CN109796328A - 一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法。本发明用区域选择性脂肪酶TLIM或RMIM适度催化香榧油、乙醇酯交换反应，实现金松酸初步富集，然后尿素包合除去饱和脂肪酸与低饱和度不饱和脂肪酸后进一步纯化金松酸。本发明通过选择适宜的香榧品种、1,3‑选择性脂肪酶，优化固定化酶醇解条件及尿素包合参数，获得了高纯度的香榧金松酸分离方法。因此该富集方法具有设备简单、高效、绿色、富集纯度高等优点。

Description

一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法

(一)技术领域

本发明涉及一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法。

(二)背景技术

香榧(Torreya grandis)，为红豆杉目、红豆杉科、榧树属常绿乔木，中国原产树种，是世界上稀有的经济树种，主要生长在中国南方较为湿润的地区，如浙江、安徽南部、福建北部、江西东北部，以浙江最多。其种仁含丰富的营养成分，如脂肪、蛋白质、矿物元素、维生素、草酸和鞣质等，且香榧籽油中不饱和脂肪酸含量高达79％，亚油酸含量达30％以上，而特殊性多不饱和脂肪酸-金松酸的含量最高可达14％。由于金松酸具有预防心脑血管疾病、抗辐射、延缓衰老等多种保健功能。因此，对高纯度金松酸的需求在食用价值与科研价值上正在逐年上升。

目前，多不饱和脂肪酸富集主要有尿素包合法和分子蒸馏法、柱色谱法、超临界流体萃取法、银离子络合法、脂肪酶浓缩法等。分子蒸馏法根据被分离物质各组分的分子量不同与分子平均自由程的差别，使液体在远低于其沸点温度下进行分离，但难于将碳原子数及沸点相近的脂肪酸分开；柱色谱法与超临界流体萃取法对设备的要求苛刻，并且操作成本高，工业化生产不多；银离子络合法虽然络合率高，但银离子价格昂贵，不适合规模化生产。尿素包合法是常见的分离纯化脂肪酸的方法之一，当尿素与脂肪酸乙酯生成包合物后，包合物呈六面体结晶，脂肪族化合物被包合在框架内，由于饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸更容易与尿素形成稳定的包合物并在结晶的过程中析出，实现与多不饱和脂肪酸分离。尿素包合法因投资少、操作简单、放大方便等特点，已工业化使用。CN1696261用尿素包结法富集黑加仑籽油中多不饱和脂肪酸及其酯化物，将黑加仑籽油中的混合脂肪酸或脂肪酸酯化物，加入到溶剂体系中，同时加入尿素,经过结晶与过滤，除去尿素包合物，将溶剂相经蒸馏得到被富集多不饱和脂肪酸或脂肪酸酯化物，其含量为80％-95％，但该方法富集的是多种包括α-亚麻酸与γ-亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸并不针对性的富集单一多不饱和脂肪酸；CN105779123A用尿素包合结合低共熔溶剂法分离饱和与不饱和脂肪酸甲酯，但该法目的旨在对尿素进行解包与回收从而减轻能量消耗与生产成本，对高纯度且单一性多不饱和脂肪酸的分离效果并未提及；CN103333747A用尿素包合法从瓜蒌籽油中富集多不饱和脂肪酸，其多不饱和脂肪酸产率虽然高达40.2％以上，但仍是多种多不饱和脂肪酸混合物。酶法也常用于脂肪酸的富集制备。CN105316368A用酶法水解鱼油富集多不饱和脂肪酸，通过将反应后可溶性盐、亲水性溶剂和鱼油三相体系进行离心分离与萃取，得到富含omega-3多不饱和脂肪酸的甘油酯产物，上层油样甘油酯和脂肪酸中的EPA和DHA富集率高达120％，但该法的分离步骤较为繁琐且产物为甘油酯与脂肪酸的混合物。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种脂肪酶选择性醇解富集，然后尿素包合工艺实现香榧籽油中金松酸富集的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法，所述方法包括：

(1)香榧籽油与95％乙醇按照料液质量比1:3～5混合，加入脂肪酶TLIM或RMIM，30～50℃下进行酶促转酯化反应3～8h；

(2)按照尿素质量浓度30～40％将尿素加入乙醇中，水浴回流加热制成溶液，再按照脂肪酸乙脂、尿素质量比为0.2～0.5:1，加入步骤(1)制得的混合脂肪酸乙酯，继续加热回流2h得乙醇-尿素-香榧籽油混合乙酯混合液；

(3)将步骤(2)所得的混合液冷却至室温后静置在4～20℃条件下包合结晶6～8h，取出后迅速冷抽滤分离，并分别用尿素饱和的95％乙醇溶液及3～5％盐酸氨溶液洗涤结晶物2～3次，收集滤液；

(4)将步骤3所得滤液移入分液漏斗，加入2～3倍体积的正己烷，充分萃取，分离有机层，再以正己烷重复萃取2～3次，合并有机相，旋转蒸发除去正己烷，得黄色液体油状物，即为高纯度金松酸产品。

由于单一方法纯化多不饱和脂肪酸的效果有限，尤其尿素饱和法一次包和要得到较高的纯度需要目标脂肪酸具有一定的起始浓度，因此多种方法组合富集纯化将具有明显优势。本发明基于脂肪酸位置分布分析发现金松酸主要结合在甘油三酯骨架上1位和3位上，尤其3位上的分布特点，采用区域选择性脂肪酶水解实现金松酸初步富集，然后结合尿素包合一次去除饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸，实现金松酸的纯化。

本发明以提取的香榧籽油为原料，采用1,3-脂肪酶选择性催化3位脂肪酸醇解，得到金松酸初步富集的脂肪酸乙酯混合物，然后再用尿素包合法进一步富集金松酸，实现高纯度、规模化金松酸生产。

步骤(1)中所用脂肪酶优选为TLIM。

步骤(1)中酶促转酯化反应优选在37℃下进行，反应时间5h。

步骤(1)中香榧籽油优选为木榧籽油。

步骤(2)中尿素溶液浓度优选为40％。

步骤(2)中脂肪酸乙脂、尿素质量比优选为0.3:1。

步骤(3)中包合结晶温度优选为10℃。

从香榧籽油中富集金松酸的方法，有以下工艺步骤：

脂肪酶醇解→制备乙酯-乙醇混合液→制备尿素-乙醇溶液→混合乙酯-尿素-乙醇混合液→包合→抽滤分离→收集滤液→有机相萃取→旋转蒸发→金松酸产品

本发明的有益效果主要体现在：

(1)利用香榧籽油为原料，富集纯化金松酸。浙江香榧资源丰富，金松酸的富集纯化可以促进香榧产业的深度加工和综合利用，提高香榧的附加值。

(2)利用金松酸在甘油三酯骨架上主要分布1位和3位上的特性，科学性的选用区域选择性催化酯交换反应的脂肪酶进行初步富集并事前除去一些在后期尿素包合中不能去除的多不饱和脂肪酸。

(3)酶法不仅利用酶的特性循环使用，且减小污染，环境友好，加之与工艺简单、容易控制的尿素包合法结合运用，可操作性更高、更加经济。

(4)纯度较高，稳定性好，金松酸含量可达90％以上。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本实施例中所用脂肪酶，TLIM、RMIM购于Novozyme公司。

实施例1～4：不同品系香榧品种的选择

表1：不同品系香榧的脂肪酸组成

四个不同品种榧籽的脂肪酸组成如表1所示。显而易见，品种间脂肪酸含量有明显的差别，尤其金松酸(5,11,14-20:3)。木榧中金松酸含量最高达14.5％，是制备纯化金松酸最优良的品种。其它品种香榧的金松酸含量差别不大，在8.9～10％之间。

各品种香榧油脂甘油碳骨架上1，2，3未知脂肪酸分布情况见表2。

数据显示，不论哪个品种，多不饱和脂肪酸主要分布在sn-2位置，饱和脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸主要分布在sn-1位置。更重要的是，目标金松酸主要分布在sn-3位置。这启示可以采用1,3位专一性水解酶选择性水解香榧油，一方面可初步富集提高产物中金松酸的浓度，其次可减少后续纯化工艺中主要竞争物油酸、亚油酸浓度。

香榧油醇解解条件的优化：

在两个圆底烧瓶中各加入木榧油12g、95％(v/v)乙醇48g、RMIM或TLIM脂肪酶3g，充入氮气后，分别于30，37，50和60℃磁力搅拌水浴反应10h，并在反应开始后1、3、5、8、10h分别取样，水解结束后抽滤分离脂肪酶沉淀，用正己烷与95％乙醇清洗2～3次后得水解液。将取样得到的水解液进行薄层色谱分析，用正己烷：乙醚：甲酸＝70:30：1的展开剂将样品展开，在碘蒸气下显色后，刮下乙酯条带并用正己烷萃取，GC法对萃取液进行金松酸含量分析，如表3。

木榧油醇解结果如下表3(实施例5～12)所示：

表3：不同脂肪酶不同温度下醇解木榧油制备脂肪酸乙酯

显而易见，脂肪酶TLIM的1,3位选择性要优于RMIM，低温下醇解效率低，但醇解选择性高。但随温度增加，水解产生的sn-2偏甘酯位置异构化反应加剧，转化生成sn-1偏甘酯，然后继续被水解造成终产物中金松酸含量不高。总体来讲脂肪酶TLIM37℃，催化醇解5h，产物中金松酸质量含量较高达18.5％。

实施例13～20：尿素包合法富集木榧油脂肪酸乙酯纯化金松酸

按照乙醇：尿素不同质量比分别取乙醇和尿素，在70℃水浴中回流加热制成溶液，再按照不同乙酯/尿素比例加入香榧脂肪酸乙酯，继续加热回流2h得乙醇-尿素-香榧籽油乙酯混合液。将混合液冷却至室温后分别静置在-10℃，-4℃，0℃，10℃，20℃条件下包合6～8h，取出后迅速抽滤分离，分别用尿素饱和的95％乙醇溶液与4％(w/w)盐酸溶液洗涤结晶物2-3次，收集滤液并移入分液漏斗，按照料液：正己烷质量比＝1:2加入正己烷，充分萃取，分离有机层，再以正己烷萃取2～3次，合并有机相，通过旋转蒸发仪除去正己烷，得黄色液体油状物，即为高纯度金松酸产品，GC分析金松酸纯度。

数据显示，随包合溶液中尿素浓度的增加，金松酸纯度变化不明显，但回收率有所增加。尿素浓度为40％(w/w)时，金松酸纯度随脂脲比降低增加明显。提高金松酸起始浓度可有效改善包合效果。通过1,3-脂肪酶选择性醇解后的脂肪酸浓度预富集到18.5％，然后采用脂脲比0.3一步纯化金松酸纯度可达90％，回收率接近70％。结晶温度对产品纯度和回收率均有一定影响，尤其影响产品产率，折中考虑采用确定10℃为最优温度。

Claims (7)

1.一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法，所述方法包括：

(1)香榧籽油与95％乙醇按照料液质量比1:3～5混合，加入脂肪酶TLIM或RMIM，30～50℃下进行酶促转酯化反应3～8h；

(2)按照尿素质量浓度30～40％将尿素加入乙醇中，水浴回流加热制成溶液，再按照脂肪酸乙脂、尿素质量比为0.2～0.5:1，加入步骤(1)制得的混合脂肪酸乙酯，继续加热回流2h得乙醇-尿素-香榧籽油混合乙酯混合液；

(3)将步骤(2)所得的混合液冷却至室温后静置在4～20℃条件下包合结晶6～8h，取出后迅速冷抽滤分离，并分别用尿素饱和的95％乙醇溶液及3～5％盐酸氨溶液洗涤结晶物2～3次，收集滤液；

(4)将步骤3所得滤液移入分液漏斗，加入2～3倍体积的正己烷，充分萃取，分离有机层，再以正己烷重复萃取2～3次，合并有机相，旋转蒸发除去正己烷，得黄色液体油状物，即为高纯度金松酸产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所用脂肪酶为TLIM。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中酶促转酯化反应在37℃下进行，反应时间5h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中香榧籽油为木榧籽油。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中尿素溶液浓度为40％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中脂肪酸乙脂、尿素质量比为0.3:1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中包合结晶温度为10℃。