CN109805242A - 一种复合植物提取物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合植物提取物，包括：丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物。本发明的复合植物提取物的有效成分均来源于天然植物的提取物，包括丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物，实际测试结果表明，该复合植物提取物对食源性致病菌具有有效的抑菌和杀菌效果；而且，该复合植物提取物来源于天然植物，对人体不产生的危害，具有安全、高效的抗菌效果，本发明可应用于食品保鲜，以及食品设备，环境，该复合植物提取物能够取代传统的化学保鲜剂，对减少化学残留、保护环境、保证人体健康、延长蔬菜的贮藏期限等都具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全技术领域，特别是涉及一种复合植物提取物、制备方法及应用。
背景技术
“民以食为天，食以安为先”，食品安全问题已成为全社会关注的焦点问题。食品长期放置会因食源性致病菌的滋生，导致腐败变质的情况发生，腐败变质不仅会使食品丧失营养价值，还会造成食物中毒、资源损失和环境污染。
为了抑制和消除食源性致病菌，常常需要在食品中添加杀菌防腐剂，以实现杀菌防腐，延长食品保存期，但目前使用的杀菌防腐剂大都为化学杀菌防腐剂，对人体有一定的危害。随着人们对食品安全日益重视，这种化学类的杀菌防腐剂显然已经不能满足人们的需求。
发明内容
鉴于上述状况，本发明提供一种复合植物提取物，以替代传统化学类的杀菌防腐剂。
一种复合植物提取物，包括：丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物。
其中，所述甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度比为(1～3)：(1～4)：(1～3)：(1～3)。
可选的，所述甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度比为2：4：2：1。
本发明还提供了上述复合植物提取物的制备方法，将丁香、迷迭香、甘草、牛至分别粉碎后，分别用99.5％的无水乙醇浸泡提取，各植物的质量与乙醇的体积之比均为1∶9，浸泡振荡48h，过滤得滤液，以得到丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物，再将丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物混合。
其中，所述无水乙醇的浓度为99.5％。
其中，用无水乙醇浸泡提取各植物时，各植物的质量与乙醇的体积之比均为1∶9。
其中，浸泡振荡的时间为40～52h。
可选的，具体在130～170rpm/min的条件下，浸泡振荡48h。
本发明还提供了上述复合植物提取物在抗食源性致病菌中的应用。
其中，所述食源性致病菌包括荧光假单胞菌，肠炎沙门氏菌，变形杆菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌。
本发明的复合植物提取物的有效成分均来源于天然植物的提取物，包括丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物，实际测试结果表明，该复合植物提取物对食源性致病菌具有有效的抑菌和杀菌效果；而且，该复合植物提取物来源于天然植物，对人体不产生的危害，具有安全、高效的抗菌效果，本发明可应用于食品保鲜，以及食品设备，环境，该复合植物提取物能够取代传统的化学保鲜剂，对减少化学残留、保护环境、保证人体健康、延长蔬菜的贮藏期限等都具有重要的现实意义。
附图说明
图1为复合植物提取物最佳配方对供试菌杀菌作用的结果示意图，其中，*表示在检测限值以下(＜1.0log cfu/ml)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
复合植物提取物的抗菌试验：
(1)实验菌(菌名为斜体)
食源性致病菌：
荧光假单胞菌(Pseudomonadaceae Fluorescens ATCC 13525)；
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis CMCC(B)50335)；
变形杆菌(proteus species CMCC(B)49027)；
大肠杆菌(E.coli k-12IFO 3301)；
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)；
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26003)
(2)实验方法
2.1复合植物提取物
准备丁香、迷迭香、甘草、牛至四种植物，将准备好的丁香、迷迭香、甘草、牛至分别粉碎后，分别用99.5％的无水乙醇浸泡提取，各植物的质量与乙醇的体积之比均为1∶9(m/v)，浸泡振荡40～52h，优选的，在130～170rpm/min的条件下，浸泡振荡40～52h，具体在本实施例中，在150rpm/min的条件下，浸泡振荡48h，然后过滤得滤液(滤液可在4℃保存)，从而得到丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物，再将丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物混合。
2.2抑菌圈的测定
抑菌圈的测定采用滤纸片法，用移液管吸取0.1mL浓度为105～106cfu/ml的实验菌悬液，在TSA培养基平板表面涂抹均匀。取无菌干燥的滤纸片(φ5mm)，置于所制备的复合植物提取物中充分浸泡(30s)，沥干后置于带菌平板上，35℃培养24—48小时，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。实验重复3次，结果取平均值。
2.3最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
复合植物提取物对试验菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定采用液体稀释法。用无菌的TSB培养基制备复合植物提取物的2倍稀释系列，使复合植物提取物的最终浓度分别为0.8％、0.4％、0.2％、0.1％、0.05％、0.025％、.0125％(v/v)。充分混匀后接入复培养后的菌悬液，使最终的含菌量约为105cfu/mL。在35℃的生化培养箱中培养24h(单增李斯特菌培养48h)。与对照比较，MIC定为用肉眼看不出TSB培养基中细菌繁殖的最小浓度。从MIC检测中未见细菌繁殖的试验管中用接种环各取一环，采用平板划线法接种到无菌的TSA培养基上，在35℃的生化培养箱中培养24h(单增李斯特菌培养48h)。在TSA培养基中完全看不到菌落形成的最小浓度定为MBC。
2.4正交试验
选择丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物作为复合抑菌剂的主要成分，即影响因素，以大肠杆菌k-12 IFO 3301作为试验菌株进行L9正交试验。影响因素水平见表1。
表1正交试验影响因素水平表
2.5最优组合、最佳配方的杀菌活性实验
最优组合的实验磷酸生理盐水缓冲液(PBS)中添加2.4正交试验确定的最优组合，添加各种试验菌，使初始菌数为105～106cfu/mL。混合均匀，在35℃中，振荡反应4h后，利用营养琼脂培养基测定残存菌数。
(3)实验结果
正交试验结果如表2所示。从表2中可以看出，在各试验水平平均数极差中，牛至浓度因素的极差最大，是影响复合植物提取物抑菌效果的关键因子；其次丁香浓度，最后是甘草、迷迭香。需要指出的是，本实施例中，表2中，每个植物提取物的因素1表示的质量浓度为0.05％，因素2表示的质量浓度为0.1％，因素3表示的质量浓度为0.2％。在比较各试验因子的总计数和平均数后可以看出：甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度比可以为1～3)：(1～4)：(1～3)：(1～3)，且A取A3，B取B3，C取C3，D取D2即A3B3C3D2组合时(对应的甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度比为2：4：2：1，即本实施例中，甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度分别为0.1％、0.2％、0.1％、0.05％)，该复合植物提取物的抑菌效果最好。
表2复合植物提取物最佳配方正交试验结果
复合植物提取物最佳配方正交试验方差分析的结果见表3。根据方差分析，表中各项变异来源中，牛至浓度的F值具有显著性，说明牛至浓度对复合植物提取物抑菌效果的影响最显著；甘草浓度和丁香浓度对复合植物提取物的抑菌效果影响不显著。
表3复合植物提取物最佳配方正交试验方差分析
*表示差异显著
从图1可以看出，将正交试验确定的最佳配方用于对6种供试菌的杀菌，均显示出了较强杀菌作用。在PBS中持续作用4小时后，肠炎沙门氏菌和大肠杆菌的残存菌数与对照相比，分别减少了3.6、4.1log cfu/ml。其他供试菌的残存菌数均降到了检测限值以下(＜1.0log cfu/ml)。
实施例2
单一植物提取物的抗菌试验：
(1)实验菌(菌名为斜体)
食源性致病菌：
荧光假单胞菌(Pseudomonadaceae Fluorescens ATCC 13525)；
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis CMCC(B)50335)；
变形杆菌(proteus species CMCC(B)49027)；
大肠杆菌(E.coli k-12 IFO 3301)；
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)；
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26003)
(2)实验方法
2.1单一植物提取物
准备桂皮、丁香、鼠尾草、迷迭香、甘草、百里香、八角、牛至共八种植物，将准备好的桂皮、丁香、鼠尾草、迷迭香、甘草、百里香、八角、牛至分别粉碎后，分别用99.5％的无水乙醇浸泡提取，各植物的质量与乙醇的体积之比均为1∶9(m/v)，在150rpm/min的条件下，浸泡振荡48h，然后过滤得滤液(滤液可在4℃保存)，从而分别得到桂皮提取物、丁香提取物、鼠尾草提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、百里香提取物、八角提取物、牛至提取物共八种单一植物提取物。
2.2抑菌圈的测定
抑菌圈的测定采用滤纸片法，用移液管吸取0.1mL浓度为105～106cfu/ml的实验菌悬液，在TSA培养基平板表面涂抹均匀。取无菌干燥的滤纸片(φ5mm)，置于所制备的植物提取物中充分浸泡(30s)，沥干后置于带菌平板上，35℃培养24—48小时，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。实验重复3次，结果取平均值。
2.3最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
各单一植物提取物对试验菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定采用液体稀释法。用无菌的TSB培养基制备各单一植物提取物的2倍稀释系列，使各单一植物提取物的最终浓度分别为0.8％、0.4％、0.2％、0.1％、0.05％、0.025％、.0125％(v/v)。充分混匀后接入复培养后的菌悬液，使最终的含菌量约为105cfu/mL。在35℃的生化培养箱中培养24h(单增李斯特菌培养48h)。与对照比较，MIC定为用肉眼看不出TSB培养基中细菌繁殖的最小浓度。从MIC检测中未见细菌繁殖的试验管中用接种环各取一环，采用平板划线法接种到无菌的TSA培养基上，在35℃的生化培养箱中培养24h(单增李斯特菌培养48h)。在TSA培养基中完全看不到菌落形成的最小浓度定为MBC。
(3)实验结果
各单一植物提取物的抑菌作用
从表4可以看出，丁香、鼠尾草、迷迭香、八角、牛至对荧光假单孢菌有较强的抑菌作用，其中丁香与牛至的抑菌圈直径分别达到14、13mm，其他几种提取物对荧光假单孢菌的抑菌作用表现为一般。对肠炎沙门氏菌，8种植物提取物中除丁香和牛至以外，均没有较强的抑菌作用。对变形杆菌，桂皮、鼠尾草、迷迭香、甘草、百里香、牛至显示出了较强的抑菌作用。丁香对单增李斯特菌抑菌能力最强，抑菌圈直径为12.6mm，其次为百里香、牛至等。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，除桂皮抑菌作用较弱以外，其他几种植物提取物均显示出较强的抑菌作用。综上所述，8种单一植物提取物对6种供试菌都有不同程度的抑菌作用，其中丁香、迷迭香、甘草、百里香和牛至对6种供试菌具有较强的抑菌作用。
表4各单一植物提取物对试验菌的抑菌圈直径(mm)
各单一植物提取物对试验菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)从表5可以看出，各单一植物提取物对于供试菌种都有不同程度的抑菌作用。牛至对荧光假单孢抑菌作用最强，其MIC为0.05％；其次为鼠尾草和迷迭香，MIC为0.1％；丁香、桂皮等其他试验植物提取物对荧光假单孢菌的MIC为0.4％或0.8％，抑菌作用较小。对肠炎沙门氏菌，各单一植物提取物都显示出了较小抑菌作用，八角和甘草的MIC为0.4％，其他植物提取物的MIC均为0.8％。牛至对变形杆菌有较强的抑菌作用，MIC为0.05％；迷迭香次之，MIC为0.2％；而丁香和八角对变形杆菌的抑菌作用较小，MIC为0.8％；其他的植物提取物对变形杆菌的MIC均为0.4％。对单增李斯特菌，除桂皮以外均显示出了较强的抑菌作用，其中牛至的抑菌作用最强，MIC为0.0125％；丁香、鼠尾草、百里香、八角、甘草同样有较强的抑菌作用，MIC仅为0.05％。对大肠杆菌，各试验植物的抑菌作用较小，MIC为0.4％或0.8％。对金黄色葡萄球菌，牛至有较强的抑菌作用，MIC为0.025％，其次为鼠尾草和迷迭香，MIC为0.1％。
表5各单一植物提取物对试验菌的最小抑菌浓度(MIC，％)
从表6可以看出，各单一植物提取物对于供试菌种都有不同程度的杀菌作用。牛至对荧光假单孢杀菌作用最强，其MBC为0.05％；其次为迷迭香，MBC为0.1％。对肠炎沙门氏菌，各单一植物提取物的抑菌作用较小，MBC均为0.8％。对变形杆菌，牛至有较强的杀菌作用，MBC为0.05％；迷迭香次之，MIC为0.2％；其他植物的杀菌作用较小。对单增李斯特菌，牛至的杀菌作用最强，其MBC为0.05％；其次为迷迭香和甘草，MBC为0.2％。对大肠杆菌，各试验植物的杀菌作用较小，其MBC均为0.8％。对金黄色葡萄球菌，牛至有较强的杀菌作用，MBC为0.025％，其次为迷迭香，MBC为0.1％。
表6各单一植物提取物对试验菌的最小杀菌浓度(MBC、％)
对比实施例1和实施例2可以看出，单一植物提取物虽然具有一定的抗菌效果，但抗菌效果一般，且实际使用时所需的浓度较大，而根据实施例1提供的复合植物提取物，通过丁香、迷迭香、甘草、牛至的协同作用，能够在较小的浓度的下即表现出较强的抗菌效果，四者显示了良好的协同效果。本发明的复合植物提取物的有效成分均来源于天然植物的提取物，包括丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物，实际测试结果表明，该复合植物提取物对食源性致病菌具有有效的抑菌和杀菌效果；而且，该复合植物提取物来源于天然植物，对人体不产生的危害，具有安全、高效的抗菌效果，本发明可应用于食品保鲜，以及食品设备，环境，该复合植物提取物能够取代传统的化学保鲜剂，对减少化学残留、保护环境、保证人体健康、延长蔬菜的贮藏期限等都具有重要的现实意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种复合植物提取物，其特征在于，包括：丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物。
2.根据权利要求1所述的复合植物提取物，其特征在于，所述甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度比为(1～3)：(1～4)：(1～3)：(1～3)。
3.根据权利要求2所述的复合植物提取物，其特征在于，所述甘草提取物、牛至提取物、丁香提取物、迷迭香提取物的质量浓度比为2：4：2：1。
4.权利要求1所述的复合植物提取物的制备方法，其特征在于，将丁香、迷迭香、甘草、牛至分别粉碎后，分别用无水乙醇浸泡提取，浸泡振荡，过滤得滤液，以得到丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物，再将丁香提取物、迷迭香提取物、甘草提取物、牛至提取物混合。
5.根据权利要求4所述的复合植物提取物的制备方法，其特征在于，所述无水乙醇的浓度为99.5％。
6.根据权利要求4所述的复合植物提取物的制备方法，其特征在于，用无水乙醇浸泡提取各植物时，各植物的质量与乙醇的体积之比均为1∶9。
7.根据权利要求4所述的复合植物提取物的制备方法，其特征在于，浸泡振荡的时间为40～52h。
8.根据权利要求7所述的复合植物提取物的制备方法，其特征在于，在130～170rpm/min的条件下，浸泡振荡48h。
9.权利要求1所述的复合植物提取物在抗食源性致病菌中的应用。
10.根据权利要求1所述的复合植物提取物在抗食源性致病菌中的应用，其特征在于，所述食源性致病菌包括荧光假单胞菌，肠炎沙门氏菌，变形杆菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌。
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