CN109797109A - 一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物病原真菌筛选分离领域，具体涉及一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基及其应用。所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基包含基础培养基和终浓度为50～100mg/L的硫酸链霉素、终浓度为3.125～12.5mg/L的代森锰锌、终浓度为0.5～2.5mg/L的多菌灵；其中，基础培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基。该牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基用于对牡丹腔孢叶斑病病株进行病原菌分离，具有操作简单，省时省力，可以在非无菌条件下进行，对试验人员的要求不高等特点。

Description

一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基及其应用

技术领域

本发明属于植物病原真菌筛选分离领域，具体涉及一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基及其应用。

背景技术

在进行病原真菌的研究工作中，常常需要病原真菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，需从受病组织或其他基物中将病原菌单独分离出来。植物病原真菌的分离在植物病理学科研工作中具有十分重要的位置。

近年来，在牡丹栽培管理过程中，由于对土壤和苗木消毒不严、栽培方法不当、管理不善以及气候等因素，真菌病害的危害有逐年加重的趋势，且出现了几种新病害，腔孢叶斑病则是其中危害最为严重的病害之一。目前，腔孢叶斑病在河南洛阳、郑州，山东菏泽、济南、泰安等地的牡丹种植园中发生普遍，叶片发病率在20～48％，危害日益加重。腔孢叶斑病除危害牡丹叶片外，也危害枝干：叶片上病斑黄褐色，圆形至长圆形，直径10～35mm，具褐色至黄褐色相间的同心轮纹，于其上形成橘黄色至橘红色子实体；在病枝上形成边缘褐色、中部灰白色的病斑，病斑绕茎可致枝条干枯，于病部形成稀疏的黑色扁平状子实体。腔孢叶斑病田间主要发生在7、8月份，故对当年牡丹的观赏价值影响较小；但感染叶斑病后，牡丹叶片光合作用及营养物质合成等生理功能受到破坏，导致根养分贮藏减少，对当年的花芽长势及来年的开花品质产生严重影响。腔孢叶斑病已成为牡丹生产上的巨大障碍，对该病害的研究迫在眉睫。从发病部位分离病菌并获得纯培养，是以后的病菌种类确认、抗病性品种鉴定及药剂筛选等工作的基础，因此牡丹腔孢叶斑病菌的分离对其后续的病理学研究非常关键。

植物病原真菌的分离包括组织分离法和稀释分离法。对于牡丹腔孢叶斑病菌，通常情况下采用组织分离法进行。牡丹腔孢叶斑病菌组织分离法的步骤包括：病健(病叶或病枝)交界处切下大小4～5mm的组织块，用75％酒精消毒20s左右，再用3％的NaClO溶液消毒3min，最后用无菌水漂洗3次，滤纸吸干水后转入含有乳酸的PSA培养基上，每皿4～5块，26℃倒置培养5天，待病组织小块上长出同心轮纹无杂菌的牡丹腔孢叶斑病菌菌落时，用接种针挑取菌落边缘小块至斜面培养基上，培养3～4天，得到牡丹腔孢叶斑病菌的纯菌种，便可置于冰箱中保存。组织分离法在样品较少时应用很好，但如果要进行牡丹腔孢叶斑病大量病株的分离，则凸显许多问题：

(1)由于一个样品处理下来要经过叶片分段再切块、多次消毒、清水冲洗及滤纸吸干等四步，样品处理较为麻烦，费力；

(2)所需试剂、耗材较多，在消毒、清洗过程中需要六个培养皿，如果病株较多，则需的培养皿数更多，而且要购买更多的酒精及NaClO，故成本较高，如果用升汞，还易污染环境，对操作人员也不安全；

(3)由于操作过程繁琐，非常费时，一般每个病株需要处理10～15min才能将分离材料进行培养；

(4)对试验操作要求严格，分离材料尽量是新鲜的，消毒时间不易把握，不可过长或过短，过长病菌菌丝易被杀死，而过短消毒不彻底易滋生杂菌；

(5)分离过程中易受到杂菌污染。由于腔孢叶斑发生在7、8月份，此时雨水较多，空气湿度大，非常利用真菌的生长、繁殖，此时进行病菌分离，极易受到青霉、曲霉和链格孢三种杂菌的污染；

(6)无菌操作要求严格：组织分离法要求必须将试验材料带回实验室，在超净工作台上进行分离，对于野外调查，根本无法进行。而进行非本地的野外调查，很有必要对试材进行及时处理，因为病组织标本新鲜，分离成功率高。很显然，组织分离法无法满足此要求。

由于采用组织分离法分离腔孢叶斑病菌时存在着费时、费力、成本高、操作要求高、易受杂菌污染且无法在自然条件下进行等缺点，故有必要进行牡丹腔孢叶斑病菌简易、快速且可以在非无菌条件下进行的分离方法研究。

植物病原菌分离培养试验中，分离失败的原因除了试材选择不合理、消毒时间过长、消毒物质浓度过高外，一个最重要的原因就是杂菌污染。牡丹腔孢叶斑病菌分离时出现的污染杂菌包括细菌和真菌。对于污染细菌，通过在培养基中添加抗生素，可以较容易地抑制；由于腔孢叶斑病菌属于真菌，故不易筛选对污染真菌有专化性作用而对腔孢叶斑病菌作用较小的抑菌物质。青霉、曲霉为营腐生真菌，链格孢为弱寄生真菌，三者在自然界分布广泛，是进行牡丹腔孢叶斑病菌分离时最常见的污染真菌。

不同真菌对同一种药剂的敏感性不同，利用真菌对药剂药敏性的差异，向培养基中添加对腔孢叶斑病菌抑制作用较弱，而对青霉、曲霉、链格孢抑制作用较强的化学药剂，从而使腔孢叶斑病菌生长而环境中的杂菌不生长或生长减慢，这样不但可以提高分离成功率，而且可以简化操作步骤，省去繁琐的消毒-清洗步骤，大大节约操作时间；且开发的分离筛选培养基，可以在田间调查时直接在自然条件下进行病原菌的分离，而无需带回实验室在超净工作台上进行。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基。

本发明的另一目的在于提供上述牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种分离筛选牡丹腔孢叶斑病菌的方法，该方法简易、快速、易分离、成本低，省时省力。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基，包含基础培养基和终浓度为50～100mg/L的硫酸链霉素、终浓度为3.125～12.5mg/L的代森锰锌、终浓度为0.5～2.5mg/L的多菌灵；其中，基础培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基；

所述的硫酸链霉素的终浓度优选为100mg/L；

所述的代森锰锌的终浓度优选为12.5mg/L；

所述的多菌灵的终浓度优选为0.5mg/L；

所述的马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基优选包含如下组分：

马铃薯 200g/L；

蔗糖 20g/L；

琼脂 16～17g/L；

所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基的制备方法，包含如下步骤：

将牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基的各组分混合均匀，得到牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基；

所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基在牡丹腔孢叶斑病菌筛选、分离、培养和保存中的应用；

一种筛选分离牡丹腔孢叶斑病菌的方法，包含如下步骤：

(1)将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织转入上述牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基中，25～26℃倒置培养5天，镜检鉴定判断菌落种类；

(2)取牡丹腔孢叶斑病菌菌落边缘处菌丝接种至马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基中，25～26℃黑暗培养5天，得到牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物；

步骤(1)中所述的具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织优选通过如下方法制备得到：

选取牡丹腔孢叶斑病发病的牡丹植株，保留叶片上的同心轮纹病斑，或者剪取枝干上的病健交界部位；在发病组织的病健交界处切下大小(2～5mm)×(2～5mm)的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；

步骤(1)中所述的具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织优选进行如下预处理：清洗干燥；

步骤(1)中所述的清洗优选采用无菌水清洗；

步骤(1)中所述的干燥优选采用滤纸吸干残余水分；

步骤(2)中所述的牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物可进一步转接至马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基中，25～26℃生化培养箱黑暗培养2～4天，然后进行菌株保存；

本发明开发了一种可以在非无菌条件下使用的牡丹腔孢叶斑病菌分离的分离筛选培养基，即通过向培养基中添加抑制细菌和污染真菌(青霉、曲霉、链格孢等)的化学药剂，利用化学药剂对污染菌有抑制作用而对叶斑病菌抑制较弱的特点，使得在牡丹腔孢叶斑病菌分离时可以在非无菌条件下只需对试材进行简单处理后，直接转至分离筛选培养基上生长，而不需要无菌操作条件下繁琐的消毒-清洗步骤，达到提高分离成功率、优化操作步骤的目的。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基及筛选分离方法用于对牡丹腔孢叶斑病病株进行病原菌分离，具有操作简单，省时省力，可以在非无菌条件下进行，对试验人员的要求不高等特点，具体表现为：

(1)省力：仅需对发病叶片进行简单切块，即可转入分离筛选培养基中，无需升汞溶液或次氯酸钠消毒、多次无菌水清洗等步骤，操作简单。

(2)省时：采用组织分离法进行牡丹腔孢叶斑病菌分离时，一般每个病株的操作过程需要10～15min，而本发明则可在1min内完成1个病株的分离步骤，操作迅速。

(3)经济：组织分离法同一叶片上切下的几个组织小块用酒精及NaClO消毒时各需一副培养皿，三次无菌水清洗时又需要三副培养皿，每次消毒及清洗培养皿均需更换一次，1个病株需要5副培养皿才可以分离完毕；而本发明分离时用1个培养皿即可，操作中无需升汞或NaClO等化学试剂，所需耗材及试剂很少，节约了试验成本。

(4)本发明易得到牡丹腔孢叶斑病菌的纯菌种：组织分离法分离病原菌时，常出现青霉、曲霉和链格孢等杂菌，在菌株的纯化保存过程中易有杂菌污染，需多次纯化才能获得纯菌株。而分离筛选培养基法则不会出现杂菌污染，无需多次纯化，省时省力。

(5)可以在非无菌条件下进行：在田间进行牡丹病害调查时，采到腔孢叶斑病标本后，用剪刀进行简单处理，可在自然条件下直接转入事先制备好的分离筛选培养基中，无需带回实验室在超净工作台上进行分离；

(6)适用于大量病株分离：本发明提供的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基及筛选分离方法简易、快速、易分离、成本低，省时省力，所需分离的病株数量越多，使用分离筛选培养基培养基进行分离的优势越大。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中菌株信息如下：

牡丹腔孢叶斑菌株已在参考文献[徐建强，杨改凤，田娟，刁兴旺.三类杀菌剂对牡丹腔孢叶斑病菌生长和发育的影响.植物保护,2016,42(5):86-91.]中公开，2015年采用组织分离法自洛阳牡丹广场的染病牡丹叶片上，纯化后添加甘油，-20℃冰箱中长期保存；

草酸青霉(Penicillium oxalicum)，保藏编号：CGMCC No.3.15665，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；

黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏编号：CGMCC No.3.15663，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；

细极链格孢(Alternaria tenuissima)，保藏编号：CGMCC No.3.15531，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买；

实施例1

(1)不同抑菌物质对腔孢叶斑、青霉、曲霉、链格孢的抑制情况

牡丹腔孢叶斑病菌分离时会受到细菌以及青霉、曲霉和链格孢三种真菌的污染。向PSA培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂16g，蒸馏水定容至1000mL；然后121℃灭菌20min)中添加硫酸链霉素、代森锰锌和多菌灵三种抑菌物质，可以很好的抑制腔孢叶斑病菌分离时的杂菌。其中硫酸链霉素可以抑制细菌滋生；代森锰锌是一种优良的保护性杀菌剂，对多种卵菌、子囊菌、半知菌和担子菌均有良好的抑制效果；多菌灵是一种内吸性杀菌剂，对子囊菌和半知菌多种真菌有效。在研究三种抑菌物质不同浓度对腔孢叶斑和青霉、曲霉和链格孢四种真菌抑制效果差异的基础上，确定三种抑菌物质在筛选分离培养基上的适宜浓度：选择对腔孢叶斑病菌抑制作用较弱、而对三种杂菌抑制作用较强的浓度。

采用菌丝生长速率法，将腔孢叶斑病菌、草酸青霉、黑曲霉和细极链格孢四种菌在PSA平板上25℃培养3～5d后，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼，菌丝面朝下分别接入含5、10、25、50、75、100mg/L的硫酸链霉素的PSA平板上，含3.125、4.625、6.25、12.5、25、50mg/L的代森锰锌的PSA培养基上，含0.5、1、1.25、1.5、2、2.5mg/L的多菌灵的PSA平板上，每皿接种1个菌饼，每处理重复3次，以不含药剂的PSA平板上接种的菌饼作对照。25℃下培养3～5d后采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，按(1)式计算各浓度处理下药剂对菌丝生长的抑制率(％)。

菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径平均值-处理菌落直径平均值)×100/(对照菌落平均值-菌饼直径)(1)

硫酸链霉素对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制效果。由表1可以得知：硫酸链霉素各浓度下对腔孢叶斑病菌的抑制率均不高，对病菌抑制作用较弱；硫酸链霉素对青霉生长有一定得促进作用；低浓度(5～10mg/L)的硫酸链霉素对曲霉的生长有较强的抑制作用，抑制率达到35％以上，而高浓度(25～100mg/L)硫酸链霉素对曲霉生长抑制作用减弱，这可能是由于曲霉对硫酸链霉素的耐药性造成。随着浓度升高，硫酸链霉素对链格孢抑制作用增强，高浓度硫酸链霉素(50～100mg/L)对链格孢的生长抑制明显。

表1硫酸链霉素对腔孢叶斑病菌、草酸青霉、黑曲霉和细极链格孢的抑制率

注：同列数据后不同字母表示在DPS 6.5软件经LSD法检验在P＜0.05水平差异显著。

代森锰锌对多种真菌均有抑制作用。代森锰锌各浓度对腔孢叶斑病菌的抑制作用均较弱，抑制率均低于20％。随着浓度升高，代森锰锌对链格孢的抑制作用增强。代森锰锌对青霉的生长抑制作用较强，12.5mg/L时即可完全抑制青霉生长；但代森锰锌对曲霉的抑制作用很弱，随着浓度升高，对曲霉生长反而表现一定的促进作用。

表2代森锰锌对腔孢叶斑病菌、草酸青霉、黑曲霉和细极链格孢的抑制率

注：同列数据后不同字母表示在DPS 6.5软件经LSD法检验在P＜0.05水平差异显著。

多菌灵对子囊菌和多种半知菌均有抑制效果。由表3可以看出：多菌灵(0.5～2.5mg/L)对叶斑的抑制作用较弱，最高仅为14.12％；低浓度多菌灵对青霉、曲霉即有强烈的抑制作用，0.5mg/L时抑制作用可达到100％；多菌灵对链格孢的抑制效果随浓度增加而增强，低浓度时(1mg/L)的抑制率即在50％以上。

表3多菌灵对腔孢叶斑病菌、草酸青霉、黑曲霉和细极链格孢的抑制率

注：同列数据后不同字母表示在DPS 6.5软件经LSD法检验在P＜0.05水平差异显著。

综合考虑三种药剂对腔孢叶斑病菌及几种杂菌的抑制率，可以看出单独添加上述药剂后，如果用于筛选分离腔孢叶斑病菌效果均不理想。

(2)三种抑菌物质的正交设计

由于抑菌物质在一起使用时会出现增效、减效作用，而且三种抑菌物质不同浓度添加到培养基时，不同配比会有不同的抑制效果，需在三种药剂适宜浓度的基础上，进行药剂间配比的正交设计试验，通过正交设计试验确定筛选培养基三种抑菌物质合适的添加量(表4)。

表4正交试验各抑菌物质的浓度设置

结合表4中确定的每种抑菌物质在筛选培养基中的使用浓度，在SPSS 20.0软件中进行正交设计，三因素三水平共9个处理L₉(3³)，如表5所示。

表5三种抑菌物质九种配比对腔孢叶斑病菌的抑制作用

按照9个处理中各抑菌物质的浓度，制备含药PSA培养基。采用菌丝生长速率法，将腔孢叶斑病菌、青霉、曲霉、链格孢在PSA平板上25℃培养5d后，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼，菌丝面朝下分别接入9种含药PSA培养基中，每皿接种1个菌饼，每处理重复3次，以不含药剂的PSA平板上接种的菌饼作对照。25℃下培养5d后采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，按(1)式计算各浓度处理下药剂对菌丝生长的抑制率(％)。

由表5可以看出，在三种抑菌物质三浓度的正交试验中，在9个处理下，腔孢叶斑病菌均可以很好的生长，菌丝生长抑制率仅在4.92～30.54％。为了研究正交试验中各浓度组合对三种杂菌的抑制率，将青霉、曲霉、链格孢三种杂菌接种到9种含药培养基上，9种处理对青霉、青霉、链格孢的抑制率均在90％以上，大部分都达到了100％，可以很好的抑制三种杂菌的生长。

综上所述，在使用PSA培养基分离牡丹腔孢叶斑病菌时，通过向培养基中添加硫酸链霉素(50～100mg/L)、代森锰锌(3.125～12.5mg/L)及多菌灵(0.5～2.5mg/L)，可很好地抑制青霉、曲霉及链格孢三种最常见的污染菌生长，而对病菌不会产生太大的抑制作用；其中，以T1为最佳的抑菌物质配比，即硫酸链霉素、代森锰锌及多菌灵的终浓度分别为100、12.5及0.5mg/L。

实施例2

(1)按照如下配方配制PSA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂16g，蒸馏水定容至1000mL；然后121℃灭菌20min；

(2)将25μL浓度为10⁵mg/L硫酸链霉素母液、15.625μL浓度为10⁴mg/L代森锰锌母液和25μL浓度为10³mg/L多菌灵母液混合，加入到50mL步骤(1)灭菌后冷却至50℃的PSA培养基中，得到牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基；

(3)选取牡丹腔孢叶斑病发病的牡丹植株，保留叶片上的同心轮纹病斑，或者剪取枝干上的病健交界部位；在发病组织的病健交界处切下大小3mm×(3mm)的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；然后将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织用无菌水清洗，滤纸吸干水后转入步骤(2)制得的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基上，每皿5块，25～26℃倒置培养5天，镜检鉴定判断菌落种类；

(4)用接种针取牡丹腔孢叶斑病菌菌落边缘处菌丝接种至马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基中，25～26℃黑暗培养5天，得到牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物；

(5)选取生长一致的菌落，镜检菌丝和孢子形态，判断病菌种类；

(6)用接种针从牡丹腔孢叶斑菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA培养基斜面上，25～26℃生化培养箱黑暗培养3天，进行菌株保存。

实施例3

(1)按照如下配方配制PSA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂16g，蒸馏水定容至1000mL；然后121℃灭菌20min；

(2)将50μL浓度为10⁵mg/L硫酸链霉素母液、31.2μL浓度为10⁴mg/L代森锰锌母液和75μL浓度为10³mg/L多菌灵母液混合，加入到50mL步骤(1)灭菌后冷却至50℃的PSA培养基中，得到牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基；

(3)选取牡丹腔孢叶斑病发病的牡丹植株，保留叶片上的同心轮纹病斑，或者剪取枝干上的病健交界部位；在发病组织的病健交界处切下大小2mm×5mm的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；然后将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织用无菌水清洗，滤纸吸干水后转入步骤(2)制得的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基上，每皿5块，25～26℃倒置培养5天，镜检鉴定判断菌落种类；

(4)用接种针取牡丹腔孢叶斑病菌菌落边缘处菌丝接种至铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基中，25～26℃黑暗培养5天，得到牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物；

(5)选取生长一致的菌落，镜检菌丝和孢子形态，判断病菌种类；

(6)用接种针从牡丹腔孢叶斑菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA培养基斜面上，25～26℃生化培养箱黑暗培养3天，进行菌株保存。

实施例4

(1)按照如下配方配制PSA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂16g，蒸馏水定容至1000mL；然后121℃灭菌20min；

(2)将50μL浓度为10⁵mg/L硫酸链霉素母液、62.4μL浓度为10⁴mg/L代森锰锌母液和25μL浓度为10³mg/L多菌灵母液混合，加入到50mL步骤(1)灭菌后冷却至50℃的PSA培养基中，得到牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基；

(3)选取牡丹腔孢叶斑病发病的牡丹植株，保留叶片上的同心轮纹病斑，或者剪取枝干上的病健交界部位；在发病组织的病健交界处切下大小4mm×3mm的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；然后将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织用无菌水清洗，滤纸吸干水后转入步骤(2)制得的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基上，每皿5块，25～26℃倒置培养5天，镜检鉴定判断菌落种类；

(4)用接种针取牡丹腔孢叶斑病菌菌落边缘处菌丝接种至铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基中，25～26℃黑暗培养5天，得到牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物；

(5)选取生长一致的菌落，镜检菌丝和孢子形态，判断病菌种类；

(6)用接种针从牡丹腔孢叶斑菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA培养基斜面上，25～26℃生化培养箱黑暗培养3天，进行菌株保存。

实施例5

(1)按照如下配方配制PSA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂16g，蒸馏水定容至1000mL；然后121℃灭菌20min；

(2)将37.5μL浓度为10⁵mg/L硫酸链霉素母液、62.4μL浓度为10⁴mg/L代森锰锌母液和125μL浓度为10³mg/L多菌灵母液混合，加入到50mL步骤(1)灭菌后冷却至50℃的PSA培养基中，得到牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基；

(3)选取牡丹腔孢叶斑病发病的牡丹植株，保留叶片上的同心轮纹病斑，或者剪取枝干上的病健交界部位；在发病组织的病健交界处切下大小3mm×5mm的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；然后将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织用无菌水清洗，滤纸吸干水后转入步骤(2)制得的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基上，每皿5块，25～26℃倒置培养5天，镜检鉴定判断菌落种类；

(4)用接种针取牡丹腔孢叶斑病菌菌落边缘处菌丝接种至铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基中，25～26℃黑暗培养5天，得到牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物；

(5)选取生长一致的菌落，镜检菌丝和孢子形态，判断病菌种类；

(6)用接种针从牡丹腔孢叶斑菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA培养基斜面上，25～26℃生化培养箱黑暗培养3天，进行菌株保存。

应用实施例

2018年9月从河南省洛阳市牡丹广场、王城公园、隋唐城遗址植物园、国家牡丹园、国际牡丹园等地采集牡丹腔孢叶斑病标本120余株，从中选取症状典型的的标本100株，其中50株带回实验室采用组织分离法分离；另外50株直接在室外自然条件下(非无菌)采用实施例3制得的分离筛选培养基进行分离筛选。

采用组织分离法分离时，在发病组织的病健交界处切下大小3mm×3mm的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；然后将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织用无菌水清洗，滤纸吸干水后，依次用用体积分数为75％的酒精消毒15s、有效氯浓度为2～3％的NaClO消毒3min，然后在无菌水中冲洗三遍，无菌滤纸吸干水后放于含乳酸的PSA(每200mL马铃薯蔗糖培养基加入1mL体积分数为25％的乳酸溶液)上培养，5d后观察，挑取生长一致的菌落镜检后保存。由于此法要经过叶片切块、多次消毒、清水冲洗及滤纸吸干等步骤，一个病株处理完毕约需10～15min，病株多时相当费力；且两次消毒及三次清洗时需要的培养皿较多(约200副)，培养时每个病株又需要1个培养皿，所需耗材很多；操作过程中如酒精及NaClO消毒时间把握不准，易将病菌也杀死，故对操作要求高；50个病株分离了14天的时间才完成，共分离到牡丹腔孢叶斑病菌36株，成功率为72％；但其中的20株的PSA平板上，均受到青霉、曲霉或链格孢的污染，给后续的纯培养物的获得带来麻烦。

采用分离筛选培养基法分离时，在发病组织的病健交界处切下大小3mm×3mm的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织；然后将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织直接在室外条件下放入分离筛选培养基(实施例4)中，带回实验室后将含药PSA平板放于25℃培养箱培养5d，待病组织长出菌丝后，直接将菌丝转入新鲜的PSA上，培养出纯菌落后转接保存(具体方法见实施例4)。采用分离筛选培养基法，在实验室制备好含药PSA平板后，带到室外(牡丹园)，可直接进行病菌分离；1min即可处理一个样本，3～5d即可获得叶斑病菌的纯培养物，操作时间大大缩短，操作步骤大大简化。经过5d的时间50株牡丹腔孢叶斑病病株全部分离完毕，共得到牡丹腔孢叶斑病菌40株；且40株病菌均未受到杂菌污染，可直接转入斜面中保存。

表6为本试验两种方法的比较。

表6组织分离法同分离筛选培养基法的比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基，其特征在于包含基础培养基和终浓度为50～100mg/L的硫酸链霉素、终浓度为3.125～12.5mg/L的代森锰锌、终浓度为0.5～2.5mg/L的多菌灵；其中，基础培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基。

2.根据权利要求1所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基，其特征在于：

所述的硫酸链霉素的终浓度为100mg/L。

3.根据权利要求1所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基，其特征在于：

所述的代森锰锌的终浓度为12.5mg/L。

4.根据权利要求1所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基，其特征在于：

所述的多菌灵的终浓度为0.5mg/L。

5.根据权利要求1所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基，其特征在于：

所述的马铃薯蔗糖琼脂培养基包含如下组分：

马铃薯 200g/L；

蔗糖 20g/L；

琼脂 16～17g/L。

6.权利要求1～5任一项所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

将牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基的各组分混合均匀，得到牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基。

7.权利要求1～5任一项所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基在牡丹腔孢叶斑病菌筛选、分离、培养和保存中的应用。

8.一种筛选分离牡丹腔孢叶斑病菌的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)将具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织转入权利要求1～5任一项所述的牡丹腔孢叶斑病菌分离筛选培养基中，25～26℃倒置培养5天，镜检鉴定判断菌落种类；

(2)取牡丹腔孢叶斑病菌菌落边缘处菌丝接种至马铃薯蔗糖琼脂培养基中，25～26℃黑暗培养5天，得到牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物。

9.根据权利要求8所述的筛选分离牡丹腔孢叶斑病菌的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织优选通过如下方法制备得到：

选取牡丹腔孢叶斑病发病的牡丹植株，保留叶片上的同心轮纹病斑，或者剪取枝干上的病健交界部位；在发病组织的病健交界处切下大小(2～5mm)×(2～5mm)的组织块，得到具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织。

10.根据权利要求8所述的筛选分离牡丹腔孢叶斑病菌的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的具有同心轮纹病斑的牡丹腔孢叶斑病发病组织优选进行如下预处理：清洗干燥；

步骤(2)中所述的牡丹腔孢叶斑病菌纯培养物可进一步转接至马铃薯蔗糖琼脂培养基中，25～26℃生化培养箱黑暗培养2～4天，然后进行菌株保存。