CN109796511A

CN109796511A - 一种新的环烯醚萜类化合物及其制备方法和医药用途

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Publication number: CN109796511A
Application number: CN201910162386.9A
Authority: CN
Inventors: 王芳; 江志波; 张岱州; 梁大连; 袁振海; 李敏
Original assignee: Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Priority date: 2019-03-05
Filing date: 2019-03-05
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2039-03-05
Also published as: CN109796511B

Abstract

本发明涉及一个新的环烯醚萜类化合物的结构、制备方法和在抗炎领域的应用。本发明从铁角蕨科植物过山蕨(Camptosorus sibiricus Rupr.)的地上部分提取、分离和纯化，得到了一个新化合物，命名为camptoside。药效学实验表明，camptoside对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO的释放具有较强的抑制作用，提示该化合物可能具有一定的抗炎作用。

Description

一种新的环烯醚萜类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于医药技术领域。具体涉及过山蕨中的一个新结构的环烯醚萜类成分制备方法和医药用途。

背景技术

过山蕨又名过桥草、马蹬草、还阳草，为铁角蕨科植物过山蕨(Camptosorussibiricus Rupr.)的地上部分。主产于东北、华北、西北、内蒙古等地。用于脱疽，神经性皮炎，脑血管栓塞引起的偏瘫，子宫出血，外伤出血以及下肢溃疡。民间使用全草泡茶饮用对血栓闭塞性脉管炎有良好疗效，以香油敷于恶疮、脉管炎等破溃处具有促进伤口愈合的作用。

过山蕨化学成分的研究始于20世纪70年代，以醇提取物为主，并且从中已分离鉴定了包括环阿尔廷型三萜苷、山奈酚型黄酮苷、酚酸、有机酸和脂肪醇苷等不同结构类型的五十余个化合物，其中过山蕨总黄酮和酚酸类化合物被认为是其治疗血栓闭塞性脉管炎的主要活性成分。本课题组前期承担的国家重大新药创制项目“过山蕨及其制剂的开发”以血栓闭塞性脉管炎为适应症，对过山蕨醇提物进行了系统地研究，发现了过山蕨中对大鼠血栓闭塞性脉管炎具有改善作用的有效部位，并进行了初步药学研究。根据民间过山蕨泡茶饮对血栓闭塞性脉管炎有良好疗效提示对过山蕨全草水提物化学成分研究的必要性，本课题组启动了过山蕨水提物的研究，从中首次发现了苯乙醇苷等系列已知化合物。但是，过山蕨的水提取物中山奈酚型黄酮类成分含量有限，且在水中的溶解性也较低，与前期认为其治疗血栓闭塞性脉管炎的主要活性成分位总黄酮和酚酸类成分不相符。因此，为了较全面和系统的研究过山蕨对血栓闭塞性脉管炎这一疑难杂症药效成分，本课题组对过山蕨地上部分的乙醇提取提取物进行了系统化学成分研究，特别是低含量和微量化学成分的分离和鉴定，得到了1个新结构的环烯醚萜类化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一个新结构环烯醚萜类化合物及其制备方法和医药用途。

本发明提供了一个新的环烯醚萜类化合物命名为camptoside，结构特征在于由环烯醚萜苷的C-6通过碳碳键与对羟基苯乙烯基相连，其具有如下结构。

本发明还提供了所述新结构环烯醚萜类化合物camptoside的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)过山蕨的地上部分用体积为30％～95％的乙醇提取，减压蒸馏回收提取液得粗提物；

(2)上述步骤(1)所得粗提物经水分散后，醋酸乙酯萃取，得到醋酸乙酯和水相两部位成分；

(3)上述步骤(2)所得水相部位经大孔吸附树脂色谱分离，以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，得到不同极性部位的乙醇或甲醇洗脱物；

(4)上述步骤(3)所得乙醇或甲醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离，以乙酸乙酯/甲醇，二氯甲烷/甲醇混合溶剂梯度洗脱，获得不同流分；

(5)上述步骤(4)所得流分经凝胶柱色谱法分离，以甲醇，二氯甲烷/甲醇混合溶剂等度洗脱；

(6)上述步骤(5)所得流分经反相中压柱层析分离，以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并部分洗脱部位，减压浓缩，得浓缩物备用；

(7)上述步骤(6)所得浓缩物经制备薄层色谱，以乙酸乙酯/乙醇/醋酸混合溶剂展开，收集含主斑点硅胶，以甲醇或乙醇洗脱，得到目标化合物的粗品；

(8)上述步骤(7)中所得粗品经高效液相色谱法纯化，以乙腈-水混合溶剂为流动相，得到camptoside。

本发明提供的所述新结构环烯醚萜苷camptoside的制备方法，所述植物为铁角蕨科植物过山蕨(Camptosorussibiricus Rupr.)的地上部位。

本发明提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为加热回流或超声提取1～3次。所用溶剂为：30％～95％乙醇，优选，所用溶剂是体积为30％～95％乙醇，所述过山蕨的质量与溶剂的体积的比例为1:5～1:20。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(2)中所述的萃取1～5次，所述醋酸乙酯相提取物与溶剂的体积的比例为1:3～1:10，优选比例为1:3～1:5。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(3)中所述乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂，混合溶剂的体积比例为0:100～95:0，优选水、30％、50％和95％的甲醇-水或乙醇-水的混合溶剂。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(4)中所述乙酸乙酯/甲醇混合溶剂的体积比例为100:0～0:100，优选比例为80:1～10:1，二氯甲烷/甲醇体积比例为100:0～0:100，优选40:1～4:1。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(5)中所述二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1～1:5，优选1:1～1:2。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(6)中所述乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂，混合溶剂的体积比例为0:100～100:0，优选5:95～100:0。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(7)中所述乙酸乙酯/乙醇/醋酸混合溶剂的体积比例为10:1:1～30:1:1，优选10:1:1～20:1:1。

本发明所提供的所述新化合物camptoside的制备方法，步骤(8)中所述流动乙腈/水混合溶剂的体积比例为15:85～90:10，优选20:80～40:60。

本发明对新化合物camptoside体外抗炎活性进行了初步测试和评价，所选模型为脂多糖诱导RAW 264.7巨噬细胞NO的释放抑制。因此，本发明中制备的新化合物camptoside可在开发抗炎药物方面应用。

本发明首次提供了以过山蕨全草为原料，富集、制备、鉴定新化合物camptoside的方法，并且评价抗炎活性，阐述了其在开发抗炎药物中的应用。

附图说明

图1本发明camptoside的IR谱；

图2本发明camptoside的(+)ESIMS谱；

图3本发明camptoside的HRESIMS谱；

图4本发明camptoside的¹H-NMR谱；

图5本发明camptoside的¹³C-NMR谱；

图6本发明camptoside的DEPT谱；

图7本发明camptoside的¹H-¹H COSY谱；

图8本发明camptoside的HSQC谱；

图9本发明camptoside的HMBC谱；

图10本发明camptoside的NOESY谱；

图11本发明camptoside的结构式。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此限制本发明。

实施例1：

(1)过山蕨干燥全草17.4kg，用95％乙醇加热回流提取3次(用量为11L)，减压回收提取液的粗提物；

(2)步骤(1)所得95％乙醇粗提物水分散经醋酸乙酯萃取3次(用量为3L)，减压回收萃取液得醋酸乙酯相和水相粗提物；

(3)步骤(2)所得水相提取物经大孔树脂吸附，用水、30％、50％和95％乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；

(4)步骤(3)中所得的50％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱进行分离，经二氯甲烷/甲醇100:0，100:1，100:2，100:5，100:8，100:10，4:1，2:1，1:1，0:100混合溶剂梯度洗脱；

(5)步骤(4)二氯甲烷/甲醇100:8流分，经凝胶柱色谱进行分离，经二氯甲烷/甲醇1:1，混合溶剂进行梯度洗脱；

(6)步骤(5)所得物再经反相中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(5/95～100/0，v/v)梯度洗脱(流速为3.0ml/min，温度为室温)，得到10个部位(即梯度洗脱得10个瓶，每瓶100mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并6～7个部位，60℃以下减压浓缩至干，备用。

(7)将步骤(6)所得物经制备薄层色谱分离，用乙酸乙酯/乙醇/醋酸混合溶剂(15/1/1，v/v/v)展开，刮下主斑点，甲醇洗脱。

(8)将步骤(7)所得物进行高效液相分离，210nm检测，流速为，流速为1mL/min，流动相为乙腈:水＝25:75，得到camptoside(t_R＝50.95min)。

根据camptoside的理化性质和波谱数据鉴定了其结构(核磁谱图和高分辨质谱谱图见附图1-5)。

camptoside的理化数据如下：

黄色胶状物；[α]_D ²⁰+50.5(c 0.18,MeOH)；IR(KBr)ν_max 3340,2920,1691,1629,1611,1514,1440,1376,1288,1160,1077,1047,888,841,806,768cm^-1；(+)-ESIMS m/z 524[M+NH₄]⁺；(+)-HRESIMS m/z 529.1658[M+Na]⁺(calcd for C₂₅H₃₀O₁₁Na,529.1680).¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。

camptoside的NMR数据归属见表1

表1 camptoside的NMR数据^a

^a NMR data(δ)were measured in CD₃OD at 600MHz for ¹H and 150MHz for¹³C.Proton coupling constants(J)in Hz are given in parentheses.^b Signals inthis region were overlapped.ND means the signal was not detected.

实施例2：

(1)过山蕨干燥全草34.8kg，用70％乙醇加热回流提取3次(用量为11L)，减压回收提取液的粗提物；

(2)步骤(1)所得70％乙醇粗提物水分散经醋酸乙酯萃取3次(用量为3L)，减压回收萃取液得醋酸乙酯相和水相粗提物；

(3)步骤(2)所得水相提取物经大孔树脂吸附，用水、20％、40％和95％乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；

(4)步骤(3)中所得的40％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱进行分离，经乙酸乙酯/甲醇100:0，100:1，100:2，100:5，100:8，100:10，4:1，2:1，1:1，0:100混合溶剂梯度洗脱；

(5)步骤(4)乙酸乙酯/甲醇100:8流分，经凝胶柱色谱进行分离，经二氯甲烷/甲醇1:1，混合溶剂进行梯度洗脱；

(6)步骤(5)所得物再经反相中压柱层析分离，其中填料粒度为20～60μm，用甲醇-水(5/95～100/0，v/v)梯度洗脱(流速为3.0ml/min，温度为室温)，得到10个部位(即梯度洗脱得10个瓶，每瓶100mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并6～7个部位，60℃以下减压浓缩至干，备用。

实施例3：体外抑制NO释放实验结果：

RAW264.7细胞(购自青岛浩赛科技股份有限公司)，调整细胞浓度到1.0×10⁴/mL，以每孔200μL加入于96孔培养板中，5％CO₂，37℃，培养2小时。加入LPS(1.0μg/mL)2μL，样品DMSO溶液0.4μL，溶解样品的DMSO相对于培养基的含量为0.2％。培养24小时。随后取上清液100μL，加入事先调好的Griess试药，用酶联免疫检测仪在570nm(对照655nm)测定吸光度；采用MTT法测定了细胞活力。由于文献报道curcumin有较好的NO产生抑制活性，因此选择curcumin为阳性对照药，结果见表2。

表2化合物camptoside体外抑制NO释放作用

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围。

Claims

1.新结构环烯醚萜类化合物camptoside，其特征在于：具有如下结构：

2.一种权利要求1所述camptoside的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)过山蕨的地上全草用体积为30％～95％的乙醇提取，回收提取液得粗提物；

(2)上述步骤(1)所得粗提物经水分散醋酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到醋酸乙酯和水相提取物；

(3)上述步骤(2)所得水相提取物经大孔吸附树脂色谱分离，以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，得到不同极性部位的乙醇或甲醇洗脱物；

(4)上述步骤(3)所得乙醇或甲醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离，以乙酸乙酯/甲醇，二氯甲烷/甲醇混合溶剂梯度洗脱；

(6)上述步骤(5)所得流分经反相中压柱层析分离，以不同体积比例的乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并部分洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物备用；

(7)上述步骤(6)所得流分经制备薄层色谱，以乙酸乙酯/乙醇/醋酸混合溶剂洗脱；

(8)上述步骤(7)中所得流分经高效液相色谱法分离，以乙腈-水混合溶剂为流动相，得到camptoside。

3.按照权利要求2所述的新的环烯醚萜类化合物camptoside制备方法，其特征在于：所述植物来源为铁角蕨科植物过山蕨(Camptosorussibiricus Rupr.)的地上部位。

4.按照权利要求2所述的新的环烯醚萜类化合物camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或超声提取1～3次，所用溶剂是体积为30％～95％乙醇，所述过山蕨的质量与溶剂的体积的比例为1:5～1:20。

5.按照权利要求2所述的camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的萃取1～5次，所述水相提取物与溶剂的体积的比例为1:3～1:10。

6.按照权利2所述的camptoside的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的乙醇-水以及甲醇-水的混合溶剂的体积比例为0:100～95:0。

7.按照权利2所述的camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述洗脱溶剂乙酸乙酯/甲醇，二氯甲烷/甲醇体积比例为100:0～0:100。

8.按照权利2所述的camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1～1:5。

9.按照权利2所述的camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(6)中所述乙醇-水以及甲醇-水的混合溶剂的体积比例为0:100～100:0。

10.按照权利2所述的camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(7)中所述乙酸乙酯/乙醇/醋酸混合溶剂的体积比例为10:1:1～30:1:1。

11.按照权利要求2所述的camptoside的制备方法，其特征在于：步骤(8)中所述乙腈-水合溶剂的体积比例为15:85～90:10。

12.权利要求1所述的camptoside在制备抗炎药物中的应用。