的反应式(I)：

其中1为伯氨喹，2为具有取代基的苯胺，3为有色偶氮产物。

优选地，所述苯胺为二甲氧基联苯胺。

优选地，所述苯胺为3，3’-二甲氧基联苯胺。

优选地，所述苯胺取代基为磺酰基、甲基、甲氧基、硝基、羧基、三氟甲氧基、二甲氧基、三甲氧基。

优选地，所述苯胺取代基为4-磺酰基、4-甲基、4-甲氧基、4-硝基、4-羧基、 4-三氟甲氧基、2，4-二甲氧基、3，4-二甲氧基、3，4，5-三甲氧基。

优选地，所述有色偶氮产物为磺酰胺偶氮产物，其最强吸收值在470nm；所述有色偶氮产物为硝基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在481nm；所述有色偶氮产物为甲基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在492nm；所述有色偶氮产物为对甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在504nm；所述有色偶氮产物为羧酸苯胺偶氮产物，其最强吸收值在477nm；所述有色偶氮产物为三氟甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在475nm；所述有色偶氮产物为2，4-二甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为518nm；所述有色偶氮产物为3，4-二甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为512nm；所述有色偶氮产物为3，4，5-三甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为495nm；所述有色偶氮产物为3，3’-二甲氧基联苯胺与伯氨喹摩尔比1:1反应产物，其最强吸收值在516nm；所述有色偶氮产物为3，3’-二甲氧基连苯胺与伯氨喹摩尔比1:2反应产物，其最强吸收值在584nm。

优选地，所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，包括以下步骤：

(1)将含有取代基的苯胺与伯氨喹在酸性条件下溶解，再加入亚硝酸钠，形成有色偶氮产物；

(2)确定上述有色产物UV-Vis吸收光谱以及最大吸光值；

(3)通过酶标仪获取苯胺与不同浓度的伯氨喹反应形成的有色偶氮产物的最大吸光值；

(4)建立伯氨喹不同浓度与有色偶氮产物吸光值的标准曲线；

(5)通过标准曲线上伯氨喹的浓度与吸收光值的对应关系，确定待测样品中伯氨喹类药物的浓度。

优选地，所述步骤(1)的反应时间12-15min。

优选地，所述步骤(1)在酸性条件下进行，采用5％的磷酸溶液或者0.2M 稀盐酸溶液。

本发明还提供一种伯氨喹类药物的比色检测试剂，包含反应液R1和反应液 R2，所述反应液1为稀盐酸溶解的4-甲氧基苯胺溶液；所述反应液2为亚硝酸钠水溶液。

本发明的有益效果在于：系统的研究了各种取代苯胺与抗疟药伯氨喹发生的Griess反应。具有给电子取代基的苯胺会导致偶氮产物的吸收波长发生红移，使产物呈现更深的颜色。基于4-甲氧基苯胺、伯氨喹和亚硝酸盐之间的Griess 反应，开发了用于伯氨喹测定的比色法。该方法已成功用于定量分析合成尿液中伯氨喹的浓度，检出限低至0.63μM。该方法还能在临床相关的浓度范围内从血清样品中检测伯氨喹。

附图说明

图1为伯氨喹和苯胺通过Griess反应形成有色偶氮产物的示意图；

图2为伯氨喹和具有不同取代基的苯胺形成的不同颜色的偶氮产物(A图显示5％磷酸溶液中50μM伯胺的有色偶氮产物；B为标准化后的偶氮产物的 UV-Vis光谱，[0-1]标准化。)；

图3为4-SO₂NH₂、4-Me、4-OMe分别与伯氨喹形成的偶氮产物的最大吸收峰值随时间的变化(A图中反应1，2，3分别使用含带取代基的苯胺进行，R ＝4-SO₂NH₂，4-Me，4-OMe，4为伯氨喹对照；B为反应过程中，最大吸收波长下的吸光值随时间的变化情况)；

图4为4-甲氧基苯胺与伯氨喹之间的Griess反应用于纯水中伯氨喹检测的标准曲线；

图5为4-甲氧基苯胺的Griess反应选择性的响应伯氨喹而不响应其它常见抗疟药示意图；

图6为对伯氨喹进行显色检测的操作过程示意图；

图7为4-甲氧基苯胺的Griess反应用于尿液中伯氨喹检测的标准曲线；

图8为4-甲氧基苯胺的Griess反应直接用于血清中伯氨喹检测的标准曲线；

图9为4-甲氧基苯胺的Griess反应测定血清中的伯氨喹浓度(A为从血清样品中提取伯氨喹用于定量分析的示意图；B为纯水中吸光值I₅₀₄和伯氨喹浓度之间的线性关系(0到100μM的范围内)；C为血清中的伯氨喹通过Griess反应方法的实测值与实际加入血清中的精确量进行比较)。

具体实施方式

本发明人经实验室研究发现：抗疟药伯氨喹可以发生类似Griess反应，反应包括三个步骤：亚硝化、重氮离子形成和偶联。重氮离子由含取代基的苯胺的亚硝化反应形成，在酸性条件下进行内部重排，然后与偶联剂伯氨喹反应形成可供比色分析的有色偶氮产物。

实施例1伯氨喹的Griess反应

将苯胺和1倍当量的伯氨喹(PMQ)溶解在5％磷酸中，然后在室温(25℃) 下缓慢加入亚硝酸钠。通过肉眼观察或者TLC跟踪有色偶氮产物的形成可以方便的监测反应(如图1)。

利用在苯环对位具有各种取代基的苯胺进行反应。改变取代基团可以形成不同颜色的产物。如图2所示，具有给电子效应的取代基本上都可引起UV-Vis 吸收光谱的红移。强供电性的甲氧基取代的对甲氧基苯胺反应产物3d的光谱在 504nm处具有最强的吸收，而强吸电子磺酰胺的产物3a的光谱在470nm处具有最强的吸收。甲基的供电性低于甲氧基，但仍然比磺酰胺、硝基和羧基强很多，较之3d，3c的吸收光谱表现出明显的蓝移，最大峰在492nm处。相反，与3a、3b和3j的光谱(分别为磺酰胺、硝基和羧酸取代的470，481和477nm) 相比却是明显的红移。两个伯氨喹分子与3,3'-二甲氧基联苯胺偶联形成3g，呈现蓝色，在水中的最大吸收峰为582nm，在5％磷酸中吸收为584nm。

通过时间依赖密度泛函理论(TD-DFT)进行高斯计算，研究偶氮产物的光物理性质。溶剂效应则以水为溶剂采用极化连续模型(PCM)形式计算。如表1 所示，计算结果与偶氮产物的水溶液测量结果高度接近(平均误差为3.1％)。吸收最大值也随取代基的吸电/供电能力不同而产生变化。这主要是由取代基对偶氮化合物基态的诱导电荷转移效应所致。如表1所示，激发能Eexc表示HOMO 和LUMO之间电子跃迁所需的能量，也可用于解释吸收峰的位移现象。例如，偶氮磺酰胺(3a)和甲氧基(3d)的激发能分别为2.62ev和2.49ev，振动强度分别为1.13和0.73。激发能量的减少与吸收峰的红移相对应。

表1：PMQ偶氮产物的光物理性质

注：除非特殊说明，一般反应条件为：1(0.1mmol)，2(0.1mmol)，NO₂-(0.1mmol)在5％H₃PO4 中室温下反应1h，a表示反应12h，b反应2h。exper.代表实验数据；calc.代表理论计算数据；括号外的数字代表在中性pH条件下H₂O中测量，括号中的数字是指在5％H₃PO4溶液中的测量值(pH≈1.1)。 Eexc是激发能量(ev)，f是振动强度。

实施例2测试有色产物吸光度与时间的变化

PMQ可以与各种苯胺反应生成有色产物，进而用这种显色反应对PMQ进行比色测定。用带不同电性的取代基(R)的苯胺(磺酰基2a，甲基2c和甲氧基2d)进行测试。为了测试吸光度与随时间的变化，首先将100μL苯胺溶液(200 mM溶于0.2M HCl中)与50μL PMQ(50μM)混合，然后加入50μL亚硝酸钠水溶液(5mM)。通过多功能酶标仪记录每种苯胺在最大波长下的吸光度的动态变化。

如图3所示，2a中的反应相比其他两种苯胺更快。2c的反应速率高于2d 但低于2a，主要是因为甲基的给电子效应介于两者之间。如前所述，在UV-Vis 吸收峰的位移上也观察到相同的趋势。更重要的是，PMQ本身在与亚硝酸盐混合后不会产生任何有色产物。来自反应1的黄色产物在反应体系中溶解性差，其在加入亚硝酸盐后几分钟内会即会形成沉淀(如观察到校准曲线意外跳跃所示)。为了获得可靠的定量数据，必须尽快测量吸收，从而加大PMQ测定的难度。尽管反应3比反应2慢，但反应3的12-15分钟测试时间仍然是可接受的。此外，红色偶氮产物3d与反应2的黄色-粉红色产物3c相比，更利于肉眼比色观察。因此，综合考虑反应速率、产物的颜色和溶解度后，最终选择反应3 4- 甲氧基苯胺作为优选方案。

建立Griess反应4-甲氧基苯胺与伯氨喹之间的用于纯水中伯氨喹检测的标准曲线，如图4所示，吸光度最大值I₅₀₄的增加与PMQ浓度呈现较强依赖性，这表明PMQ比色检测具有一定潜力。当PMQ在水中的范围为0至200μM时呈现出极好的线性关系(R²＝0.999)。

实施例3Griess反应对PMQ的选择性

选用抗疟药物4-氨基喹啉甲氟喹(MQ)、氯喹(CQ)、哌喹(PIP)以及双氢青蒿素(DHA)分别单独参与Griess反应，或者将其他抗疟药与PMQ分别混合后参与反应。结果如图5所示，吸光值I₅₀₄并未对MQ、CQ、PIP和DHA有任何响应(均为50μM)，但对含有PMQ(50μM)的药物混合物有响应。结果表明，基于Griess反应的方法对PMQ具有很高的选择性，可以区分常用于疟疾联合用药的其他抗疟药。

实施例4使用本发明测定尿液中的伯氨喹浓度

采用本发明的检测方法测定尿液中的伯氨喹浓度，包括以下步骤(如图6 所示)：

(1)将4-甲氧基苯胺溶解在0.2M稀盐酸中配成200mmol/L反应液R1,5 mmol/L亚硝酸钠水溶液为反应液R2；

(2)配置一系列浓度的磷酸伯氨喹人工尿液(0,1,2,5,10,20,50,100,200 μM)，用以绘制标准曲线；

(3)往96-孔板中加入100μL反应液R1；

(4)加入50μL上述已知浓度的伯氨喹人工尿液或未知伯氨喹浓度的尿液样品与之混合；

(5)加入50μL反应液R2并混匀，室温放置15min；

(6)利用多功能酶标仪读取上述各浓度在504nm处的吸光值I₅₀₄，通过已知浓度的伯氨喹人工尿液绘制标准曲线；将尿液样品获得的吸光值与标准曲线中吸光值与伯氨喹浓度的对应关系进行比对，即可获得尿液样品中伯氨喹的浓度。

实施例中伯氨喹浓度为0的组设为空白对照，计算时空白对照的背景吸收将从所测数值中减去。每个测试设三个重复孔，对所得数值取平均值并计算标准差。以I₅₀₄对伯氨喹的浓度绘制曲线并做线性拟合，即可得到在人工尿液中进行伯氨喹检测的标准曲线，如图7所示，在0-200μM的浓度范围内也呈现极好的线性关系(R＝0.999)。检测限(LOD)为0.63μM，非常接近蒸馏水中PMQ 的LOD(0.62μM)。对样品进行检测时，只需按照标准操作，将样品与检测试剂混合。根据所得吸光值I₅₀₄以及标准曲线即可计算得到所测样品中伯氨喹的浓度。

实施例6使用本发明测定检测血清中的伯氨喹浓度

由于血清中蛋白等成分可能会与重氮盐中间体反应以影响偶氮产物的形成，从而对检测造成一定影响，会降低检测反应对血清中PMQ的敏感性，如图8所示，线性关系的检测浓度范围为10至200μM，可能超出了某些临床病例中血清PMQ浓度，因此，在进行血清检测时，需要对血清样品进行处理。

本实施例中测定血清中的伯氨喹浓度，包括以下步骤：

(1)将4-甲氧基苯胺溶解在0.2M稀盐酸中配成200mmol/L反应液R1,5 mmol/L亚硝酸钠水溶液为反应液R2。

(2)将精确量的PMQ加入血清中以形成一系列PMQ(0.2μM至2μM) 血清溶液，再将6mL乙酸乙酯/正己烷(体积比7:1)混合物加入到2mL含PMQ 的血清中，然后加入100μL NaOH(2M)，进行萃取；浓缩有机相，将粗提物重新溶解在200μL水中，然后通过具有220nm孔径的圆形滤膜过滤除去不溶性脂质组分(如图9A)，获得用于检测分析的PMQ溶液，用于绘制标准曲线。未知浓度的血清样品采用相同处理方法。

(3)往96-孔板中加入100μL反应液R1；

(4)加入50μL上述已知浓度的伯氨喹人工血清或未知伯氨喹浓度的血清样品与之混合；

(5)加入50μL反应液R2并混匀，室温放置15min；

(6)利用多功能酶标仪读取上述各浓度在504nm处的吸光值I₅₀₄，并绘制标准曲线。当检测未知样品时，将未知血清样品获得的吸光值与标准曲线中吸光值与伯氨喹浓度的对应关系进行比对，即可获得血清样品中伯氨喹的浓度。

结果如图9B所示，I₅₀₄的增加与PMQ浓度响应良好。根据已有的线性关系 (R＝0.999)，对于含有0、0.2、0.5、1.0、2.0μM PMQ的血清进行定量的结果分别为0.02、0.14、0.44、0.90和1.78μM，浓度范围覆盖了在PMQ给药时疟疾患者血清中可观察到的浓度范围。在此基础上，发现当PMQ在血清中超过0.5 μM时，通过计算得到血清中伯氨喹的液相提取效率为约90％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，包含以下的反应式(I)：

其中1为伯氨喹，2为具有取代基的苯胺，3为有色偶氮产物；

所述苯胺为4-甲氧基苯胺。

2.如权利要求1所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述有色偶氮产物为对甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在504nm。

3.如权利要求1所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)确定上述有色产物UV-Vis吸收光谱及最大吸光值；

(4)建立伯氨喹不同浓度与有色偶氮产物吸光值的标准曲线；

(5)通过标准曲线上有伯氨喹的浓度与吸收光值的对应关系，确定待测样品中伯氨喹类药物的浓度。

4.如权利要求3所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述步骤(1)的反应时间12-15min。

5.如权利要求3所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述步骤(1)在酸性条件下进行，采用5％的磷酸溶液或者0.2M稀盐酸溶液。

6.一种伯氨喹类药物的比色检测试剂，其特征在于，包含反应液R1和反应液R2，所述反应液R1为稀盐酸溶解的4-甲氧基苯胺溶液；所述反应液R2为亚硝酸钠水溶液。