CN109908087A - 一种可上调和靶向lrp1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及应用 - Google Patents
一种可上调和靶向lrp1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及应用。以生物可降解的高分子材料作为基础载体，内部装载可上调低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的功能小分子，表面修饰LRP1靶向配体，该纳米给药系统可在表面配体作用下靶向递送内部装载的LRP1上调分子，特异性上调脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面的LRP1水平，从而促进LRP1靶向配体修饰纳米给药系统在脑转移瘤的蓄积，由此，纳米给药系统形成一种自促进的药物传递系统。该纳米给药系统装载抗肿瘤药物，可实现治疗浓度的药物递送。其制备方法简单，具有较高的操作性和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种可上调和靶向LRP1 的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及其应用。
背景技术
脑转移瘤是一种身体其它部位的恶性肿瘤转移到颅内的病症，约 24-45％癌症病人发生脑转移瘤，目前已经成为肿瘤科常见的临床问题。随着诊断技术的进步和周围组织肿瘤病人生存期的延长，脑转移瘤发病率持续升高。目前，脑转移瘤治疗以手术为主，并结合放疗和化疗；然而，这些手段存在的一系列弊端包括手术困难、难以有效彻底切除、全脑放疗副作用大，使得脑转移瘤致死率居高不下，乳腺癌脑转移瘤患者的一年生存期仅为20％；亟需更加有效的脑转移瘤治疗方式。化疗是治疗周围组织肿瘤的有效手段，但血脑屏障的存在，使得该方法在治疗脑转移瘤时效果较差；因此，需要可有效克服血脑屏障的脑转移瘤药物治疗方式。大多数的脑转移瘤，尤其是来源于黑色素瘤和乳腺癌的脑转移瘤，表现出附着适应脑微血管的生长模式，沿着脑微血管基底膜持续性增长，血脑屏障保持完整。一般当脑转移瘤长至3mm时，脑转移瘤的生长模式转换为新生血管依赖性生长，此阶段将会出现新生血管和血脑屏障的受损和通透性增加。血脑屏障通透性的增高会使得药物的转运效率在一定程度上升高，但有研究表明，血脑屏障的损伤程度不足以使脑肿瘤区域的药物浓度达到有效治疗浓度。因此，高效克服血脑屏障在脑转移瘤靶向的药物传递系统的设计上非常重要。
目前，基于纳米粒的药物传递策略常被用于改善药物的血脑屏障透过率。这一策略主要是通过在纳米粒表面上修饰具有靶向脑微血管内皮细胞功能的配体，使纳米粒可以通过脑微血管内皮细胞上受体介导的跨细胞转运途径进入脑内。比如，用聚山梨醇酯80修饰纳米粒使其可以模仿低密度脂蛋白颗粒从而借助低密度脂蛋白受体介导的跨细胞转运途径克服血脑屏障。目前较常使用的脑微血管内皮细胞上的靶点为低密度脂蛋白受体、转铁蛋白受体等。其中，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)是在脑微血管内皮细胞上表达量较丰富的受体，Angiopep-2是其常用的配体。研究表明，LRP1介导的跨细胞转运效率远高于转铁蛋白。同时，LRP1在脑转移瘤细胞上也有丰富的分布。ANG1005，一种Angiopep-2修饰的紫杉醇，已进入二期临床阶段。由此可见，Angiopep-2是一种前景良好的多肽靶头。然而，近期有报道指出，即使是像Angiopep-2这样高效的靶头，其介导药物到达脑内的量仅为注射剂量的0.2-0.3％。这主要是由于脑微血管内皮细胞转运效率显著低于周围组织血管内皮细胞。
因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。
发明内容
本发明目的是针对现有以受体介导跨细胞转运克服血脑屏障和肿瘤主动靶向策略为基础的纳米给药系统存在的不足，即脑微血管内皮细胞上较低的受体介导跨细胞转运效率和受体介导肿瘤主动靶向其特异性仍显不足，提供了一种可上调和靶向LRP1的有效克服血脑屏障的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及应用。
本发明的技术方案是：
一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)将生物可降解的高分子基础载体溶于有机溶剂中，同时加入可上调 LRP1的功能小分子，形成油相；
(2)将抗肿瘤药物溶于水中，形成内水相；
(3)将所述内水相在涡旋条件下加入所述油相中，超声乳化形成油包水乳剂；
(4)将所述油包水乳剂在涡旋的条件下滴加入外水相中，超声乳化形成水包油包水型的复乳；
(5)将所述复乳倒入挥发水相中，搅拌挥发除去有机溶剂，以固化形成纳米粒混悬液；
(6)所述纳米粒混悬液通过低速离心除去较大的纳米粒和未包封的可上调LRP1的功能小分子，获得上清液；
(7)将所述上清液通过超速离心以获得未修饰的第一纳米粒；
(8)将所述第一纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，表面修饰功能连接分子，室温反应1小时，通过超速离心获得功能连接分子修饰的第二纳米粒；
(9)将所述第二纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，通过功能连接分子修饰LRP1靶向配体，室温反应1小时，通过超速离心获得LRP1靶向配体修饰的第三纳米粒；
(10)将所述第三纳米粒重悬于水中，通过超速离心获得最终的纳米粒；
(11)将所述最终的纳米粒重悬于水中，加入冻干保护剂中，进行冻干，获得可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统。
进一步的，步骤(1)中所述生物可降解的高分子基础载体为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸或聚己内酯中的任意一种；所述可上调LRP1的功能小分子为罗格列酮和他汀类药物，所述他汀类药物为辛伐他汀、美伐他汀和阿托伐他汀中的任意一种，所述生物可降解的高分子基础载体与所述可上调LRP1的功能小分子的质量比为100:0.5～100:100，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。
进一步的，步骤(2)中所述抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或抗肿瘤的 siRNA、DNA、蛋白、多肽、抗体中的任意一种，所述阿霉素为三乙胺脱盐后的产物，所述生物可降解的高分子基础载体与所述抗肿瘤药物的质量比为 100:1～100:50。
进一步的，步骤(4)和步骤(5)中所述外水相和挥发水相分别为2.5％-5％和0.01％-0.3％的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。
进一步的，步骤(6)所采用的低速离心的转速为1000rpm。
进一步的，步骤(7)～(10)中所述超速离心的速度为13000rpm-35000rpm。
进一步的，步骤(8)中所述功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，所述生物可降解的高分子基础载体与聚乙二醇的摩尔比为 1:0.005-1:1，所述聚乙二醇的分子量为2000、3500、5000中的任意一种。
进一步的，步骤(9)中所述生物可降解的高分子基础载体与LRP1靶向配体的摩尔比为1:0.005-1:1，同时在反应过程中加入TCEP打开LRP1靶向配体中的二硫键，TCEP与LRP1靶向配体的摩尔比为50:1～1:1。
进一步的，步骤(11)中所述冻干保护剂为海藻糖，所述海藻糖与所述生物可降解的高分子基础载体的质量比为10:1～1:1。
上述方式所制备的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统能够应用于靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞制剂中。
本发明提供了一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其优点在于，该方法简单，不需要特殊的处理，经灭菌，可直接用于细胞和动物实验。本发明以生物可降解的高分子材料为基础载体，制备内部携载上调LRP1的功能小分子、表面修饰LRP1靶向配体的纳米给药系统。基于LRP1在脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面高表达，该纳米给药系统可在表面配体作用下靶向递送内部装载的LRP1上调分子，特异性上调脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面的LRP1水平，从而促进LRP1靶向配体修饰纳米给药系统在脑转移瘤的蓄积，而纳米给药系统蓄积的增多也会导致脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞上LRP1表达的进一步上调，从而进一步促进纳米给药系统的脑转移瘤蓄积，由此，纳米给药系统形成一种自促进的药物传递系统。该纳米给药系统装载抗肿瘤药物，可实现治疗浓度的药物递送，具有较高的操作性和经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，
图1为基于LRP1上调的可有效克服血脑屏障且靶向抑制脑转移瘤的纳米给药系统的示意图；
图2为透射电镜表征外观形态--载阿霉素多肽修饰纳米粒；
图3为透射电镜表征外观形态--共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒；
图4为高效液相表征共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒中辛伐他汀体外释放行为；
图5为荧光表征共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒中阿霉素体外释放行为；
图6为MTT实验表征游离辛伐他汀在脑微血管内皮细胞上的毒性；
图7为定量表征在脑微血管内皮细胞上游离辛伐他汀对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性，其中，辛伐他汀的浓度为1μM，阿霉素的浓度为3μg/mL；
图8为定量表征在脑微血管内皮细胞上游离辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取的影响，其中，辛伐他汀的浓度为1μM，阿霉素的浓度为3μg/mL；
图9为定量表征在脑微血管内皮细胞上不同载药量的载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对载阿霉素多肽修饰纳米粒摄取的影响，其中，阿霉素的浓度为 3μg/mL；
图10为定量表征在脑微血管内皮细胞上载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性，其中，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的载药量为8.6％，阿霉素的浓度为3μg/mL；
图11为共聚焦荧光显微镜考察细胞水平多肽修饰纳米粒、游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑微血管内皮细胞上LRP1表达的影响，其中，辛伐他汀的浓度为1μM，标尺：50μm；
图12为小动物成像考察预给游离辛伐他汀对载IR780聚乙二醇修饰纳米粒和载IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积的影响，其中，辛伐他汀的剂量为10mg/kg，IR780的剂量为2mg/kg；
图13为小动物成像考察预给载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的次数对载 IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积的影响，其中，辛伐他汀的剂量为10 mg/kg，IR780的剂量为2mg/kg；
图14为共聚焦荧光显微镜考察在正常小鼠体内载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对血管上LRP1表达的影响，其中，辛伐他汀的剂量为10mg/kg，标尺： 25μm；
图15为MTT实验表征游离辛伐他汀在脑转移瘤细胞上的毒性；
图16为定量表征在脑转移瘤细胞上游离辛伐他汀对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性，其中，辛伐他汀的浓度为1μM，阿霉素的浓度为3μg/mL；
图17为定量表征在脑转移瘤细胞上游离辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取的影响，其中，辛伐他汀的浓度为1μM，阿霉素的浓度为3μg/mL；
图18为定量表征在脑转移瘤细胞上载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性，其中，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的载药量为8.6％，阿霉素的浓度为3μg/mL；
图19为共聚焦荧光显微镜考察细胞水平多肽修饰纳米粒、游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞上LRP1表达的影响，其中，辛伐他汀的浓度为1μM，标尺：50μm；
图20为荧光显微镜考察在脑转移瘤模型鼠上预给辛伐他汀或载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒在脑内蓄积的影响，其中，辛伐他汀的剂量为2mg/kg，阿霉素的剂量为5mg/kg，标尺：400μm；
图21为采用Image J对图20的正常脑区域和脑转移瘤区域的阿霉素的平均荧光强度的定量分析；
图22为共聚焦荧光显微镜考察脑转移瘤模型鼠上载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞上LRP1表达的影响，其中，辛伐他汀的剂量为10 mg/kg，标尺：25μm；
图23为采用Image J对图22的脑转移瘤细胞上LRP1的平均荧光强度的定量分析；
图24为MTT实验表征游离辛伐他汀、多肽修饰纳米粒和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒在脑转移瘤细胞上的毒性；
图25为MTT实验表征游离阿霉素、载辛伐他汀多肽修饰纳米粒和共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒在脑转移瘤细胞上的毒性；
图26为游离阿霉素和共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤模型小鼠的治疗生存百分比，其中，阿霉素的剂量为4mg/kg。
具体实施方式
本发明在配体修饰的受体介导跨细胞转运基础上，进一步增加药物传递系统的血脑屏障穿透效率。他汀类药物，临床上常用的降血脂药物，其作为羟甲基戊二酰辅酶A的抑制剂，可抑制内源性胆固醇的合成，从而增加LRP1 的表达。本发明选用高分子材料、功能连接分子、LRP1靶向配体、可上调 LRP1的功能小分子和抗肿瘤药物，以生物可降解的高分子材料为基础载体，制备内部携载可上调LRP1的功能小分子、表面修饰LRP1靶向配体的纳米给药系统。基于LRP1在脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面高表达，该纳米给药系统可在表面配体作用下靶向递送内部装载的LRP1上调分子，特异性上调脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面的LRP1水平，从而促进 LRP1靶向配体修饰纳米给药系统在脑转移瘤的蓄积，而纳米给药系统蓄积的增多也会导致脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞上LRP1表达的进一步上调，从而进一步促进纳米给药系统的脑转移瘤蓄积，由此，纳米给药系统形成一种自促进的药物传递系统。该纳米给药系统装载抗肿瘤药物，可实现治疗浓度的药物递送。本发明有望提高以纳米给药系统为基础的药物传递系统的脑转移瘤靶向效率。
下面具体介绍一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的结构、制备方法及应用。
本发明提供一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统，以生物可降解的高分子材料为基础载体，制备内部携载上调LRP1的功能小分子、表面修饰LRP1靶向配体的纳米给药系统，同时将该纳米给药系统装载抗肿瘤药物，可实现治疗浓度的药物递送，其由高分子材料、功能连接分子、 LRP1靶向配体、上调LRP1的功能小分子和抗肿瘤药物组成；
其中，所述高分子材料与功能连接分子的摩尔比为1:0.005-1:1；高分子材料与LRP1靶向配体的摩尔比为1:0.005-1:1；高分子材料与可上调LRP1 的功能小分子的质量比为100:0.5～100:100；高分子材料与抗肿瘤药物的质量比为100:1～100:50；
所述的高分子材料为聚乳酸(分子量为0.3-1.5万、1.5-3万、3-5.5万、 5.5-9万)、聚乳酸-羟基乙酸(分子量为0.1-1.5万、1.5-2.4万、2.4-3.8万、3.8-5.3 万、5.3-7万、7-8.8万，丙交酯和乙交酯的比例为75/50或50/50)、聚己内酯(分子量为0.4-4万，4-10.6万)；
所述的功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺；
所述的LRP1靶向配体，本发明的实施例中以Angiopep-2为例，序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY；
所述的可上调LRP1的功能小分子，为罗格列酮和他汀类药物包括辛伐他汀、美伐他汀、阿托伐他汀，本发明的一个实施例中以辛伐他汀为模式药物；
所述的抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或抗肿瘤的siRNA、DNA、蛋白、多肽、抗体等。
本发明的靶向纳米给药系统适用于靶向人体来源和动物来源的脑转移瘤细胞及其他细胞。
本发明按下述方法制备基于LRP1上调的可有效克服血脑屏障且靶向抑制脑转移瘤的纳米给药系统。
一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，包括：
步骤一：将生物可降解的高分子基础载体溶于适量的有机溶剂中，同时加入一定量的可上调LRP1的功能小分子，形成油相；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将生物可降解的高分子基础载体溶于适量的有机溶剂中，同时加入一定量的可上调LRP1的功能小分子，形成油相，其中，所述的高分子材料为聚乳酸(分子量为0.3-1.5万、1.5-3 万、3-5.5万、5.5-9万)、聚乳酸-羟基乙酸(分子量为0.1-1.5万、1.5-2.4万、 2.4-3.8万、3.8-5.3万、5.3-7万、7-8.8万，丙交酯和乙交酯的比例为75/50 或50/50)、聚己内酯(分子量为0.4-4万，4-10.6万)，所述可上调LRP1功能小分子为罗格列酮和他汀类药物包括辛伐他汀、美伐他汀、阿托伐他汀，所述高分子材料与可上调LRP1的功能小分子的质量比为100:0.5～100:100，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。
步骤二：将抗肿瘤药物溶于水中，形成内水相；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将抗肿瘤药物溶于水中，形成内水相，其中，抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或抗肿瘤的siRNA、DNA、蛋白、多肽、抗体等，所述阿霉素为三乙胺脱盐后的产物，所述的高分子材料与抗肿瘤药物的质量比为100:1～100:50。
步骤三：将所述内水相在涡旋条件下加入油相中，超声乳化形成油包水乳剂；
步骤四：再将所述乳剂在涡旋的条件下滴加入外水相中，超声乳化形成水包油包水的乳剂；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：再将所述乳剂在涡旋的条件下滴加入外水相中，超声乳化形成水包油包水的乳剂，所述外水相为2.5％-5％的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。
步骤五：迅速将上述水包油包水的乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发除去有机溶剂，以固化形成纳米粒混悬液；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：迅速将上述水包油包水的乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发除去有机溶剂，以固化形成纳米粒混悬液，所述挥发水相为0.01％-0.3％的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。
步骤六：所述的纳米粒混悬液通过低速离心获得上清以除去较大的纳米粒和未包封的可上调LRP1的功能小分子；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：所述的纳米粒混悬液通过 1000rpm低速离心获得上清以除去较大的纳米粒和未包封的可上调LRP1的功能小分子。
步骤七：将上述上清通过超速离心以获得未修饰的纳米粒；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将上述上清通过在13000 rpm-35000rpm的超速离心以获得未修饰的纳米粒。
步骤八：将未修饰的纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，表面修饰功能连接分子，室温反应1小时，通过超速离心获得功能连接分子修饰的纳米粒；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将未修饰的纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，表面修饰功能连接分子，室温反应1小时，通过在13000rpm-35000rpm的超速离心获得功能连接分子修饰的纳米粒，其中，所述的功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，所述的高分子材料与聚乙二醇的摩尔比为1:0.005-1:1，所述的聚乙二醇的分子量为2000、 3500、5000。
步骤九：将上述纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，通过功能连接分子修饰LRP1靶向配体，室温反应1小时，通过超速离心获得LRP1靶向配体修饰的纳米粒；
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将上述纳米粒通过超声分散于PBS7.4溶液中，通过功能连接分子修饰LRP1靶向配体，室温反应1 小时，通过在13000rpm-35000rpm的超速离心获得LRP1靶向配体修饰的纳米粒，其中，所述的高分子材料与LRP1靶向配体的摩尔比为1:0.005-1:1，同时在反应过程中加入TCEP打开LRP1靶向配体中的二硫键，TCEP与LRP1 靶向配体的摩尔比为50:1～1:1。
步骤十：将LRP1靶向配体修饰的纳米粒重悬于水中，通过超速离心获得最终的纳米粒。
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将LRP1靶向配体修饰的纳米粒重悬于水中，通过在13000rpm-35000rpm的超速离心获得最终的纳米粒。
步骤十一：将最终的纳米粒重悬于水中，加入冻干保护剂，进行冻干以备后续实验
在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将最终的纳米粒重悬于水中，加入海藻糖，海藻糖与高分子材料的质量比为10:1～1:1，进行冻干以备后续实验。
上述制备好的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统可用于制备治疗乳腺癌脑转移瘤制剂，应用于靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞制剂。
上述制备好的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统请参阅图1。如图1所示，该图为本发明的纳米递送系统作用机制图，以生物可降解的高分子材料为基础载体，制备内部携载上调LRP1的功能小分子、表面修饰LRP1靶向配体的纳米给药系统。基于LRP1在脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面高表达，该纳米给药系统可在表面配体作用下靶向递送内部装载的LRP1上调分子，特异性上调脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面的LRP1水平，从而促进LRP1靶向配体修饰纳米给药系统在脑转移瘤的蓄积，而纳米给药系统蓄积的增多也会导致脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞上LRP1表达的进一步上调，从而进一步促进纳米给药系统的脑转移瘤蓄积，由此，纳米给药系统形成一种自促进的药物传递系统。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
实施例1
称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸和50mg辛伐他汀溶于1mL乙酸乙酯中作为油相，称取25mg盐酸阿霉素溶于100μL水中，60μL三乙胺脱盐酸，阿霉素溶液作为内水相在涡旋条件下逐滴加入油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂在涡旋条件下逐滴加入4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入50mL0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过1000rpm低速离心5min获得上清以去除较大纳米粒和未包封的辛伐他汀；将前述上清经过30000rpm超速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，加入0.03mg该PBS 7.4溶液溶解的双功能团琥珀酰亚胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺，室温下反应1小时后经过30000rpm 超速离心20min除去过量连接基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，进行表面修饰靶向基团，加入0.015mg多肽Angiopep-2和0.090mg TCEP室温下反应1小时后经过30000rpm超速离心20min除去过量靶向基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于水中，经过30000rpm超速离心20min以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中，加入海藻糖，进行冻干。
实施例2
称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸和50mg辛伐他汀溶于1mL乙酸乙酯中作为油相，称取25mg盐酸阿霉素溶于100μL水中，60μL三乙胺脱盐酸，阿霉素溶液作为内水相在涡旋条件下逐滴加入油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂在涡旋条件下逐滴加入4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入50mL0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过1000rpm低速离心5min获得上清以去除较大纳米粒和未包封的辛伐他汀；将前述上清经过30000rpm超速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，加入6.1mg该PBS 7.4溶液溶解的双功能团琥珀酰亚胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺，室温下反应1小时后经过30000rpm 超速离心20min除去过量连接基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，进行表面修饰靶向基团，加入2.92mg多肽Angiopep-2和18mg TCEP室温下反应1小时后经过30000rpm超速离心 20min除去过量靶向基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于水中，经过30000rpm超速离心20min以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中，加入海藻糖，进行冻干。
实施例3
称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸和0.25mg辛伐他汀溶于1mL 乙酸乙酯中作为油相，称取0.5mg盐酸阿霉素溶于100μL水中，1.2μL三乙胺脱盐酸，阿霉素溶液作为内水相在涡旋条件下逐滴加入油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂在涡旋条件下逐滴加入4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入50mL 0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过1000rpm 低速离心5min获得上清以去除较大纳米粒和未包封的辛伐他汀；将前述上清经过30000rpm超速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，加入0.03mg该PBS 7.4溶液溶解的双功能团琥珀酰亚胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺，室温下反应1小时后经过30000 rpm超速离心20min除去过量连接基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，进行表面修饰靶向基团，加入0.015mg 多肽Angiopep-2和0.090mg TCEP室温下反应1小时后经过30000rpm超速离心20min除去过量靶向基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于水中，经过30000rpm超速离心20min以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中，加入海藻糖，进行冻干。
实施例4
称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸和0.25mg辛伐他汀溶于1mL 乙酸乙酯中作为油相，称取0.5mg盐酸阿霉素溶于100μL水中，1.2μL三乙胺脱盐酸，阿霉素溶液作为内水相在涡旋条件下逐滴加入油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂在涡旋条件下逐滴加入4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入50mL 0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过1000rpm 低速离心5min获得上清以去除较大纳米粒和未包封的辛伐他汀；将前述上清经过30000rpm超速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，加入6.1mg该PBS 7.4溶液溶解的双功能团琥珀酰亚胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺，室温下反应1小时后经过30000 rpm超速离心20min除去过量连接基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于适量PBS 7.4溶液里，进行表面修饰靶向基团，加入2.92mg多肽Angiopep-2和18mg TCEP室温下反应1小时后经过30000rpm超速离心 20min除去过量靶向基团并沉淀纳米粒；再将所得的沉淀纳米粒超声分散于水中，经过30000rpm超速离心20min以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中，加入海藻糖，进行冻干。
实施例5
采用透射电镜技术对载阿霉素多肽修饰纳米粒和共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒的表面形态性质进行表征。该实施例结论请参阅图2和图 3，图2为通过透射电镜表征载阿霉素多肽修饰纳米粒的外观形态图，图3 为通过透射电镜表征共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒的外观形态图。如图2所示，载阿霉素多肽修饰纳米粒的粒径在53.0至100.2nm之间，如图3所示，共载阿霉素和辛伐他汀纳米粒的粒径在57.7至107.7nm之间。
实施例6
为了评价共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒在体外生理条件下释放药物的能力，遂采用透析法考察药物释放。将新鲜制备的共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒分散于PBS 7.4溶液中，取2mL纳米粒混悬液(含有 138.6μg阿霉素和133.0μg辛伐他汀)置于截留分子量为3500D的透析袋中，以100mL PBS 7.4(含有0.5％十二烷基硫酸钠)为释放介质。在不同的时间点，以1mL新鲜的PBS 7.4(含有0.5％十二烷基硫酸钠)代替释放介质。采用高效液相考察辛伐他汀释放行为，采用酶标仪考察阿霉素释放行为。该实施例请参阅图4和图5，图4为高效液相表征共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒中辛伐他汀体外释放行为，图5为荧光表征共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒中阿霉素体外释放行为。如图4所示，共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒中辛伐他汀具有一定的缓释效果，24小时时，释放达到66.24％，如图5所示，共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒中阿霉素具有一定的缓释效果，24小时时，释放达到27.09％。
实施例7
为了评价游离辛伐他汀对脑微血管内皮细胞的毒性，采用MTT法评价细胞存活率。将bEND.3细胞以3.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24 小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的辛伐他汀存在的条件下孵育36或48小时，然后采用MTT评价细胞的存活率。该实施例结论请参阅图6，图6为MTT实验表征游离辛伐他汀对脑微血管内皮包的毒性，如图6所示，当辛伐他汀的浓度小于2μM，细胞活性大于80％。
实施例8
为了评价游离辛伐他汀对脑微血管内皮细胞摄取载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将bEND.3细胞以3.0×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24 小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将1μM游离辛伐他汀与细胞孵育不同时间后，在最后3小时，加入载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm 激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图7，图7为定量表征在脑微血管内皮细胞上游离辛伐他汀对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性。如图7所示，辛伐他汀的促进作用呈现时间依赖性，在预孵育时间为36小时时，辛伐他汀促进效应最佳。
实施例9
为了评价游离辛伐他汀对脑微血管内皮细胞摄取游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将bEND.3细胞以 3.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将1μM游离辛伐他汀与细胞预孵育36小时后，加入游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图8，图8为定量表征在脑微血管内皮细胞上游离辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取的影响。如图8所示，游离辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒的细胞摄取均有促进作用。
实施例10
为了筛选载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的载药量对脑微血管内皮细胞摄取载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将bEND.3细胞以3.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将不同载药量的载辛伐他汀多肽修饰纳米粒与细胞孵育36小时后，加入载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图9，图9为定量表征在脑微血管内皮细胞上不同载药量的载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对载阿霉素多肽修饰纳米粒摄取的影响。如图 9所示，当载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的载药量为8.6％，促进作用最佳。
实施例11
为了评价载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑微血管内皮细胞摄取载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将bEND.3细胞以3.0×103细胞/孔的密度培养在 96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将载药量为8.6％载辛伐他汀多肽修饰纳米粒与细胞孵育不同时间后，加入载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图10，图10为定量表征在脑微血管内皮细胞上载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性。如图10 所示，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的促进作用呈现时间依赖性。
实施例12
为了考察辛伐他汀对脑微血管内皮细胞上LRP1表达的作用，将bEND.3 接种于48孔板爬片中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将细胞分别与多肽修饰纳米粒、游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒孵育36小时后，吸弃含药培养基，辛伐他汀的浓度为1μM，用4％多聚甲醛室温固定10min，用0.1％聚乙二醇辛基苯基醚通透10min，用封闭液(含有 0.1％吐温-20和4％血清的PBS 7.4)室温封闭1小时，孵育LRP1一抗4℃过夜，再孵育荧光标记的二抗2小时，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，通过共聚焦荧光显微镜观察药物对脑微血管内皮细胞LRP1表达的影响。该实施例结论请参阅图11，图11为共聚焦荧光显微镜考察细胞水平多肽修饰纳米粒、游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑微血管内皮细胞上 LRP1表达的影响。如图11所示，游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒均可以上调脑微血管内皮细胞的LRP1表达水平。
实施例13
为了考察辛伐他汀对载IR780聚乙二醇修饰纳米粒和载IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积的影响，将正常小鼠静脉注射游离辛伐他汀两次，辛伐他汀的给药剂量为10mg/kg，间隔时间为12小时，最后一次给药结束48小时后，小鼠分别被注射载IR780聚乙二醇修饰纳米粒和载IR780多肽修饰纳米粒，IR780的剂量为2mg/kg，12小时后，将小鼠处死，对离体器官进行荧光成像分析。同时，以未预给辛伐他汀的正常小鼠作为对照。该实施例的结论请参阅图12，图12为小动物成像考察预给游离辛伐他汀对载IR780聚乙二醇修饰纳米粒和载IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积的影响。如图12所示，载IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积强于载IR780聚乙二醇修饰纳米粒的脑内蓄积，预给辛伐他汀后，载IR780聚乙二醇修饰纳米粒和载IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积均增强。
实施例14
为了考察载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的自促进效应，将正常小鼠静脉注射不同次数的载辛伐他汀多肽修饰纳米粒，辛伐他汀的给药剂量为10 mg/kg，间隔时间为12小时，最后一次给药结束48小时后，小鼠被注射载 IR780多肽修饰纳米粒，IR780的剂量为2mg/kg，12小时后，将小鼠处死，对离体器官进行荧光成像分析。同时，以未预给辛伐他汀的正常小鼠作为对照。该实施例的结论请参阅图13，图13为小动物成像考察预给载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的次数对载IR780多肽修饰纳米粒的脑内蓄积的影响。如图 13所示，随着预给载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的次数增加，载IR780多肽修饰纳米粒在脑内的蓄积增强。
实施例15
为了考察载辛伐他汀多肽修饰纳米在正常小鼠体内对血管上LRP1表达的作用，将正常小鼠静脉注射五次载辛伐他汀多肽修饰纳米粒，辛伐他汀的剂量为10mg/kg，每次给药间隔12小时，最后一次给药结束后48小时，小鼠静脉注射CD31以标记血管，1小时后，处死小鼠，将小鼠灌固定，取小鼠脑组织，再经蔗糖脱水，进行脑切片。脑片用通透液(含有0.4％聚乙二醇辛基苯基醚和1％血清的PBS 7.4)通透处理10min，重复三次，用封闭液(含有0.1％聚乙二醇辛基苯基醚和4％血清的PBS 7.4)室温封闭1小时，孵育 LRP1一抗4℃过夜，再孵育荧光标记的二抗2小时，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，通过共聚焦荧光显微镜观察载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对血管上LRP1表达的影响，并采用Image J进行荧光定量处理。同时，以生理盐水处理的小鼠作为对照。本实施例的结论请参阅图14，图14为共聚焦荧光显微镜考察在正常小鼠体内载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对血管上LRP1 表达的影响。如图14所示，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒可显著性提高血管上LRP1的表达。
实施例16
为了评价游离辛伐他汀对脑转移瘤细胞的毒性，采用MTT法评价细胞存活率。将231Br细胞以4.0×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的辛伐他汀存在的条件下孵育36或48小时，然后采用MTT评价细胞的存活率。该实施例结论请参阅图15，图15为MTT实验表征游离辛伐他汀在脑转移瘤细胞上的毒性。如图15所示，当辛伐他汀的浓度小于4μM，细胞活性大于80％。
实施例17
为了评价游离辛伐他汀对脑转移瘤细胞摄取载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将231Br细胞以3.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将1μM游离辛伐他汀与细胞孵育不同时间后，在最后3小时，加入载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图16，图16为定量表征在脑转移瘤细胞上游离辛伐他汀对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性。如图16所示，辛伐他汀的促进作用呈现时间依赖性，在预孵育时间为36小时时，辛伐他汀促进效应最佳。
实施例18
为了评价游离辛伐他汀对脑转移瘤细胞摄取游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将231Br细胞以4.0×103 细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将1μM游离辛伐他汀与细胞预孵育36小时后，加入游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3 μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA 法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图17，图17为定量表征在脑转移瘤细胞上游离辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取的影响。如图17所示，游离辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒的细胞摄取均有促进作用。
实施例19
为了评价载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞摄取载阿霉素多肽修饰纳米粒的作用，将231Br细胞以3.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将载药量为8.6％载辛伐他汀多肽修饰纳米粒与细胞孵育不同时间后，加入载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的浓度为3μg/mL。给药结束后，用细胞裂解液裂解细胞，用酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定DOX荧光，定量检测细胞内摄取的DOX。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例结论请参阅图18，图18为定量表征在脑转移瘤细胞上载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对载阿霉素多肽修饰纳米粒细胞摄取促进效应的时间依赖性。如图18所示，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的促进作用呈现时间依赖性。
实施例20
为了考察辛伐他汀对脑转移瘤细胞上LRP1表达的作用，将231Br接种于48孔板爬片中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。将细胞分别与多肽修饰纳米粒、游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒孵育36 小时后，吸弃含药培养基，辛伐他汀的浓度为1μM，用4％多聚甲醛室温固定10min，用0.1％聚乙二醇辛基苯基醚通透10min，用封闭液(含有0.1％吐温-20和4％血清的PBS 7.4)室温封闭1小时，孵育LRP1一抗4℃过夜，再孵育荧光标记的二抗2小时，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，通过共聚焦荧光显微镜观察药物对脑转移瘤细胞LRP1表达的影响。该实施例结论请参阅图19，图19为共聚焦荧光显微镜考察细胞水平多肽修饰纳米粒、游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞上LRP1表达的影响。如图19所示，游离辛伐他汀和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒均可以上调脑转移瘤细胞的LRP1表达水平。
实施例21
为了考察辛伐他汀对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒的脑转移瘤靶向的影响，将脑转移瘤模型鼠分别静脉注射游离辛伐他汀或载辛伐他汀多肽修饰纳米粒10次，辛伐他汀的剂量为2 mg/kg，间隔时间为12小时，最后一次给药12小时后，给小鼠分别注射游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒，阿霉素的剂量为5mg/kg，12小时后，处死小鼠，将小鼠灌固定，取小鼠脑，再经蔗糖脱水，进行脑切片。用宏观荧光显微镜和微观荧光显微镜观察纳米粒在脑转移瘤区域的蓄积。用Image J定量DOX的平均光密度，用Image Pro 定量脑转移瘤和阿霉素的共定位效率。同时，以未预给辛伐他汀的小鼠作为对照。该实施例请参阅图20、图21，图20为荧光显微镜考察在脑转移瘤模型鼠上预给辛伐他汀或载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对游离阿霉素、载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒和载阿霉素多肽修饰纳米粒在脑内蓄积的影响，图21 为采用Image J对图20的正常脑区域和脑转移瘤区域的阿霉素的平均荧光强度的定量分析。如图20和图21所示，对于未经辛伐他汀处理的小鼠，游离阿霉素和载阿霉素聚乙二醇修饰纳米粒在脑内分布较弱，载阿霉素多肽修饰纳米粒载正常脑区域和脑转移瘤均有一定程度分布，对于辛伐他汀预处理的小鼠，载阿霉素多肽修饰纳米粒在正常脑区域和脑转移瘤的摄取均出现增强，对于载辛伐他汀纳米粒预处理的小鼠，载阿霉素多肽修饰纳米粒更多的分布在肿瘤区域。
实施例22
为了考察载辛伐他汀多肽修饰纳米在脑转移瘤模型鼠上对脑转移瘤细胞LRP1表达的作用，将脑转移瘤模型鼠静脉注射五次载辛伐他汀多肽修饰纳米粒，辛伐他汀的剂量为10mg/kg，每次给药间隔12小时，最后一次给药结束后48小时，处死小鼠，将小鼠灌固定，取小鼠脑，再经蔗糖脱水，进行脑切片。脑片用通透液(含有0.4％聚乙二醇辛基苯基醚和1％血清的 PBS 7.4)通透处理10min，重复三次，用封闭液(含有0.1％聚乙二醇辛基苯基醚和4％血清的PBS 7.4)室温封闭1小时，孵育LRP1一抗4℃过夜，再孵育荧光标记的二抗2小时，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，通过共聚焦荧光显微镜观察载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞上LRP1表达的影响，并采用Image J进行荧光定量处理。同时，以生理盐水处理的小鼠作为对照。本实施例的结论请参阅图22和图23，图22为共聚焦荧光显微镜考察在脑转移瘤模型鼠上载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞上 LRP1表达的影响，图23为采用Image J对图22的脑转移瘤细胞上LRP1的平均荧光强度的定量分析。如图22和图23所示，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒可显著性脑转移细胞上LRP1的表达。
实施例23
为了评价载辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞的毒性，采用MTT 法评价细胞存活率。将231Br细胞以4.0×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的载辛伐他汀多肽修饰纳米粒存在的条件下孵育48小时，然后采用MTT评价细胞的存活率。同时，以游离辛伐他汀和多肽修饰纳米粒作为对照。该实施例结论请参阅图24，图24为MTT实验表征游离辛伐他汀、多肽修饰纳米粒和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒在脑转移瘤细胞上的毒性。如图24所示，多肽修饰纳米粒没有明显的细胞毒性，游离辛伐他汀的毒性大于载辛伐他汀多肽修饰纳米粒，游离辛伐他汀的IC50为4.6μg/mL，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的IC50为15.6μg/mL。
实施例24
为了评价共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤细胞的毒性，采用MTT法评价细胞存活率。将231Br细胞以4.0×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24小时后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒存在的条件下孵育48小时，然后采用MTT评价细胞的存活率。同时，以游离阿霉素和载辛伐他汀多肽修饰纳米粒作为对照。该实施例结论请参阅图25，图25为MTT实验表征游离阿霉素、载辛伐他汀多肽修饰纳米粒和共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒在脑转移瘤细胞上的毒性。如图25所示，游离阿霉素的毒性大于共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒，游离辛伐他汀的IC50为0.17 μg/mL，载辛伐他汀多肽修饰纳米粒的IC50为0.72μg/mL。
实施例25
为了评价共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤的治疗效果，载裸鼠心脏注射脑转移瘤细胞5天后分别静脉给药游离阿霉素、载辛伐他汀多肽修饰纳米粒、共载阿霉素和辛伐他汀的靶向纳米粒，阿霉素的剂量为5mg/kg，一周两次，记录脑转移瘤模型小鼠的生存期。该实施例结论请参阅图26，图26为游离阿霉素和共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒对脑转移瘤模型小鼠的治疗生存百分比。如图26所示，共载阿霉素和辛伐他汀多肽修饰纳米粒可以延长脑转移瘤模型鼠的生存期，具有良好的治疗脑转移瘤的前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及其应用，以生物可降解的高分子材料作为基础载体，内部装载可上调LRP1的功能小分子，表面修饰LRP1靶向配体。基于LRP1在脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面高表达，该纳米给药系统可在表面配体作用下靶向递送内部装载的LRP1上调分子，特异性上调脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞表面的LRP1水平，从而促进LRP1靶向配体修饰纳米给药系统在脑转移瘤的蓄积，而纳米给药系统蓄积的增多也会导致脑微血管内皮细胞和脑转移瘤细胞上LRP1表达的进一步上调，从而进一步促进纳米给药系统的脑转移瘤蓄积，由此，纳米给药系统形成一种自促进的药物传递系统。纳米给药系统装载抗肿瘤药物，可实现治疗浓度的药物递送。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将生物可降解的高分子基础载体溶于有机溶剂中，同时加入可上调LRP1的功能小分子，形成油相；
(2)将抗肿瘤药物溶于水中，形成内水相；
(3)将所述内水相在涡旋条件下加入所述油相中，超声乳化形成油包水乳剂；
(4)将所述油包水乳剂在涡旋的条件下滴加入外水相中，超声乳化形成水包油包水型的复乳；
(5)将所述复乳倒入挥发水相中，搅拌挥发除去有机溶剂，以固化形成纳米粒混悬液；
(6)所述纳米粒混悬液通过低速离心除去较大的纳米粒和未包封的可上调LRP1的功能小分子，获得上清液；
(7)将所述上清液通过超速离心以获得未修饰的第一纳米粒；
(8)将所述第一纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，表面修饰功能连接分子，室温反应1小时，通过超速离心获得功能连接分子修饰的第二纳米粒；
(9)将所述第二纳米粒通过超声分散于PBS 7.4溶液中，通过功能连接分子修饰LRP1靶向配体，室温反应1小时，通过超速离心获得LRP1靶向配体修饰的第三纳米粒；
(10)将所述第三纳米粒重悬于水中，通过超速离心获得最终的纳米粒；
(11)将所述最终的纳米粒重悬于水中，加入冻干保护剂中，进行冻干，获得可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统。
2.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述生物可降解的高分子基础载体为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸或聚己内酯中的任意一种；所述可上调LRP1的功能小分子为罗格列酮和他汀类药物，所述他汀类药物为辛伐他汀、美伐他汀和阿托伐他汀中的任意一种，所述生物可降解的高分子基础载体与所述可上调LRP1的功能小分子的质量比为100:0.5～100:100，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。
3.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或抗肿瘤的siRNA、DNA、蛋白、多肽、抗体中的任意一种，所述阿霉素为三乙胺脱盐后的产物，所述生物可降解的高分子基础载体与所述抗肿瘤药物的质量比为100:1～100:50。
4.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(4)和(5)中所述外水相和挥发水相为2.5％-5％和0.01％-0.3％的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。
5.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(6)所采用的低速离心的转速为1000rpm。
6.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(7)～(10)中所述超速离心的速度为13000rpm-35000rpm。
7.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(8)中所述功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，所述生物可降解的高分子基础载体与聚乙二醇的摩尔比为1:0.005-1:1，所述聚乙二醇的分子量为2000、3500、5000中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(9)中所述生物可降解的高分子基础载体与LRP1靶向配体的摩尔比为1:0.005-1:1，同时在反应过程中加入TCEP打开LRP1靶向配体中的二硫键，TCEP与LRP1靶向配体的摩尔比为50:1～1:1。
9.根据权利要求1所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(11)中所述冻干保护剂为海藻糖，所述海藻糖与所述生物可降解的高分子基础载体的质量比为10:1～1:1。
10.根据权利要求1—9所述的一种可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法所制备的可上调和靶向LRP1的脑转移瘤靶向纳米给药系统在靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞制剂中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111617260A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-09-04 | 苏州大学 | 可避免lrp1介导回流的融合肽修饰的脑转移瘤靶向纳米给药系统及其制备方法和应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN102552928A (zh) * | 2010-12-19 | 2012-07-11 | 复旦大学 | 一种治疗脑部肿瘤的双级靶向递药系统及其制备方法 |
| US20180169242A1 (en) * | 2016-12-19 | 2018-06-21 | Shiner Pharm Corp. | Pharmaceutical combination for cancer treatment and the therapeutic use thereof |
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