CN109689101B

CN109689101B - 用于治疗病症的组合物

Info

Publication number: CN109689101B
Application number: CN201780055033.8A
Authority: CN
Inventors: K·班尼斯特; U·拉什马尔; D·佩蒂特; T·圣德尔
Original assignee: Crescendo Biologics Ltd
Current assignee: Crescendo Biologics Ltd
Priority date: 2016-07-11
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2037-07-10
Also published as: CN109689101A; US10947308B2; US20210261655A1; GB201612043D0; JP7178985B2; EP3481421A1; JP2019524719A; JP2022116046A; US20190300603A1; WO2018011555A1

Abstract

本发明涉及稳定的非聚集的组合物，所述组合物包含IL‑17A结合分子，特别是单域抗体。此类组合物可用于治疗疾病(例如皮肤病或哮喘)的局部施用。

Description

用于治疗病症的组合物

发明领域

本发明涉及特别是用于局部施用的稳定的非聚集的组合物，所述组合物包含IL-17A结合分子，以及此类组合物在疾病治疗中的用途。

背景技术

银屑病是一种慢性复发和缓解型炎性皮肤病，影响世界人口的2-3％(～1.25亿患者)，该疾病导致严重的患病率和生活质量下降，这主要是由于皮肤可见区域的临床发作和破坏性损伤、全身表现以及药物相关的副作用引起的。在超过80％的患者中观察到了称为“寻常型斑块状银屑病”的该疾病的常见形式，其特征为红斑性的鳞屑状斑块(通常在肘部、膝部、头皮和臀部)，所述斑块的尺寸可以从最小至涉及整个皮肤表面范围内变化。

根据受累的体表面积(BSA)程度，可以将银屑病分为轻度(<3％BSA受累)、中度(3-10％BSA)和重度(>10％BSA)疾病。诸如糖皮质激素、维生素D衍生物、煤焦油和局部用类维生素A的局部用药剂是对银屑病进行初始管理的基础，并且是跨疾病严重程度谱应用于患者的治疗阶梯的重要部分。通常为诊断为轻度至中度疾病的患者开具局部用药剂作为单药治疗的处方。通常为患有重度疾病的患者开具局部用药剂作为光疗或全身(小分子)治疗(如甲氨蝶呤、环孢菌素或口服类维生素A)的辅助疗法。对中度至重度银屑病的治疗方案还包括基于抗体的疗法。

目前市场上用于治疗银屑病的治疗性产品提供不同程度的症状缓解和降低的复发率，但是目前尚无被认为是治愈性的治疗性产品，因此其需要长期用药。尽管很多现有的局部用药剂在短期内可能是有效的，但是由于存在治疗限制性毒性，大部分局部用药剂限于短期使用。这意味着患者需要常规监测副作用以及定期更换至新治疗方案。

通常为患有重度疾病的患者开具局部用药剂作为光疗或全身(小分子)治疗(如甲氨蝶呤、环孢菌素或口服类维生素A)的辅助疗法(Nast等，Arch Dermatol Res(2007)299:111–138)。光疗可能是有效的，但是不方便并且与皮肤癌的显著风险相关。小分子全身疗法与心血管风险增加；肾功能不全、白细胞减少和血小板减少相关。例如，甲氨蝶呤可能导致中性粒细胞减少和肝损伤，并且禁用于没有采取适当避孕措施的育龄男性和女性。环孢菌素是一种强效免疫抑制剂，其对肾脏和血压具有潜在的不利影响。阿维A是一种具有一系列副作用的口服类维生素A，并且也禁用于没有采取适当避孕措施的育龄男性和女性(Nast等，Arch Dermatol Res(2007)299:111–138)。

对中度至重度银屑病的治疗方案还包括基于抗体的疗法。已批准的治疗包括具有抗TNF-α活性的人源化单克隆抗体阿达木单抗

TNF-α抑制剂依那西普

TNF-α抑制剂英夫利昔单抗

以及最近的优特克单抗

(其是一种靶向IL-12和IL-23的共同p40亚基，从而阻断这两种细胞因子的信号传导的人mAb)。

近年来，Th17通路的重要性在银屑病中已被很好地验证，几种靶向IL-17的单克隆抗体(mAb)在调控这些细胞因子和影响银屑病方面已显示出显著的重要性。T-细胞衍生的细胞因子IL-17是一种用于在皮肤中进行靶向疗法的靶点。尽管银屑病在一些患者中可能具有全身症状，但是该疾病主要是皮肤症状。由Th17细胞分泌的IL-17通过在表皮角化细胞上存在的IL-17R复合物而作用于这些细胞，以引发角化细胞过度增殖和持续性炎症的反馈循环，从而产生银屑病斑块。据信病理活性的主要元件局部地在皮肤中，因此对IL-17/IL-17R相互作用的抑制是用于局部疗法的最佳的经验证的靶点。这与其他经验证的Th17靶点(如IL-23)是不同的，该靶点显著的活性相在局部淋巴结。

一些其他单克隆抗体药物在中度至重度斑块状银屑病患者中已显示出能够显著减轻疾病的严重程度。这些药物包括ixekizumab

和苏金单抗(secukinumab)

两者均靶向IL-17A，以及brodalumab

其与IL-17RA结合并抑制其信号传导，因此预计将阻断利用该受体的IL1-7家族成员，包括IL-17A、IL-17F、IL-17A/F以及可能的IL-17E。IL-17抑制剂的初步临床结果表明了IL-17A在银屑病病理生理中的重要性。在独立的临床试验项目直至并包括大量的确证性III期试验中，已报道所有三种药物均显著减轻中度至重度斑块状银屑病患者的疾病严重程度。苏金单抗显示出下调与在受损皮肤中的炎症应答相关的细胞因子、趋化因子和蛋白。总之，对IL-17A的抑制允许选择性介入来调节斑块状银屑病中异常的免疫系统(Girolomoni等，The British Journal ofDermatology.2012a；167(4):717-724，Huebner等，Gut 2012；61:1693-700，Papp等，NewEngl J Med 2012；366:1181-9，Mease等，N Engl J Med.2014 12；370(24):2295-306和Langley等，New Engl J Med 2014；371:326-38)。

目前市场上用于治疗银屑病的治疗性产品提供不同程度的症状缓解和降低的复发率，但是目前尚无被认为是治愈性的治疗性产品，因此其需要长期用药。尽管很多现有的局部用药剂在短期内可能是有效的，但是由于存在治疗限制性毒性，大部分限于短期使用。这意味着患者需要常规监测副作用以及定期更换至新治疗方案。光疗可能是有效的，但是不方便并且与皮肤癌的显著风险相关，很多常规(小分子)全身疗法与心血管风险增加；肾功能不全、白细胞减少和血小板减少相关。全身性的生物制剂已经改变了中度至重度银屑病的治疗，但是与任何免疫抑制方案一样，长期使用可能具有显著的副作用，如感染或恶性肿瘤的风险增加。考虑到这一点，治疗方案不得不采取降低毒性的策略，包括回转或顺序疗法、药物假期和联合疗法。重要的是，对于一些药物，任何一个患者能够安全接受的暴露量存在绝对终生限度。

IL-17细胞因子家族包括六个成员：IL-17/IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E/IL-25和IL-17F，其由多种细胞类型产生。该家族的成员具有含有半胱氨酸结折叠结构的高度保守的C-末端。除了以非共价的同型二聚体形式分泌的IL-17B之外，大多数IL-17蛋白以二硫键连接的二聚体形式分泌。

通过IL-17家族细胞因子的信号传递由IL-17受体家族成员IL-17R/IL-17RA、IL-17BR/IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE介导。这些受体的激活触发细胞内途径，所述细胞内途径诱导促炎性细胞因子和抗微生物肽的产生。IL-17A、IL-17F和IL-17A/F主要由活化的T细胞产生，并通过由IL-17RA和IL-17RC构成的寡聚化的受体复合物传递信号。配体与该复合物的结合导致细胞内衔接蛋白Act1和TRAF-6的募集，以及转录因子NFκB、AP-1和C/EBP的下游活化。IL-17E通过由IL-17RA和IL-17B R/IL-17RB形成的受体复合物激活类似的信号传导通路。通过IL-17E的信号传导诱导Th2型免疫应答，并且可能参与促进哮喘的发病机制。对由其他IL-17家族细胞因子激活的信号传导通路知之甚少。最近的研究表明IL-17C主要由上皮细胞产生，并且与由IL-17RA和IL-17RE构成的受体复合物结合。在上皮细胞中通过IL-17C的自分泌信号传导刺激抗微生物肽和促炎性细胞因子的产生，但是与IL-17A一样，IL-17C的过表达可能有助于自身免疫性疾病的发展。与IL-17E类似，IL-17B与IL-17BR/IL-17RB结合，但是尚未报道其主要靶细胞以及IL-17B信号传导的作用。此外，目前尚不知晓IL-17D的受体和IL-17RD的配体。

在WO2016/113557中描述了与人IL17A结合的单域抗体，其全部内容在此并入。

IL-17途径在诸如银屑病和哮喘在内的疾病进展中起重要作用。IL-17通过有助于炎症应答而促进银屑病，其中所述炎症应答损害和颠覆表皮层的角质形成细胞。由于其在疾病中的作用，正在将IL-17抑制剂作为对各种疾病的可能治疗进行研究。然而，开发稳定且具有活性的蛋白制剂，特别是用于局部递送的蛋白制剂，可能是一项挑战，因为涉及到蛋白的物理和化学稳定性，蛋白制剂的生产、储存和运送方面的问题。

如上所示，对于与IL-17信号传导相关的疾病需要供局部和全身使用的新的有效的和安全的治疗选择。特别地，在这一领域中需要稳定的药物制剂，特别是供局部使用的制剂。

发明内容

本发明涉及包含能够结合人IL-17A的分离的结合分子(特别是用于局部施用的抗体或其片段)的药物组合物和制剂。优选的片段是单域抗体，特别是单可变重链结构域抗体。

在一个方面中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含

a)有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单可变重链结构域抗体，

b)10-150mM的Tris/甘氨酸，

其中所述组合物的pH是约5至约9。

例如，所述单可变重链结构域抗体包含具有SEQ ID NO:4的CDR3。在另一个实施方式中，所述单可变重链结构域抗体包含具有SEQ ID NO:2的CDR1、具有SEQ ID NO:3的CDR2和具有SEQ ID NO:4的CDR3。在另一个实施方式中，所述单可变重链结构域抗体包含SEQ IDNO:1或与其具有至少75％同源性的序列。在另一个实施方式中，所述单可变重链结构域抗体包含SEQ ID NO:74或与其具有至少75％同源性的序列。

在一个实施方式中，所述组合物还包含下述赋形剂中的一种或多种：0.1-150mM的L-精氨酸/谷氨酸、0.1-15％的山梨醇和/或0.1-30％的丙二醇。

在一个方面中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含

a)有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单域抗体，其中所述单域抗体的结构域包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，b)10-150mM的Tris/甘氨酸，且任选地包含下述赋形剂中的一种或多种：0.1-150mM的L-精氨酸/谷氨酸、0.1-15％的山梨醇和/或0.1-30％的丙二醇，其中所述组合物的pH是约5至约9。

所述组合物可以是液体，喷雾干燥或冷冻干燥形式。

在一个方面中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含

a)有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单域抗体，其中所述单域抗体的结构域包含SEQ ID No.1或与其具有至少75％同源性的序列，

b)50-150mM的Tris/甘氨酸

c)50-150mM的L-精氨酸/谷氨酸

d)5-15％的山梨醇，和

e)4-30％的丙二醇

其中所述组合物的pH是约5至约9。

在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含

a)有效量的能够结合人IL-17A的单域抗体，其中所述单域抗体包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，

b)约100mM的Tris/甘氨酸，

c)约125mM的L-精氨酸/谷氨酸，

d)约10％的山梨醇，和

e)约6％的丙二醇

其中所述组合物的pH是7.5至8.5，例如约8。

在一个方面中，本发明涉及如上所述的组合物在治疗疾病中的用途。

在一个实施方式中，所述药物适于局部施用。

在一个方面中，本发明涉及一种治疗疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如上所述的组合物。

在一个方面中，本发明涉及一种用于治疗疾病的如上所述的组合物。

在一个实施方式中，所述疾病选自皮肤病症，例如银屑病、脊柱关节病、葡萄膜炎、牙龈炎或特应性皮炎。

在一个方面中，本发明涉及一种冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，所述组合物包含

a)有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单域抗体，例如包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列的单域抗体，

b)10-150mM的Tris/甘氨酸，

其中所述组合物的pH是约5至约9。

在一个方面中，本发明涉及一种复溶的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，所述组合物包含如上所述的组合物，还包含复溶剂，如丙二醇和/或山梨醇。

在一个方面中，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的组合物以及任选的使用说明书。

在又一个方面中，本发明涉及一种容器，例如雾化器或吸入器，所述容器包含如上所述的组合物。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于制备供局部施用的复溶制剂的方法，所述方法包括提供如上所述的组合物以及添加复溶剂，如丙二醇。

在另一个方面中，本发明涉及一种供局部施用的乳膏、软膏、乳液、凝胶、贴片、膏药、敷料、气雾、粉剂或液体，其包含如上所述的组合物。

在另一个方面中，本发明涉及包含10-150mM的Tris/甘氨酸的缓冲液在制备制剂中的用途，所述制剂包含有效量的能够结合人IL-17A的单域抗体，例如包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列的单域抗体。

在一个实施方式中，所述缓冲液包含

a)约100mM的Tris/甘氨酸，

b)约125mM的L-精氨酸/谷氨酸，

c)约10％的山梨醇，和

d)约6％的丙二醇

其中所述组合物的pH是7.5至8.5，例如约8。

在一个方面中，本发明涉及一种制备如上所述的组合物的方法，所述方法包括将如上所述的原料药缓冲液与IL-17分子结合分子组合。

在一个方面中，本发明涉及一种制备用于治疗病症的制剂的方法，所述方法包括将有效量的能够结合人IL-17A的单域抗体(其中例如包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列的单域抗体)加入包含10-150mM的Tris/甘氨酸的缓冲液。

附图说明

在下述非限制性附图中进一步描述了本发明。

图1：对前四种原料药制剂进行的6周加速稳定性研究。(每种制剂从左到右显示T＝0至T＝6)。

图2：在原料药缓冲液中40mg/mL的抗IL-17A V_H1.1(SEQ ID NO:74)在2-8℃下贮存3个月的稳定性。使用SE-HPLC测量。

图3：在原料药缓冲液中的40mg/mL的抗IL-17A V_H1.1(SEQ ID NO:74)在2-8℃下贮存3个月的稳定性。使用SDS page测量。

图4：在体外银屑病皮肤模型中，被制剂中的抗IL-17A V_H1.1(SEQ ID NO:74)抑制的若干生物标记物的基因表达。X轴：所检测的制剂和生物标记物。Y轴：基因表达的诱导百分比。

图5：在体外银屑病皮肤模型中，制剂中的V_H1.1(SEQ ID NO:74)对细胞因子/趋化因子的抑制。X轴：所检测的制剂和细胞因子/趋化因子。Y轴：细胞因子/趋化因子的释放百分比。

图6：荧光共振能量转移(FRET)测定原理的示意图。

图7：Gyros V_H 1.1测定的示意图。

图8：在体外银屑病模型中，CCL20被局部的制剂中的抗IL-17A V_H1.1(SEQ ID NO:74，100μL)(甚至在低剂量下)所抑制。

图9：使用银屑病皮肤构建体的CCL20释放研究，其中局部应用在替代制剂中的V_H1.1(SEQ ID NO:74)-96小时。所检测的制剂如表3至5所示。

图10：使用FRET分析在替代制剂中的抗IL-17A V_H1.1(SEQ ID NO:74)对银屑病组织样品的渗透情况。所检测的制剂如表3至5所示。

图11：在5℃下在12个月中原料药制剂和另外的制剂的稳定性。SE HPLC。

图12：在-20℃下12个月中原料药制剂和另外的制剂的稳定性。SE HPLC。

图13：使用SE-HPLC测量的在-70℃下12个月中原料药制剂和另外的制剂的稳定性。

图14：使用SE-HPLC在-70℃下对散装原料药进行的稳定性研究的12个月数据。

图15：使用IEX-HPLC在-70℃下对散装原料药进行的稳定性研究的12个月数据。

图16：使用SDS PAGE在-70℃下对散装原料药进行的稳定性研究的12个月数据。

图17：使用SE-HPLC在-70℃下对散装原料药(不含PG的制剂)进行的稳定性研究的12个月数据。

图18：使用IEX-HPLC在-70℃下对散装原料药(不含PG的制剂)进行的稳定性研究的12个月数据。

图19：使用SDS PAGE在-70℃下对散装原料药(不含PG的制剂)进行的稳定性研究的12个月数据。

具体实施方式

现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确地相反指出，否则如此定义的每个方面均可以与任何其他一个方面或多个方面组合。具体地，指出为优选的或有利的任何特征均可以与指出为优选的或有利的任何其他一个特征或多个特征组合。

在通常情况下，与在本申请中所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名以及本申请中所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是在本领域中熟知和常用的那些。除非另外指出，否则本公开的方法和技术通常根据在本领域中熟知的和如在整个说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法进行。参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2012))。如在本领域中通常完成的或如在本申请中所描述的，酶反应和纯化技术根据生产厂商的说明书进行。在本申请中所述的与分析化学、合成有机化学、药物和制药化学结合使用的命名以及分析化学、合成有机化学、药物和制药化学的实验室操作和技术是在本领域中熟知和常用的那些。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和运输，以及患者的治疗。

发明人已经证明，能够使用如本申请所述的适宜赋形剂将分离的IL-17A结合分子配制用于局部递送。因此，本发明提供了稳定的非聚集的组合物/制剂，特别是包含IL-17A结合分子的适于局部递送的组合物和制剂。在一个方面中，本发明提供了配制为冷冻干燥的或喷雾干燥的组合物的此类组合物。可以将其复溶以用于施用。在另一个方面中，本发明提供了配制为液体、凝胶、乳膏、乳液、软膏或用于粉末吸入的气雾的组合物或者使用药膏、贴片等施用的组合物。

因而，在一个方面中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含

a)有效量的能够结合人IL-17A的结合分子(例如，至少一种单域抗体)，以及

b)10-150mM的Tris/甘氨酸

其中所述组合物的pH是约5至约9。

如本申请中所进一步解释的，在一个实施方式中，IL-17A结合分子优选地选自单域抗体(sdAb)。在一个实施方式中，单域抗体是单可变结构域抗体。在一个实施方式中，单可变结构域是重链可变结构域。在一个实施方式中，IL-17A结合分子选自至少一种包含能够结合人IL-17A的V_H或V_HH结构域的单域抗体(“V_H或V_HH单域抗体”)。通常将V_H结构域理解为指人可变重链结构域。通常将V_HH结构域理解为指骆驼可变重链结构域。

在本发明组合物的一个实施方式中，组合物包含有效量的至少一种单域抗体，所述单域抗体包含能够结合人IL-17A的V_H结构域，其中所述V_H结构域具有如下序列：所述序列包含具有氨基酸残基GEILPLYFDY(SEQ ID NO:4)的CDR3序列，或者包含具有与SEQID NO:4具有至少80％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同源性的序列的CDR3。在一个实施方式中，所述CDR3序列是SEQ ID NO:4的变体，并且包含所述SEQ ID NO:4的一个或多个氨基酸残基的取代、插入、添加或缺失。

在一个实施方式中，所述V_H结构域包含具有氨基酸残基SYSMY(SEQ ID NO:2)的CDR1或者具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的序列的序列。在一个实施方式中，所述CDR1序列是SEQ ID NO:2的变体，并且包含所述SEQ ID NO:2的一个或多个氨基酸残基的取代、插入、添加或缺失。

在一个实施方式中，所述V_H结构域包含具有氨基酸残基EIKQDGSVQYYVSDVKG(SEQID NO.3)的CDR2或者与SEQ ID NO:3具有至少80％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同源性的序列。在一个实施方式中，所述CDR2序列是SEQ ID NO:3的变体，并且包含所述SEQ ID NO:3的一个或多个氨基酸残基的取代、插入、添加或缺失。

在一个实施方式中，V_H结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1具有SEQ IDNO:2或其包含一个或多个氨基酸残基的取代、添加或缺失的变体，所述CDR2具有SEQ IDNO:3或其包含一个或多个氨基酸残基的取代、添加、插入或缺失的变体，以及所述CDR3具有SEQ ID NO:4或其包含一个或多个氨基酸残基的取代、添加、插入或缺失的变体。在一个实施方式中，V_H结构域具有CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1具有SEQ ID NO:2，所述CDR2具有SEQ ID NO:3，且所述CDR3具有SEQ ID NO:4。

在另一个实施方式中，所述V_H结构域包含如下或由如下构成：SEQ ID NO:1或与其具有至少50％、55％、60％、65％、70％或75％同源性的序列。SEQ ID NO:1如下所示：SEQ IDNO:1(CDR1、2和3以粗体和下划线标出)

如将在本申请中进一步解释的，在一个方面中，可以将一种或多种任选的赋形剂加入上文所述的组合物，特别是用于局部递送的上文所述的组合物。在本申请中使用局部递送来描述施用至身体的特定部位，包括将局部药剂施用至身体表面以及向肺部施用。局部施用可以是向皮肤、眼部、牙龈、膜或肺部施用。在第二个方面中，上文所述的本发明组合物可以是与一种或多种任选的赋形剂一起冷冻干燥或喷雾干燥。可以在施用前使用适于局部递送的一种或多种赋形剂将此类组合物复溶。

在整个本公开内容中，除非另有说明，否则对百分比、比例等的所有表述均为“以重量计”。如在本申请中所使用的，“以重量计”与术语“以质量计”同义，表示本申请中定义的比例或百分比是根据重量而非根据体积、厚度或一些其他度量进行的。

本发明涉及作为药物组合物和制剂的制剂和组合物。如在本申请中所使用的，术语“制剂”或“组合物”描述了活性分子与药学上可接受的赋形剂组合。术语“药物组合物”或“药物制剂”指一定形式的配制品，所述形式使得活性成分的生物活性是有效的。术语“药学上可接受的”指能够被施用至动物(例如，哺乳动物)而不具有显著的不良医学后果的化合物或蛋白。

细胞因子的IL-17家族包括六个成员，IL-17/IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E/IL-25和IL-17F，其由多种细胞类型产生。该家族的成员具有含有半胱氨酸结折叠结构的高度保守的C端。除作为非共价同型二聚体分泌的IL-17B外，大多数IL-17蛋白作为二硫键连接的二聚物分泌。

通过IL-17家族细胞因子的信号传递由IL-17受体家族成员IL-17R/IL-17RA、IL-17BR/IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE介导。这些受体的激活触发细胞内途径，所述细胞内途径诱导促炎性细胞因子和抗微生物肽的产生。IL-17A、IL-17F和IL-17A/F主要由活化的T细胞产生，并通过由IL-17RA和IL-17RC构成的寡聚化的受体复合物传递信号。配体与该复合物的结合导致细胞内衔接蛋白Act1和TRAF-6的募集，以及下游转录因子NFκB、AP-1和C/EBP的活化。IL-17E通过由IL-17RA和IL-17B R/IL-17RB形成的受体复合物活化类似的信号传导通路。通过IL-17E的信号传导诱导Th2型免疫应答，并且可能参与促进哮喘的发病机制。对由其他IL-17家族细胞因子激活的信号转导通路知之甚少。最近的研究表明IL-17C主要由上皮细胞产生，并且与由IL-17RA和IL-17RE构成的受体复合物结合。在上皮细胞中通过IL-17C的自分泌信号传导刺激抗微生物肽和促炎性细胞因子的产生，但是与IL-17A一样，IL-17C的过表达可能有助于自身免疫性疾病的发展。与IL-17E类似，IL-17B与IL-17BR/IL-17RB结合，但是尚未报道主要靶细胞以及IL-17B信号传导的作用。此外，目前尚不知晓IL-17D的受体和IL-17RD的配体。

如在本申请中所使用的IL-17A结合分子与人IL-17A(登录号Q16552(Swiss-Prot)，显示出包含信号肽的全长前体IL-17A，SEQ ID NO:75)和/或食蟹猴IL-17(UniprotG7P4U9)结合。人IL-17A是由两条155个氨基酸的链组成的同型二聚体。每条多肽链包含23个氨基酸的N端肽，所述N端肽被切除而产生132个残基的成熟多肽。IL-17A与IL-17受体A和C结合，并且通过IL-17受体A和C的激活而发挥作用。

SEQ ID NO:75

MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA

术语“IL-17结合分子”、“抗-IL-17结合分子”、“IL-17结合蛋白”、“抗-IL-17单域抗体”或“抗-IL-17抗体”都是指能够与人IL-17A抗原结合的分子。因而，如在本申请中所使用的，除非另外说明或除非上下文另外指出，IL-17通常是指IL-17A。结合反应可以通过标准方法(定性测定)示出，包括例如，结合测定、竞争测定或用于确定IL-17与其受体结合的抑制的生物测定或参照其中使用非相关特异性的抗体的阴性对照试验的任何类型的结合测定。术语“IL-17结合分子”包括IL-17结合蛋白或其能够结合人IL-17A的部分。在优选的实施方式中，IL-17结合分子是抗体或其片段，例如抗-IL-17单域抗体。在更优选的实施方式中，IL-17结合分子是包含如本申请所述的V_H结构域的抗-IL-17单域抗体。

术语“抗体”广义上是指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，或其保持Ig分子的必需的表位结合特征的任何功能性片段、突变体、变体或衍生物。此类突变体、变体或衍生抗体形式是在本领域中公知的。在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在本申请中缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(在本申请中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可以进一步分为被称为互补性决定区(CDR)的高变区，夹杂有被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端到羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

术语“CDR”是指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区中的每一个中存在三个CDR，其对于可变区中的每一个来说表示为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单一可变区中出现的一组三个CDR。已经根据不同的系统不同地限定了这些CDR的确切边界。在本申请中使用由Kabat描述的系统。术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本申请中可互换使用。在本领域中接受的这些术语是指对氨基酸残基进行编号的系统，所述氨基酸残基与抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基相比更可变(即，高变)(Kabat等，(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。

术语“抗原结合位点”指包含与抗原特异性结合的区域的抗体或抗体片段的部分。抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合位点包含在抗体或抗体片段的相关V_H和V_L内。

抗体片段是抗体的一部分，例如作为F(ab')₂、Fab、Fv、sFv等。全长抗体的功能性片段保留了全长抗体的靶点特异性。因此，已将重组功能性抗体片段，如Fab(片段，抗体)、scFv(单链可变链片段)和单域抗体(dAb)用于开发作为基于mAb的治疗剂的替代物的治疗剂。

scFv片段(～25kDa)由两个可变结构域V_H和V_L构成。自然，V_H和V_L结构域通过疏水性相互作用非共价结合并且易于解离。然而，通过使用亲水性柔性接头连接结构域以形成单链Fv(scFv)能够工程化制备稳定的片段。

最小的抗原结合片段是单可变片段，称为V_H或V_L结构域。靶向结合不需要分别与轻链/重链配偶体结合。此类片段被用于单域抗体中。因而，单域抗体(～12至15kDa)由V_H或V_L结构域构成或者包含上述结构域。

术语“单域抗体、可变单结构域或免疫球蛋白单可变结构域(ISV)”是本领域所熟知的并且描述了与靶抗原结合的抗体的单可变片段。这些术语在本申请中可互换使用。如下所述，在本发明不同方面的优选实施方式中，单可变结构域可以是结构域抗体(“dAb”)或适于作为结构域抗体使用的氨基酸序列、单域抗体(或适于作为单域抗体使用的氨基酸序列)、其他单可变结构域或者其任何一个的任意适宜片段。本领域中已对单域抗体进行了描述；其是互补性决定区是单域多肽(例如可变结构域，如人重链可变结构域(V_H)多肽)的一部分的抗体。其中可变结构域是V_HH结构域的单可变结构域抗体也在本发明的范围内。对于(单)域抗体的一般性描述，还可以参见Ward等，1989(Nature 341(6242):544-546)和Holt等，2003(Trends Biotechnol.21(11):484-490)。

在一个实施方式中，本发明的结合分子包含单可变结构域抗体，其中所述可变结构域是V_H结构域。将此类分子称为V_H单域抗体或单V_H结构域抗体。人重链可变结构域抗体是特别优选的。在本申请中还将包含单可变结构域抗体(其中所述结构域是人V_H结构域)的结合分子称为

V_H。因而，在一个实施方式中，IL-17A结合分子是

V_H。

是克雷森多生物制剂有限公司(Crescendo Biologics Ltd)的注册商标。

如在本申请中所使用的，术语V_H或“可变结构域”指由Kabat等(1991)定义的免疫球蛋白可变结构域。在本申请中使用的CDR氨基酸残基的编号和位置符合众所周知的Kabat编号惯例。

在一个实施方式中，在制剂和本发明的其他方面中使用的分离的结合分子包含如下或由如下构成：至少一种单域抗体，其中结构域是人V_H结构域。因而，在一个方面中，本发明的结合分子包含如下或由如下构成：至少一种免疫球蛋白单可变重链结构域抗体，所述抗体具有V_H结构域，但是缺乏V_L结构域。

每个单V_H结构域抗体包含按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的3个CDR和4个FR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因而，在本发明的一个实施方式中，所述结构域是具有下式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的V_H结构域。

在根据本发明的组合物中使用的IL17A结合分子(包括单域抗体)是分离的分子。术语“分离的”单域抗体指基本上不含具有不同抗原特异性的其他单域抗体、抗体或抗体片段的单域抗体。而且，分离的单域抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如在本申请中所进一步解释的，在优选的实施方式中，单V_H结构域抗体在表达根据本发明使用的人V、D和J区的转基因小鼠中产生。

根据本发明的各个方面和实施方式，本发明的单域抗体的可变结构域优选人可变结构域(通常将人可变结构域称为V_H)。如在本申请中所使用的，人V_H结构域包括全人或基本上全人的V_H结构域。如在本申请中所使用的，术语人V_H结构域还包括从仅有重链的抗体分离的V_H结构域，所述抗体由表达全人免疫球蛋白重链基因座的转基因小鼠(特别是对目标抗原的免疫接种产生应答的转基因小鼠，例如在WO2016/062990中和在实施例中所描述的)制备。在一个实施方式中，人V_H结构域还可以包括来自或基于编码此类V_H结构域的人V_H结构域的氨基酸或核酸序列的V_H结构域。因而，该术语包括来自人种系免疫球蛋白序列或由人种系免疫球蛋白序列编码的可变重链区。基本上是人的V_H结构域或来自或基于人V_H结构域的V_H结构域可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，比如通过随机或位点特异性诱变在体外引入或者通过体细胞突变在体内引入的突变)。因此，术语“人V_H结构域”还包括其中一个或多个氨基酸残基已被修饰的基本上是人的V_H结构域。例如，与全人序列相比，基本上是人的V_H结构域可以包含至多10个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸修饰。

然而，如在本申请中所使用的，术语“人V_H结构域”或“基本上是人的V_H结构域”并非旨在包括其中已将来自另一哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列移植到人框架序列上的抗体。在一些实施方式中，如在本申请中所使用的，术语“人V_H结构域”不包括骆驼化的V_H结构域，即已被特异性修饰，例如在体外通过常规诱变方法进行特异性修饰以在V_H结构域序列中选择预定位置，并在所述预定位置引入一个或多个点突变以便将一个或多个预定残基变成能够存在于骆驼V_HH结构域中的特定残基的人V_H结构域。

因而，在一个实施方式中，IL-17A结合分子选自至少一种包含能够结合人IL-17A的人V_H结构域的单域抗体。在一个实施方式中，IL-17A结合分子选自至少一种能够结合人IL-17A的单V_H结构域抗体。在另一个实施方式中，V_H结构域包含如下或由如下构成：SEQ IDNO:1或与其具有至少50％、55％、60％、65％、70％或75％同源性的序列。

可以对V_H框架进行修饰以改善结合和/或其他性质。例如，V_H结构域可以包含C或N端延伸。

“同源性”通常是指在对序列进行比对并且在一些实施方式中在引入空位(如有需要)以实现最大百分同源性并且不认为任何保守性置换是序列同一性的一部分之后，在候选序列中的与同其进行比较的多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。N端或C端延伸、标签或插入都不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是公知的。

如本申请所示，在一个实施方式中，本发明的组合物包含有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单V_H结构域抗体，其中所述V_H结构域包含SEQ ID NO:1或与其具有至少50％、55％、60％、65％、70％或75％同源性的序列。在一个实施方式中，所述序列同源性或同一性是至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一些实施方式中，本发明提供了一种单V_H结构域抗体，其是如SEQ ID NO:1所定义的单V_H结构域抗体的变体，所述变体与SEQ ID NO:1相比具有一个或多个氨基酸修饰，并且保持了单域抗体的生物学功能。修饰可以是氨基酸残基的一个或多个取代、缺失、插入或其他添加。变体可以选自如表1中所示的SEQ ID NO:5至73。

在一个实施方式中，可以对变体单V_H结构域抗体进行序列工程化改造。修饰包括编码单域抗体或多肽的一个或多个密码子的至少一个取代、缺失或插入，以使得与天然序列V_H单结构域抗体或多肽相比氨基酸序列改变。氨基酸取代可以源于一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代，如亮氨酸被丝氨酸取代，即保守性氨基酸取代。插入或缺失可以任选地在约1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的范围内。可以通过如下方式确定允许的变化：在序列中系统性地进行氨基酸的插入、缺失或取代，并检测所得变体的由全长或成熟天然序列所显示出的活性。在SEQ ID NO:1中定义的V_H单域抗体的变体优选地与非变体分子具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，优选地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。

在一个实施方式中，修饰是保守性序列修饰。如在本申请中所使用的，术语“保守性序列修饰”旨在指不会显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸取代、添加或缺失。可以通过本领域公知的标准技术将修饰引入本发明的抗体，如位点定向诱变和PCR介导的诱变。保守性氨基酸取代是其氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，本发明的单域抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基取代，并且可以使用本申请所述的功能性测定检测替代抗体的保留功能(即，上述(c)至(l)所述的功能)。

在一些实施方式中，本发明提供了一种如SEQ ID NO:1中所定义的V_H单域抗体的变体，其包含一个或多个序列修饰，并且与未经修饰的单域抗体相比，其具有一个或多个性质的改善，如结合亲和性、特异性、热稳定性、表达水平、效应物功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性。

在一个实施方式中，可以进行修饰以降低单域抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基替换成对应的人种系序列。更具体地，已发生体细胞突变的单域抗体可以含有不同于所述单域抗体所来自的种系序列的框架残基。可以通过对单域抗体的框架序列与所述单域抗体所来自的种系序列进行比较来鉴定此类残基。

为了使在框架区序列中的一个或多个氨基酸残基恢复为其种系构成，可以通过例如位点定向诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。

另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或者甚至是一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以除去T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。

在又一个实施方式中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备非糖基化(aglycosylated)抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以对糖基化进行改变以例如增加抗体对抗原的亲和性。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现此类碳水化合物的修饰。例如，可以进行导致一个或多个可变区框架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，从而在该位点消除糖基化。此类非糖基化(aglycosylation)可以增加抗体对抗原的亲和性。

本领域技术人员将知晓有不同的方法来鉴定、获得和优化如本申请所述的抗原结合分子(包括体外和体内表达文库)。将在实施例中对其进行进一步描述。可以使用本领域公知的优化技术，如展示(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如，易错诱变)。因此，本发明还包含本申请所述单域抗体的序列优化的变体。

在一个实施方式中，V_H结构域包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1构成，但是包含一个或多个氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区(例如FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在另一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在另一个实施方式中，V_H结构域包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1构成，但是在CDR序列(例如CDR1、CDR2或CDR3)中包含1、2、3、4或5个氨基酸取代。例如，在SEQ ID NO:1或其变体的CDR3(SEQ ID NO:4)中，一个或多个Y可以被H取代。

在一个实施方式中，V_H单域抗体选自下表1中所示的氨基酸序列之一(表1显示了全长V_H氨基酸序列；FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的序列分别在表1单独的列中显示以便于查阅)。

表1

V_H结构域的C末端以VTVSS(SEQ ID NO:77)结束。在本申请所述的结合分子的一个实施方式中，V_H结构域包含额外的C末端残基，例如1至15个额外的C末端残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸。在一个实施方式中，V_H结构域包含1至15个氨基酸残基的额外的C末端残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，其中所述残基是C_H1结构域的残基。换言之，V_H结构域延伸入C_H1结构域。在一个实施方式中，所述延伸包含至少一个丙氨酸残基，例如单个丙氨酸残基、一对丙氨酸残基或三个丙氨酸残基。此类延伸的V_H结构域在本发明的范围内。在一个实施方式中，V_H结构域的C末端是截短的，并且可以缺失VTVSS(SEQ IDNO:77)中的一个或多个。在一个实施方式中，VTVSS(SEQ ID NO:77)中的一个或多个可以被另一残基取代。

包含额外的C或N末端残基(例如接头残基和/或标签的标记，如His标签，例如六-His)的V_H结构域也在本发明的范围内。在一个实施方式中，V_H结构域包含SEQ ID NO.1的变体或由SEQ ID NO.1的变体构成，并称为V_H 1.1(SEQ ID NO:74)，其具有如实施例中所示的下述氨基酸序列。

SEQ ID NO:74

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSA

因而，在一个方面中，本发明涉及一种用于局部递送的组合物，所述组合物包含

a)有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单域抗体，其中所述单域抗体包含SEQIDNO:1或与其具有至少75％同源性的序列，以及

b)10-150mM的Tris/甘氨酸，

其中所述组合物的pH是约5至约9。

在一个实施方式中，V_H结构域包含SEQ ID NO:1或74或由SEQ ID NO:1或74构成。

在一个实施方式中，所述组合物包含浓度为约10至约150mM(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM)的Tris/甘氨酸。在本发明组合物的一个实施方式中，Tris/甘氨酸的浓度是约50至约150mM，例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。在一个实施方式中，浓度是约90至110mM。在一个实施方式中，浓度是约100mM。

在一个实施方式中，所述组合物还包含下述赋形剂中的一种或多种：约0.1至约150mM的L-精氨酸/谷氨酸、约0.1至约15％的山梨醇和/或约0.1至约30％的丙二醇。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-150mM的L-精氨酸/谷氨酸。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-15％的山梨醇。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-30％的丙二醇。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-150mM的L-精氨酸/谷氨酸和0.1-15％的山梨醇。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-15％的山梨醇和0.1-30％的丙二醇。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-150mM的L-精氨酸/谷氨酸和0.1-30％的丙二醇。在一个实施方式中，所述组合物还包含0.1-150mM的L-精氨酸/谷氨酸、0.1-15％的山梨醇和0.1-30％的丙二醇。

在本发明组合物的一个实施方式中，L-精氨酸/谷氨酸的浓度是约50至约150mM，例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。在一个实施方式中，浓度是约90至110mM。在一个实施方式中，浓度是约125mM。

在本发明组合物的一个实施方式中，山梨醇的浓度是5-15％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在一个实施方式中，浓度是约10％。

在本发明组合物的一个实施方式中，丙二醇的浓度是约4至约30％，例如4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一个实施方式中，浓度是约5至15％、10％至15％、15％至20％或者20％至25％。在一个实施方式中，浓度是约6％。在一个实施方式中，浓度是约14％。

根据本发明组合物的一些实施方式，pH在约7至约8.5之间的范围内，优选地在7.5至8.5之间。在一些实施方式中，pH可以选自约pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在一个实施方式中，pH是约8.0。

本领域技术人员将理解的是，可以将不同浓度的如上所示组合物的组分进行组合。

在一个实施方式中，所述组合物包含50至150mM的Tris/甘氨酸，50至150mM的L-精氨酸/谷氨酸，5至15％的山梨醇和4至30％的丙二醇，其中所述组合物的pH是约5至约9，例如在7.5至8.5之间。

在一个实施方式中，所述组合物包含约100mM的Tris/甘氨酸，约125mM的L-精氨酸/谷氨酸，约10％的山梨醇和约6％的丙二醇，其中所述组合物的pH在7.5至8.5之间，例如约8。

在一些实施方式中，所述组合物包含至少一种抗-IL-17A结合分子，例如如本申请所述的V_H单域抗体。在一些实施方式中，可以存在一种以上的抗-IL-17A V_H单域抗体。在一个实施方式中，所述组合物包含二互补位或二价抗-IL-17A V_H单域抗体。在另一个实施方式中，所述组合物还包含不是V_H单域抗体的第二抗体或抗体片段。抗-IL-17A V_H单域抗体还可以与用于增强和/或补充抗体有效性的其他药剂一起使用和施用。

可以使用本领域公知的方法构建在本发明的制剂中使用的多特异性结合分子。

在二互补位或多特异性结合分子中，各部分通常通过接头(例如，多肽接头)连接。适宜的接头是本领域公知的，例如包括含GS残基(如(Gly4Ser)n)的接头，其中n＝1至10，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。

如有需要，可以将双特异性或多特异性结合分子连接至抗体Fc区或其片段，所述抗体Fc区或其片段包含C_H2和C_H3结构域中的一个或全部两个，以及任选的铰链区。例如，作为单个核苷酸序列与Fc区或其片段连接的编码双特异性或多特异性结合分子的载体可以用于制备此类多肽。

示例性的第二抗原靶点包括白细胞受体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD4、CD45、CD58、CD80、CD86，或其配体；TNF、IL-1、IL-15、IL-23、IL-6或CD20。该列表不限于所提及的物质。

在一个实施方式中，可以将第二(或第三、第四、第五等)部分连接至结合IL-17A的V_H结构域，例如以延长结合分子的半衰期。该部分可以包含结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))的蛋白(例如，抗体)或其部分。在一个实施方式中，第二部分可以包含结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))的V_H结构域。

第二部分可以包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))或其变体(如C34S)。还提供了一种如本申请所述的结合分子，所述结合分子包含V_H结构域和Fc结构域或其片段，例如其中V_H结构域与Fc结构域或其片段连接。还提供了一种结合分子，所述结合分子包含与第二抗原特异性结合的第二可变结构域，其中第二抗原是除了人IL-17A以外的抗原。第二抗原可以是分化簇(CD)分子或II型主要组织相容性复合物(MHC)分子。

可以通过使用缺乏内源性免疫球蛋白的转基因敲除(KO)啮齿动物(例如，小鼠)获得本申请所述的结合分子。优选地，所述小鼠不包含功能性重链、λ轻链和κ轻链基因座。可以通过缺失、插入、基因编辑或本领域公知的其他技术使所述基因座呈现非功能性。例如，可以根据WO 2003/000737中所公开的内容制备具有非功能性内源性λ和κL链基因座的小鼠，WO 2003/000737中的全部内容通过引用在此并入。可以根据WO 2004/076618中所公开的内容制备具有非功能性重链基因座的小鼠，WO 2004/076618的全部内容通过引用在此并入。

例如，转基因小鼠包含用于表达异源重链基因座的载体，例如酵母人工染色体(YAC)。YAC是可以用于克隆酵母中非常大的DNA插入物的载体。除了包含具有与天然酵母染色体一样的行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)、着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))之外，其接受大DNA插入物的能力使其能够达到类似染色体的稳定性和在酵母细胞中的运输精确性(fidelity)所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用是在本领域内熟知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,Encyclopaedia of Life Sciences 2002Macmillan Publishers Ltd,Nature PublishingGroup/www.els.net)。

例如，YAC可以包含与缺少C_H1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区结合的多种人V_H、D和J基因，如在WO2016/062990中所公开的，其全部内容通过引用在此并入。

可以根据标准技术制备转基因小鼠。可以使用IL-17A抗原免疫转基因小鼠，然后从所述小鼠产生包含V_H结构域序列的序列文库。使用标准技术从所述文库分离包含V_H结构域序列的序列。

在组合物中存在的活性分子(例如，与人IL-17A结合的抗体、抗体片段、单域抗体或V_H单域抗体)可以以约0.5mg/ml至约300mg/ml的浓度存在于组合物中。在一些实施方式中，活性分子的浓度是约10mg/ml至200mg/ml或约10mg/ml至100mg/ml。在某些实施方式中，浓度是约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml、约30mg/ml、约31mg/ml、约32mg/ml、约33mg/ml、约34mg/ml、约35mg/ml、约36mg/ml、约37mg/ml、约38mg/ml、约39mg/ml、约40mg/ml、约41mg/ml、约42mg/ml、约43mg/ml、约44mg/ml、约45mg/ml、约46mg/ml、约47mg/ml、约48mg/ml、约49mg/ml、约50mg/ml、约51mg/ml、约52mg/ml、约53mg/ml、约54mg/ml、约55mg/ml、约56mg/ml、约57mg/ml、约58mg/ml、约59mg/ml、约61mg/ml、约62mg/ml、约63mg/ml、约64mg/ml、约65mg/ml、约66mg/ml、约67mg/ml、约68mg/ml、约69mg/ml、约70mg/ml、约70mg/ml、约71mg/ml、约72mg/ml、约73mg/ml、约74mg/ml、约75mg/ml、约76mg/ml、约77mg/ml、约78mg/ml、约79mg/ml、约80mg/ml、约80mg/ml、约81mg/ml、约82mg/ml、约83mg/ml、约84mg/ml、约85mg/m、约86mg/m、约87mg/m、约88mg/m、约89mg/ml、约90mg/ml、约91mg/ml、约92mg/ml、约93mg/ml、约94mg/ml、约95mg/ml、约96mg/ml、约97mg/ml、约98mg/ml、约99mg/ml、约100mg/ml。在一个实施方式中，浓度是约20mg/ml至40mg/ml。在一个实施方式中，浓度是约20mg/ml。在一个实施方式中，浓度是约40mg/ml。

在一个实施方式中，V_H结构域的浓度是约20mg/ml至约50mg/ml，例如约20mg/ml或约40mg/ml。

用于治疗性应用的制剂的渗透压是重要的。血液/血清的正常渗透压是约300-310mOsm/L。如在实施例中所示，在制剂中的结合分子显示出高于生理水平的渗透压。因而，在一个实施方式中，制剂的渗透压处于生理水平或更高。例如，渗透压是约2mOsm/kg或更高。在一个实施方式中，渗透压是约2,386mOsm/kg。

如在实施例中所示，根据本发明的组合物在各种条件下是稳定的。如在本申请中所使用的，术语“稳定性”通常涉及保持生物活性剂(即，本申请所述的IL-17结合分子)的完整性或使其降解、变性、聚集或解折叠最小化。可以通过本领域技术人员公知的各种方法确定组合物中的活性分子的稳定性。

在一些实施方式中，可以通过体积排阻色谱(SEC)确定抗体的稳定性或聚集，体积排阻色谱是一种基于组分(例如，抗体或其片段)的分子尺寸、其扩散系数和表面性质的分离技术。因而，例如，SEC能够将处于其天然三维构象中的抗体或抗体片段与各种变性状态下的抗体和/或已降解的抗体分离。在SEC中，固定相通常由填充在玻璃或钢柱内的致密三维基质中的惰性颗粒组成。流动相可以是纯水、水性缓冲液、有机溶剂、这些的混合物或其他溶剂。固定相颗粒具有小孔和/或通道，其仅允许小于一定尺寸的物质进入。因此，大颗粒被排除在这些孔和通道之外，但是较小的颗粒从流动的流动相中除去。固定在固定相孔中的颗粒所耗费的时间部分地取决于其能够渗透进入孔中的距离。将其从流动相流中除去使其需要耗费更长的时间从柱中洗脱，并且导致了基于尺寸差异的颗粒之间的分离。

对于在水性或水/有机流动相中分离生物分子而言，将SEC称为凝胶过滤色谱(GFC)，而将在非水性流动相中分离有机聚合物称为凝胶渗透色谱(GPC)。

SEC可与鉴定技术结合以鉴定或表征本领域技术人员已知的蛋白或其片段。可以通过各种技术实现蛋白鉴定和表征，包括但不限于色谱技术，例如高效液相色谱(HPLC)、免疫测定、电泳、紫外/可见/红外光谱、拉曼光谱、表面增强拉曼光谱、质谱、气相色谱、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、尿素诱导蛋白质解折叠技术、内源性色氨酸荧光、差示扫描量热法和/或ANS蛋白结合。

可以通过高压液相色谱鉴定蛋白。熟知的技术是HPLC，例如反相HPLC(RP-HPLC)或阴离子交换高效液相色谱(AIEX-HPLC)。将含有目标蛋白的液体溶剂上样到分离柱上，在其中进行分离。HPLC分离柱填充有固体颗粒(例如，二氧化硅、聚合物或吸附剂)，并且样品混合物由于与柱颗粒相互作用而被分离成化合物。SEC和HPLC可以组合，通常将其称为SE-HPLC。

在一些实施方式中，稳定性指通过高效体积排阻色谱(HPSEC)、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、尿素诱导蛋白质解折叠技术、内源性色氨酸荧光、差示扫描量热法和1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白结合技术或本领域公知的其他技术测量时，具有较低至不可检测水平的聚集的制剂含有以蛋白重量计不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％和不超过0.5％的聚集。

液体组合物的稳定性还可以通过考察在上文所述的条件下长期储存期间抗体(包括其片段/部分)的生物活性来确定，如通过各种免疫测定进行评估，包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定，以测量抗体或其部分(包含V_H结构域)免疫特异性结合至抗原的能力。在一个实施方式中，在储存上文所定义的时间后，本发明的组合物保持储存前所述制剂的初始生物活性的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过98％、超过99％或超过99.5％，即与参照分子或储存前的存在IL-17结合V_H结构域的制剂进行比较。

在一个实施方式中，本发明的组合物在储存后保持改善的聚集和稳定性性质。在另一个实施方式中，本发明的组合物具有降低的不溶性聚集的发生率。在一个实施方式中，当在室温下(约20℃至约25℃之间)长期储存时，本发明的组合物保持改善的稳定性和/或聚集性质。

在一个实施方式中，当在降低的温度下(低于约10℃，约2℃至约8℃之间，例如在5℃下)长期储存长达约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间时，本发明的组合物保持改善的稳定性和/或聚集性质。

在另一个实施方式中，当在低温下(例如，0℃或更低，如0℃至-70℃，如-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃或-10℃)长期储存长达约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间时，本发明的组合物保持改善的稳定性和/或聚集性质。

在一个实施方式中，本发明的组合物还包含渗透增强剂。许多化学渗透增强剂是在本领域中公知的并且可以在本发明的组合物中使用。这些包括，但不限于：水；醇，优选具有高达六个碳原子的醇，例如乙醇，二醇，例如醇二甘醇

N,N-二取代氨基乙酸烷基酯，例如N,N-二甲基-氨基乙酸十二烷基酯；酯，例如乙酸乙酯；氮酮

和衍生物；表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠；萜和类萜，例如d-柠檬烯；脂肪酸，例如油酸；脲和衍生物，例如1,3-二苯基脲；吡咯烷酮，例如N-甲基-2-吡咯烷酮；吡咯烷酮羧酸，如2-吡咯烷酮-5-羧酸；环糊精，例如β-环糊精；亚砜，例如二甲亚砜。其他皮肤渗透增强剂对于技术人员来说是公知的。在一个实施方式中，皮肤渗透增强剂选自

肉豆蔻酸异丙酯和氮酮中的一种或多种。

因而，在一个实施方式中，本发明涉及一种如上文所述的组合物，其还包含

如在实施例中所示，已证实包含

的组合物显示出改善的渗透性并保持良好的稳定性。

的浓度可以是约1-60％、例如约40％。

在一个实施方式中，本发明涉及一种如上文所述的组合物，其具有超过10％，例如11％、12％、13％、14％、15％或更高的丙二醇浓度。如在实施例中所示，已证实含有较高浓度的丙二醇的组合物显示出改善的渗透性并保持良好的稳定性。

在一个实施方式中，本发明的组合物含有胶凝剂以增加用于局部施用的组合物的粘度。其可以选自卡波姆、泊洛沙姆或纤维素衍生物，如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素。胶凝剂的浓度可以是0.5％至20％。在一个实施方式中，胶凝剂是泊洛沙姆。泊洛沙姆的浓度例如选自0.5％至20％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

在一个实施方式中，本发明的组合物包含渗透增强剂和胶凝剂，例如

和泊洛沙。

在进一步的实施方式中，本发明涉及

a)有效量的单域抗体，所述单域抗体包含能够结合人IL-17A的V_H结构域，其中所述V_H结构域包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，

b)约100mM的Tris/甘氨酸，

c)约125mM的L精氨酸/谷氨酸，

d)约10％的山梨醇，和

e)约14％的丙二醇

其中所述组合物的pH为7.5至8.5，例如8。

在进一步的实施方式中，本发明涉及

b)约100mM的Tris/甘氨酸，

c)约125mM的L精氨酸/谷氨酸，

d)约10％的山梨醇，

e)约6％的丙二醇，和

f)约20％的

其中所述组合物的pH为7.5至8.5，例如8。

在本发明的一些实施方式中，组合物可以含有防腐剂。防腐剂可以选自苯酚、间甲酚、苯甲醇、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯氧乙醇和尼泊金甲酯。

在一些实施方式中，组合物可以含有抗氧化剂。在一些实施方式中，抗氧化剂选自下组：甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂。

在一个实施方式中，本发明的组合物包含下述赋形剂中的一种或多种：氮酮、B-环糊精、苯甲醇、单硬脂酸甘油酯、PEG 100硬脂酸酯、己二醇、组氨酸、羟丙基纤维素、肉豆蔻酸异丙酯、液体石蜡(轻质矿物油)、中链甘油三酯(captex 300)、水杨酸甲酯、N-甲基-2-吡咯烷酮、辛基十二烷醇、油醇、泊洛沙姆，例如泊洛沙姆-407、聚乙烯醇、山梨酸钾、脯氨酸、没食子酸丙酯、吡咯烷酮羧酸、失水山梨糖醇单油酸酯(司盘80)、山梨糖醇单硬脂酸酯(司盘60)、硬脂醇聚醚-20(steareth-20)、硬脂酸、Tefose 63、

三醋精、硬脂醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-2(steareth-2)、二甲亚砜、辛基十二烷醇、Captex 300、聚山梨醇酯80、司盘80、脯氨酸、轻质矿物油或Arlacel 165。

可用于本发明组合物的其他设想的赋形剂包括例如抗微生物剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质(如磷脂或脂肪酸)、类固醇(如胆固醇)、明胶、酪蛋白、成盐抗衡离子(如钠)等。这些和其他已知的药物赋形剂(如适用于本发明制剂中的生理学上可接受的运载体和/或添加剂)是本领域公知的，例如在通过引用并入本申请的The Handbook ofPharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等编著，American PharmaceuticalsAssociation(2003)；以及通过引入并入本申请的Remington:the Science and Practiceof Pharmacy，第21版，Gennaro编著，Lippincott Williams&Wilkins(2005)中列出的。术语“生理学上可接受的运载体”指对所治疗的宿主不具有明显有害的影响并且保持与其一起施用的化合物的治疗性质的运载体。

在一些实施方式中，本发明的组合物还包含如表3中所示的一种或多种赋形剂。因而，赋形剂选自

硬脂醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-2、辛基癸醇或肉豆蔻酸异丙酯中的一种或多种。

在一个实施方式中，将如上文所述的本发明的组合物制成用于向皮肤、牙龈或眼部表面局部施用的制剂。因而，所述组合物是液体、凝胶、混悬剂、软膏、乳膏、乳液等形式。

在另一个实施方式中，将如上文所述的本发明的组合物冷冻干燥或喷雾干燥。在一个实施方式中，冷冻干燥或喷雾干燥的组合物包含上述列出的成分，但是不含丙二醇和/或山梨醇。

如上所述，本发明提供了一种冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，所述组合物包含有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单域抗体和10-150mM的Tris/甘氨酸，其中所述组合物的pH是约5至约9。在本发明组合物的一个实施方式中，Tris/甘氨酸的浓度是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。在本发明组合物的一个实施方式中，Tris/甘氨酸的浓度是约50至约150mM，例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。在一个实施方式中，浓度是约90至110mM。在一个实施方式中，浓度是约100mM。在一个实施方式中，组合物还包含50-150mM的L-精氨酸/谷氨酸，其中所述组合物的pH是约5至约9。在本发明组合物的一个实施方式中，L-精氨酸/谷氨酸的浓度是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。在本发明组合物的一个实施方式中，L-精氨酸/谷氨酸的浓度是约50至约150mM，例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。在一个实施方式中，浓度是约90至110mM。在一个实施方式中，浓度是约125mM。

在本发明的冷冻干燥或喷雾干燥组合物的一个实施方式中，所述组合物包含

b)约100mM的Tris/甘氨酸，和

c)约125mM L精氨酸/谷氨酸，和

其中所述组合物的pH为7.5至8.5，例如8。

在冷冻干燥或喷雾干燥的组合物中，IL-17A结合分子是如本申请的其他位置中所述的。例如，IL-17A结合分子包含至少一种单域抗体，所述单域抗体包含能够结合人IL-17A的V_H结构域。在另一个实施方式中，所述V_H结构域包含SEQ ID NO:4的CDR3。在另一个实施方式中，所述V_H结构域包含SEQ ID NO:1或与其具有至少50％、60％、70％或75％同源性的序列。在另一个实施方式中，所述V_H结构域包含选自表1以及如SEQ ID NO:5至73或SEQ IDNO:74的任意一个中所定义的V_H结构域。

使用一种或多种可接受的赋形剂/复溶剂将本发明的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物复溶。例如，可以包含渗透增强剂，如丙二醇。

在另一个方面中，因此本发明涉及一种复溶的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，所述组合物包含如上文所描述的组合物，并且还包含丙二醇，例如4-30％(例如，4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)的浓度的丙二醇。在一个实施方式中，浓度是约5-15％、10％-15％、15％-20％或20％至25％。在一个实施方式中，浓度是约6％或14％。

在一个实施方式中，将冷冻干燥或喷雾干燥的组合物复溶用于局部施用。在一个实施方式中，复溶赋形剂选自L-精氨酸/谷氨酸、山梨醇和/或丙二醇中的一种或多种。

在一个实施方式中，复溶赋形剂包含50-150mM的L-精氨酸/谷氨酸，例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM的L-精氨酸/谷氨酸；5-15％的山梨醇，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的山梨醇和/或4-30％的丙二醇，例如4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的丙二醇。

优选地，所述组合物的pH为5至9，例如7.5至8.5，例如8。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于制备供局部施用的复溶制剂的方法，所述方法包括提供如上文所述的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，并加入可接受的赋形剂/复溶剂，例如渗透增强剂，如丙二醇。丙二醇可以以4-30％(例如4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)的浓度加入。在一个实施方式中，浓度是约5-15％、10％-15％、15％-20％或20％至25％。在一个实施方式中，浓度是约6％或14％。

在一个实施方式中，当在室温下(在约20℃至约25℃之间)或在降低的温度下(低于约10℃，约2℃至约8℃之间，例如在5℃下)长期储存长达约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间时，本发明的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物保持改善的稳定性和聚集性质。

在另一个实施方式中，当在约0℃至约8℃之间(例如，在约5℃)的温度下储存一段时间(如长达约1周、长达约2周、长达约3周、长达约1个月、长达约2个月、长达约3个月或长达约6个月)时，本发明的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物保持改善的稳定性和/或聚集性质。

在另一个实施方式中，当在降低的温度下(例如0℃或以下，如0℃至-70℃，如-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃或-10℃)长期储存长达约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间时，本发明的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物保持改善的稳定性和/或聚集性质。

在一个优选的实施方式中，当在约20℃至约25℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)下长期储存一段时间(例如长达约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年)时，本发明的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物保持改善的稳定性和/或聚集性质。

本发明还涉及一种用于预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括向对象施用本发明的组合物。

用于治疗目的的术语“对象”包括任何对象，并且优选的是需要治疗目标病理状况(例如，自身免疫性疾病)的对象。用于预防目的时，对象可以是任何对象，并且优选的是具有目标病理状况(例如，自身免疫性疾病)进展风险或该病况易于进展的受试者。术语“对象”旨在包括活的生物体，例如原核生物和真核生物。对象的实例包括哺乳动物，例如人、犬、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、家兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明特定的实施方式中，对象是人。

更具体地，本发明涉及一种用于预防和/或治疗选自由本申请所列疾病和病症组成的非限制性组的疾病的方法，所述方法包括向需要其的对象施用药学上活性量的本发明的结合分子或药物组合物。基于本公开的内容，本领域技术人员将知晓能够根据本发明治疗的免疫相关疾病的实例，并且例如包括自身免疫性疾病、炎症病况、过敏和过敏症、过敏反应、严重感染，和器官或组织移植排斥。

本发明还涉及用于治疗疾病的本发明的组合物。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗选自由本申请所列疾病和病症组成的非限制性组的疾病的本发明的组合物。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自由本申请所列疾病和病症组成的非限制性组，例如自身免疫性疾病、炎症病况、过敏和过敏症、过敏反应、严重感染，和器官或组织移植排斥。

根据上述不同的方面，所述疾病可以选自下述非限制性列表：银屑病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脊柱关节病、系统性硬化症、特发性炎性肌病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病，如多发性硬化症、特发性脱髓鞘多神经病或古兰-巴雷综合征(GuillainBarre syndrome)和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病，如传染性、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠病、麸质敏感性肠病和惠普尔病(Whipple's disease)、包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎的自身免疫性或免疫介导的皮肤病、过敏性疾病，如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫性疾病，如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏性肺炎、自身免疫性血液病(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少症)、自身免疫性炎性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征)、包括移植排斥和移植物抗宿主病的移植相关疾病。

本发明的组合物还用于治疗、预防或改善哮喘、支气管炎、尘肺病、肺气肿和其他气道阻塞性或炎性疾病。

在一个优选的实施方式中，所述疾病是皮肤病。在一个实施方式中，所述疾病选自银屑病、脊柱关节病、葡萄膜炎、牙龈炎、特应性皮炎和哮喘。

本发明的组合物可用于治疗由IL-17介导的、或涉及IL-17产生或由IL-17导致的TNF释放促进的不需要的急性和超急性炎性反应，例如急性感染，例如脓毒性休克(例如，内毒素性休克和成年呼吸窘迫综合征)、脑膜炎、肺炎；和重度烧伤；以及用于治疗与病态TNF释放有关的、由感染、癌症或器官功能障碍引起的恶病质(cachexia)或消耗综合征(wasting syndrome)，尤其是例如与HIV感染有关或由HIV感染引起的AIDS相关的恶病质。

本发明的组合物尤其可用于治疗骨代谢疾病，包括骨关节炎、骨质疏松和其他炎性关节炎，以及一般性骨丧失，包括年龄相关的骨丧失，尤其是牙周病。

本发明的组合物可以作为唯一活性成分施用或者与一种或多种其他药物(例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其他抗炎药)组合施用，例如用于治疗或预防上述疾病。例如，本发明的结合分子可以与下列各项组合使用：免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80或CD86)的单克隆抗体或其配体；其他免疫调节化合物，例如具有CTLA4的细胞外结构域的至少一部分或其突变体的重组结合分子，例如与非CTLA4蛋白序列连接的CTLA4的至少细胞外部分或其突变体，例如CTLA4Ig(例如，称为ATCC 68629)或其突变体，例如LEA29Y；粘附分子抑制剂，例如LFA-I拮抗剂、ICAM-I或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗药，例如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、多柔比星或5-氟尿嘧啶；抗TNF剂，例如TNF的单克隆抗体，例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、CDP870、或TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如依那西普

PEG-TNF-RI；促炎性细胞因子的阻断剂、IL-I阻断剂，例如阿那白滞素或IL-I捕获剂、AAL160、ACZ885、IL-6阻断剂；趋化因子阻断剂，例如蛋白酶(如金属蛋白酶)的抑制剂或活化剂、抗IL-15抗体、抗IL-6抗体、抗CD20抗体、NSAID(如阿司匹林或抗感染剂)。该列表不限于上述药剂。

本发明的组合物可以与其他药物在相同时间或不同时间施用，例如同时、单独或依次。

根据本发明的组合物特别地用于局部递送。因此，所述组合物优选地是乳膏、乳液、喷雾、粉剂、气雾、溶液、凝胶、软膏、糊剂、混悬液、乳液、泡沫等形式。

还可以将所述组合物作为膏药、贴片、生物粘合剂或敷料应用。因而，本发明还涉及包含本发明制剂的膏药、贴片、生物粘合剂或敷料。

在一个实施方式中，通过吸入的方式向肺部局部递送。因此，本发明的组合物作为气雾施用，或者特别是在喷雾干燥或冷冻干燥组合物的情况下直接作为粉末施用。

可以使用任何皮肤病学可接受的运载体配制组合物。示例性的运载体包括固体运载体，如氧化铝、粘土、微晶纤维素、二氧化硅或滑石粉；和/或液体运载体，如水、醇、二醇或水-醇/二醇的混合物。治疗剂还可以以允许治疗剂进入皮肤的脂质体制剂施用。

在特定的实施方式中，期望的是向需要治疗的区域局部施用组合物。

因而，在本发明所有方面的一个优选的实施方式中，本发明组合物的施用是通过向健康或患病皮肤的局部施用。结合分子能够至少穿透皮肤的外层，并且因此能够皮肤或透皮递送。因此，在本发明各个方面的一个实施方式中，将本发明的组合物或结合分子向皮肤的局部递送是直接递送至皮肤中以进行局部非全身暴露。在另一个实施方式中，将本发明的组合物或结合分子向皮肤的局部递送是直接递送至皮肤以便在渗透通过皮肤的所有层后提供全身暴露。

所治疗的皮肤可以是患病的或健康的皮肤。在一个优选的实施方式中，皮肤病是银屑病或特应性皮炎。

优选地，其所应用的表面积是体表面积的1％-30％，例如1％-10％或1-20％。因此，可以向体表面积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、27％、26％、28％、29％或30％施用。在一个实施方式中，疾病状态是轻度的。在另一个实施方式中，疾病状态是中度的。在另一个实施方式中，疾病状态是重度的。对于银屑病的治疗，向患病区域施用，所述患病区域通常是选自肘部、膝盖、手掌、头皮、脚底、生殖器、大腿上部、腹股沟、臀部、面部和躯干的一个或多个区域。对于特应性皮炎的治疗，向患病区域施用，所述患病区域通常是选自面部、上臂和手腕的一个或多个区域。

对特定病症或病况的治疗是有效的/有活性的本发明的结合分子的量将取决于所述病症或病况的性质，并且能够由标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体外或体内测定以协助确定最佳剂量范围。在组合物中所使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重程度，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。

本发明的组合物包含有效量的本发明的结合分子，以使得获得适宜的剂量。化合物的正确剂量将根据特定制剂、应用模式以及其特定部位、宿主和所治疗的疾病而改变。应考虑其他因素，如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度等。

根据一个实施方式，剂量包含如下活性分子的量：约1μg/kg、约10μg/kg、约20μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约250μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg或约11mg/kg(所述剂量所施用的哺乳动物的重量)。在一些实施方式中，剂量含有约20μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约250μg/kg、1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的活性分子。

给药方案可能取决于从业者希望实现的药代动力学衰减的模式。例如，在一些实施方式中，考虑每周给药1-4次。可以使用甚至更低频率的给药。在一些实施方式中，给药是每1周、每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每15周、每20周、每25周或更长时间施用一次。在一些实施方式中，给药是每1个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月或更长时间施用一次。通过常规技术和测定能够容易地监测这种疗法的进展。给药方案可以随时间而改变。

在用于医学治疗的本发明的组合物中使用的IL17结合分子是如本申请的其他地方所述的。例如，其可以选自包含如本申请所述的CDR1、CDR2和CDR3序列SEQ ID NO.2、3和4的V_H单域抗体。在一个实施方式中，V_H单域抗体选自表1。在一个实施方式中，V_H单域抗体包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，例如SEQ ID NO:74。

在另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒或制品，其包含可用于治疗上文所述疾病的本发明的组合物。所述试剂盒可以包含容器和任选的使用说明书，所述容器具有例如适于局部施用形式的目标组合物。在一个方面中，本发明提供了一种容器，例如喷雾器或吸入器，其包含本发明的组合物。在一个实施方式中，所述组合物是本发明的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物。在容器或试剂盒的组合物中使用的IL17结合分子是如本申请的其他地方所述的本发明的组合物。例如，其可以选自包含如本申请所述的CDR1、CDR2和CDR3序列SEQID NO.2、3和4的V_H单域抗体。在一个实施方式中，V_H单域抗体选自表1。在一个实施方式中，V_H单域抗体包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，例如SEQ ID NO:74。

在另一个方面中，本发明涉及缓冲液在制备制剂中的用途，所述缓冲液包含

a)50-150mM的Tris/甘氨酸，

b)50-150mM的L-精氨酸/谷氨酸

c)5-15％的山梨醇，和

d)4-30％的丙二醇

其中所述组合物的pH是约5至9，例如7.5至8.5，所述制剂包含有效量的能够结合人IL-17A的单域抗体，例如所述V_H结构域包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列的单域抗体。

在一个实施方式中，所述缓冲液包含

a)约100mM的Tris/甘氨酸，

b)约125mM的L-精氨酸/谷氨酸，

c)约10％的山梨醇，和

d)约6％的丙二醇

其中所述组合物的pH是7.5至8.5，例如约8。

在组合物中使用的IL17结合分子是如本申请的其他地方所述的。例如，其可以选自包含本申请所述的CDR1、CDR2和CDR3序列SEQ ID NO.2、3和4的V_H单域抗体。在一个实施方式中，V_H单域抗体选自表1。在一个实施方式中，V_H单域抗体包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，例如SEQ ID NO:74。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于制备用于治疗病症的制剂的方法，所述方法包括将有效量的能够结合人IL-17A的单域抗体加入缓冲液中，所述缓冲液包含

a)50-150mM的Tris/甘氨酸，

b)50-150mM的L-精氨酸/谷氨酸，

c)5-15％的山梨醇，和

d)4-30％的丙二醇。

在组合物中使用的IL17结合分子式如本申请的其他地方所述的。例如，其可以选自包含如本申请所述的CDR1、CDR2和CDR3序列SEQ ID NO.2、3和4的V_H单域抗体。在一个实施方式中，V_H单域抗体选自表1。在一个实施方式中，V_H单域抗体包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75％同源性的序列，例如SEQ ID NO:74。

在另一个方面中，本发明提供了一种如实施例和/或附图中所示的组合物。

除非在本申请中另外定义，与本公开内容结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管前述公开内容提供了在本发明的范围内包括的主题的一般说明，包括产生和使用本发明的方法以及其最佳方式，提供以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并且提供其全部书面说明。然而，本领域技术人员将会理解的是，这些实施例的细节不应被解释为限制本发明，其范围应当根据本公开内容所附的权利要求及其等价形式理解。考虑到本公开内容，本发明的各种另外的方面和实施方式对本领域技术人员来说将会是显而易见的。

在本说明书中提及的全部文献其全部内容通过引用并入本申请，包括对基因登录号的引用。

在本申请中使用的情况下，“和/或”应理解为具体公开了两个指定特征或组分中的每一种(在具有或不具有另一特征或组分的情况下)。例如，“A和/或B”应理解为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种，如同各自在本申请中单独给出一样。除非上下文另外指出，以上给出的特点的描述和定义不限于本发明的任何具体方面或实施方式并且等同地应用于全部所描述的方面和实施方式。

在非限制性实施例中进一步描述了本发明。

实施例

实施例1：V_H结构域的产生

1.1Tg/TKO小鼠的构建

如此前所述(WO2004/076618和WO2003/000737，Ren等，Genomics,84,686,2004；Zou等，J.Immunol.,170,1354,2003和WO2016/062990)产生在背景内的种系构建中携带重链抗体转基因基因座的小鼠，所述小鼠的内源性重链和轻链抗体的表达被沉默(三重敲除或TKO)。简言之，在使用酵母人工染色体(YAC)原核显微注射新鲜受精的卵母细胞之后得到转基因小鼠，所述酵母人工染色体(YAC)包含过量的人V_H、D和J基因以及缺乏C_H1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强剂和调控区。将转基因首建小鼠与缺乏内源性免疫球蛋白表达的动物回交以产生用于所述免疫接种研究的Tg/TKO品系。

1.2.用于免疫接种的抗原

免疫接种使用重组的纯化蛋白。重组人IL-17A购自Peprotech(Peprotech，目录号#AF-200-17)

1.3.免疫接种方案

在当前的情况下，将重组蛋白施用至Tg/TKO。简言之，8-12周龄的小鼠各自接受共计10μg的在完全弗氏佐剂中乳化并通过皮下递送的重组蛋白，随后使用1-10μg重组蛋白进行激发，该重组蛋白在不完全弗氏佐剂中乳化，也是通过皮下施用，并且在初始引发后的不同间隔给予。在不存在佐剂的情况下，腹腔内施用在磷酸盐缓冲盐水中的最终剂量的抗原。也可使用替代免疫接种途径和程序。例如，可以使用不同的佐剂或免疫增强程序替代弗氏佐剂。DNA免疫接种常常是肌内递送或通过基因枪(Genegun)递送。来自此类细胞的转染细胞或膜制品常常(但不是排他地)是腹腔内施用。

1.4.血清ELISA

在免疫接种期间和之后，从小鼠收集血清并通过ELISA确认是否存在对免疫原的重链抗体应答。使用5μg重组抗原/ml PBS溶液(50μl/孔)在4℃下将Nunc Maxisorp板(Nunc目录号443404)包被过夜。倒出抗原溶液后，使用补充有0.05％

20(sigma P1379)的PBS(用PBS片制备，Oxoid目录号BR0014G)洗板，随后使用未加入

的PBS洗板。为阻断非特异性蛋白相互作用，向孔中加入含3％脱脂奶粉(Marvel)的PBS溶液，并将板在室温下孵育至少1小时。在聚丙烯管或板中制备血清在3％脱脂奶粉/PBS中的稀释物，并在室温下孵育至少1小时，随后将其转移至封闭的ELISA板中，并再孵育至少1小时。然后用PBS/

随后用PBS重复洗涤以除去未结合的蛋白。之后，将在PBS/3％中制备的与生物素偶联的山羊抗小鼠IgG Fcγ亚类1特异性抗体(Jackson 115-065-205)溶液加入各孔中并在室温下再孵育至少1小时。通过使用PBS/

和PBS重复洗涤除去未结合的检测抗体。随后将在3％Marvel/PBS中的中性抗生物素蛋白-HRP溶液(Pierce 31030)加入ELISA板中并使其结合至少30分钟。在进一步洗涤后，使用TMB底物(Sigma目录号T0440)对ELISA进行显色，10分钟后通过加入0.5M H₂SO₄溶液(Sigma目录号320501)终止反应。通过在450nm下读数确定吸光度。还可以使用替代性的测定(如ELISPOT测定)以确认免疫接种诱导的重链抗体应答。

1.5.从免疫小鼠中产生文库

a.处理组织、提取RNA和生产cDNA

将来自每只免疫动物的脾脏、腹股沟和肱淋巴结收集到RNAlater中。对于每只动物而言，分别处理1/3的脾脏和4个淋巴结。首先，将组织匀浆；接下来将组织转移至Lysingmatrix D小珠试管(MP Bio目录号116913100)中，加入600μl的含β-巯基乙醇的RLT缓冲液(来自Qiagen

试剂盒，目录号74104)，随后在MP Bio Fastprep匀浆器(目录号116004500)中匀浆，使用6m/s的40秒循环。将含有匀浆组织的试管转移至冰上，以10g微量离心5分钟使碎片沉淀。移出400μl上清液用于RT-PCR。

首先，首先根据生产厂商的方案使用Qiagen

试剂盒目录号74104提取RNA。然后使用Superscript III RT-PCR高保真试剂盒(Invitrogen目录号12574-035)，将每个RNA样品用于制备cDNA。对于每个脾脏和LN RNA样品，进行5次RT-PCR反应，每次使用VH_J/F(长)引物以及针对每个存在的V_H家族的引物。根据下述试管反应组分，制备用于RT-PCR反应的混合物。

12.5μl 2x反应混合物

0.5μl正向引物(10μM)

0.5μl反向引物(10μM)

0.5μl酶混合物

500ng–1μg RNA

用水加至25μl

使用下述条件在热循环仪中进行RT-PCR反应；

50℃ 20min

94℃ 2min

35个循环94℃ 15sec

58℃ 30sec

68℃ 30sec

68℃ 5min

在4℃下保持

通过凝胶电泳确认在370bp范围内的产物。

对于每只小鼠，随后集中由1/3个脾脏和4个淋巴结的每一个扩增的给定家族的V_H产物，以用于使用Thermo/Fermentas GeneJet PCR纯化试剂盒(目录号K0702)进行的纯化，所述试剂盒根据生产厂商的说明书使用，并且其中将产物洗脱到50μl水中。

b.克隆到噬菌体载体中

在这些研究中使用噬菌体载体pUCG3。如所示的，可以使用常规方法将V_H克隆至pUCG3，所述常规方法涉及利用NcoI和XhoI的限制性酶消化、连接和转化。或者，可以使用基于PCR的方法构建V_H噬菌体文库。可以将这两种方法用于从扩增的V_H序列产生文库。前一种方法是本领域广泛使用的。将具有GC缓冲液的Phusion高保真PCR混合物(目录号F532L，NEB)用于PCR反应，其中含有下述试剂；

所使用的循环条件是

98℃ 30秒

10个循环

98℃ 10秒

58℃ 20秒

68℃ 2分30秒

20个循环

98℃ 10秒

58℃ 20秒

68℃ 3分钟

68℃ 5分钟

4℃保持

根据生产厂商的说明书，使用Fermentas GeneJet凝胶纯化试剂盒(目录号K0691)对PCR产物(3152bp)进行凝胶纯化，在40μl洗脱缓冲液中进行最后的洗脱。将纯化的V_HRT-PCR产物作为大引物与线性化的pUCG3一起使用，以获得用于基于下述反应的转化和文库形成的噬菌体产物；

PCR按照如下所示进行；

在10℃下保持

在1％的琼脂糖凝胶上分析PCR产物。

根据生产厂商的说明书，使用Ferment作为PCR纯化试剂盒(目录号K0702)纯化不同家族的V_H/噬菌体产物，在25μl H₂O中进行最终的洗脱，并将其用于转化TG1E.coli(Lucigen，目录号60502-2)，所述转化使用

10x 1mm比色杯(

目录号165-2089)、

Eporator和预热的回收培养基(Lucigen，专利混合物)通过电穿孔进行。将2μl的纯化产物加入25μl细胞中进行电穿孔，对于每个V_H/噬菌体产物在1800v下进行至多10次电穿孔。将电穿孔的细胞集中并回收在50ml Falcon管中，在37℃、150rpm下振荡孵育1小时。进行转化物的等份样品的10倍系列稀释，并涂布在含有补充了2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄西林的2xTY琼脂的皮氏培养皿中。使用在这些培养皿上得到的菌落来评价文库规模。将剩余转化物涂布在含有补充了2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄西林的2xTY琼脂的大型生物测定皿上。所有琼脂平板在30℃下孵育过夜。向大型生物测定皿中加入10ml2xTY肉汤，刮下菌落并在OD600下测量(OD 1.0＝5x 10⁸个细胞/ml)。等份样品在加入50％v/v甘油溶液(50％)之后在-80℃下的冻存管中保存，或直接用于噬菌体选择过程。

在一些情况下，直接挑取克隆并确定序列以给出对文库多样性的估计。通常地，对于每只小鼠，构建具有大于1e8个重组体的噬菌体展示文库，以完全体现在该小鼠中的V_H多样性。然后，构建天然V_H文库。根据公开的方法进行文库噬菌体原种的制备和噬菌体展示选择(Antibody Engineering，Benny Lo编著，第8章，p161-176，2004)。

使用结合ELISA测定对来自不同选择的V_H进行筛选，以鉴定具有中和性质的特定V_H。还检测了V_H(纯化的和粗的周质提取物)抑制IL-17A与重组IL-17RA-Fc相互作用的能力。

开发了一项用以测量IL-17A结合V_H抑制IL-17A诱导的IL6从细胞系HT1080(ECACC目录号85111505)中释放的能力的测定。在含有Earles盐且补充有非必需氨基酸、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的MEM中使细胞系保持指数生长，并且在37℃、5％CO₂下的湿润培养箱中培养。为了进行测定，以50,000个细胞/孔将细胞接种在96孔平底组织培养板中并培养过夜。制备纯化V_H的系列稀释物并使用补充有10ng/ml IL-17A(Peprotech目录号AF200-17)的培养基/PBS在37℃下孵育1小时。孵育后，将V_H/IL-17A混合物(或适宜的对照)转移至HT1080细胞中(已将培养基从HT1080细胞吸去)，并在CO₂培养箱中再孵育5小时。收集细胞培养物上清液，并使用IL-6Duoset(R&D Systems，目录号DY206)按照生产厂商的说明书对IL6进行测定。在

T200仪器上测量抗-IL-17AV_H抗体的结合动力学。在进行上述筛选级联之后，鉴定出表现出抑制性质的与IL-17A结合的V_H结构域。优化该V_H结构域，产生如SEQ ID No.1所示的V_H结构域。通过将先导V_H与相同谱系的其他成员比对来进行优化，以鉴定在免疫应答期间靶向的体细胞高变热点。由于具有更慢的解离速率，优化的V_H显示出改善的对IL-17的亲和性和改善的在IL-17细胞基测定中的效力。通过如上文所述的ELISA对本申请公开的V_H结构域进行表征以确定结合特异性。多个V_H结构域，包括如SEQ IDNO:1中所示的V_H结构域，显示出良好的对人IL-17A的结合性质。鉴定出的V_H未显示与近亲(如IL-17C和IL-17F)发生交叉反应。编码SEQ ID NO:1的核酸如下所示。

GAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCAAGACGGTTCTGTTCAGTATTATGTCAGCGACGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC(SEQ ID NO:76)

实施例2：原料药赋形剂筛选

2.1.制备原料药缓冲液制剂：组合物各部分的浓度和pH

进行使用V_H1.1(SEQ ID NO:74)的初始相容性筛选，以鉴定最佳原料药缓冲液赋形剂和最佳pH。V_H1.1的最佳pH范围鉴定为pH 7.5至8.5，优选8.0。然后，使用筛选研究后接实验设计(DOE)以考察在该pH下在多种不同缓冲液物质中不同浓度下的V_H1.1制剂。

最初在加速条件下(高温)进行制剂筛选研究。使用目测外观、UV分析(浓度和光散射)、SE-HPLC、NR SDS PAGE、RP HPLC、AIEX和结合ELISA进行分析。在初始加速稳定性研究中对V_H1.1进行测试，以便在宽的pH范围内对缓冲液进行评价。然后，在单一浓度下在具有和不具有五种赋形剂的情况下进行测试。观察到更高pH(约pH 8.0)的缓冲液改善CB001的稳定性，如通过SE-HPLC和AIEX-HPLC和ELISA所测得。在该筛选中所测试的赋形剂中，丙二醇还显示出增加产品的稳定性。通过在2-8℃下延长该研究至1个月而确证了稳定性，在研究中未观察到降解。

然后在具有核不具有另外的待测赋形剂的情况下，使用在最佳pH附近的替代缓冲液进行进一步的加速、筛选、稳定性研究。在缓冲剂中，仅样品Tris/甘氨酸和磷酸盐/柠檬酸盐显示出超出其他测试缓冲剂的改善的稳定性。100mM的浓度还显示出提供更高的稳定性。在DoE研究中对来自该研究的两个缓冲系统进行了进一步测试。其评价了具有不同水平的四种不同赋形剂(丙二醇、L-精氨酸/L-谷氨酸、泊洛沙姆和山梨醇)中的一种的缓冲剂。然后，选择Tris-甘氨酸作为最终的缓冲系统，因为其与磷酸盐/柠檬酸盐系统相比显示出更一贯稳定的单体水平。根据DoE分析，预测下述制剂是最稳定的：100mM Tris/甘氨酸、125mM Arg/glu、10％山梨醇、15％丙二醇，pH8.0。然后，在6周的加速稳定性研究中，该制剂相比于在DoE分析后预测是稳定的3种其他组合进行进一步测试。不同制剂在加速稳定性研究中进行了测试，并通过SE-UPLC、UV A280nm和目测外观进行了考察。在统计建模后，选择了四种最佳原料药缓冲液(DSB)制剂(如表2a和表2b所示)。

如在本申请中所使用的，术语原料药缓冲液指不含活性IL-17结合分子的无活性缓冲液。如在本申请中所使用的，术语原料药(DS)指含有与人IL17A结合的活性分子和原料药缓冲液的制剂。

表2a：来自初始DOE的最佳制剂缓冲液

如下所示配制制剂1。

加入所有组分后，根据需要使用HCl或NaOH将pH调节至8.0。

表2b：#1的配方

如表2中所示的四种组合在6周加速稳定性研究中进行了测试，并使用SE-UPLC、AIEX-HPLC、RP-HPLC、UV A280nm、SDS PAGE&ELISA进行了分析。实验数据表明包含100mMTris/甘氨酸、125mM L-精氨酸/谷氨酸、6％丙二醇、10％山梨醇，pH 8.0的制剂是稳定的并显示出减少的聚集，如图1所示。

2.2.针对DS的长期稳定性筛选

在100mM Tris/甘氨酸、125mM L-精氨酸/谷氨酸、6％丙二醇、10％山梨醇，pH 8.0中以40mg/mL制备大批量V_H 1.1(DS)，并且其在多个温度下具有长期稳定性。对样品进行下述分析：pH、UV A280nm、SE-UPLC、RP-UPLC、AIEX-HPLC、SDS PAGE、ELISA、内毒素和生物负荷。表明DS在2-8℃下贮存3个月具有良好稳定性的示例性数据示于图2和图3中。

原料药缓冲液中40mg/mL的V_H1.1显示出2,386mOsm/kg的渗透压(通过冰点下降法测得的渗透压)，高于生理水平。血液/血清的正常渗透压为约300-310mOsm/L。

实施例3：用于局部施用的制剂的进一步研发

3.1相容性测试

在加速稳定性研究中测试赋形剂/制剂组分与用于局部制剂的活性分子的相容性，使用SE-HPLC评估。在稳定性和有效性研究中对制剂进行了进一步测试，参见表3和表4。

表3：前7种入选的局部制剂-母体组合物

材料

1

2

3

4

5

6

7

母体制剂

50％

原料药(40mg/mL)

50％

共计

100％

[VH1.1](mg/mL)

20

表4：前7种入选的局部原料药(DS)制剂-活性组合物

材料	1	2	3	4	5	6	7
								Tris/甘氨酸	mM	100	80	75	85	85	75
L-精氨酸/谷氨酸	mM	125	100	93.75	106.25	106.25	93.75
								丙二醇	％	6	4.8	29.5	5.1	5.1	4.5
山梨醇	％	10	8	7.5	8.5	8.5	7.5

表5：在如表3所示的前7种入选的局部制剂中原料药缓冲液组分的终浓度

其中原料药缓冲液是100mM Tris/甘氨酸、125mM L-精氨酸/谷氨酸、6％丙二醇、10％山梨醇，pH 8.0，原料药是在原料药缓冲液中40mg/mL V_H 1.1。这些通过使用SE-HPLC的加速稳定性研究进行了评估，并且使用体外3D皮肤构造评价了有效性和渗透效能(亦参见第2.2章)。

这些研究表明制剂1-6均显示出体外有效性和渗透性，制剂1、2和3显示出优越的渗透性，其中制剂1和3具有最高稳定性。

3.2体外有效性：MatTek模型(DS和其他制剂的体外有效性)

使用基于MatTek 3D银屑病组织模型(Ayehunie,2012)的模型。使用正常人表皮角质形成细胞和银屑病成纤维细胞培养银屑病组织模型。重建的银屑病组织具有银屑病表型，如通过增加的基底细胞增殖、银屑病相关的生物标记物的表达和增加的细胞因子释放所证实(MatTek Corporation,2016)。将通过加入IL-17A改良的MatTek 3D银屑病组织模型用于在测试缓冲液和原料药缓冲液中V_H 1.1的有效性测试。

已证实向模型中加入IL-17A(通过培养基)进一步上调银屑病表型，如通过基因表达(注意到CCL20、CXCL5、HBD-2、IL-8和银屑素的基因表达显著上调(>2倍))和细胞因子/趋化因子释放(注意到CCL20、CXCL6、IL-6、IL-8和TNF-α的细胞因子/趋化因子产生显著增加)所证实。然后将这种上调的模型用于在该模型中V_H 1.1的有效性测试。

将组织局部或全身地(即，通过加入培养基进行基底外侧递送或加入组织构造的顶表面)暴露于在预备缓冲液(50mM Tricine)pH8.0中的V_H 1.1。将组织处理4天并且在48和96小时时评估。使用标准RNA分离方案分离RNA用于基因分析。进行定量RT-PCR以确定6个银屑病和皮肤相关基因的表达水平。另外，使用市售试剂盒评估趋化因子/细胞因子水平。结果表明这些银屑病标记物均能够显著降低，因此证明了V_H 1.1在该模型中的有效性(图4和图5)。

选择CCL20用于对局部制剂的进一步研究，因为其显示出明显的剂量依赖性效应并且是临床相关的生物标志物。然后扩展研究以进一步评价当局部加入V_H 1.1(作为如上所述的原料药)时具有作用所需的剂量。

连续4天每天加入V_H 1.1，随后是培养基交换24小时，详情如表6中所述。将培养基保存在-80℃下直至进行分析。

表6：用于在MatTek模型中进行局部加入的实验设计

然后，随后的研究证实了甚至低剂量局部加入含V_H 1.1的测试缓冲液(50mMTricine)pH 8.0就抑制了CCL20(图8)，并将该研究设计用于比较7种药品(DP)制剂(图9)。

根据表2至4将V_H 1.1制剂。然后使用如下测定测量组织构造的渗透：如图6中所述的FRET测定，或者利用由抗生物素蛋白链菌素包被的小珠捕获的生物素化2型抗独特型Fab(在具有或不具有IL-17A的条件下结合V_H 1.1)的Gyros测定。然后使用荧光团标记的家兔抗V_H 1.1pAb进行检测，如图7所示。

由生物素化IL-17V_H与家兔多克隆抗V_H抗体的结合形成荧光共振能量转移(FRET)复合物。使用抗生物素蛋白链菌素铕-穴状化合物作为供体荧光团以及使用山羊抗家兔-Alexa Fluor-647作为受体荧光团在FRET复合物中进行这种相互作用的检测。一旦形成复合物，供体荧光团的激发导致其向受体荧光团的FRET，因为其非常接近。然后测量时间分辨受体荧光团发射。

可以将该测定用于检测竞争形式的非生物素化的IL-17V_H。IL-17V_H与生物素化的IL-17V_H竞争结合家兔多克隆抗V_H抗体，从而导致来自受体荧光团的荧光发射减少。竞争的程度取决于IL-17V_H的浓度。使用在存在已知浓度的纯化IL-17V_H的情况下的发射信号的标准曲线对测试样品中存在的V_H的量进行定量。由于竞争测定形式，定量的线性范围限的，因而在多个稀释度下对样品进行测试以确保其在该范围内。

制剂1-6均显示出良好的皮肤渗透性，其中制剂1-3显示出最高水平的皮肤渗透性(图10)。

实施例4：其他药品的研发

使用

(制剂2中的渗透增强剂)；丙二醇(制剂3中的渗透增强剂)进行了其他研发。

使用不同浓度的这些赋形剂以及含V_H 1.1的原料药缓冲液进行初始加速稳定性研究(使用SE-UPLC测定)，以确定DOE中使用的实际范围。此外，确定生产轻质凝胶所需的泊洛沙姆407的范围。其中原料药缓冲液为100mM Tris/甘氨酸、125mM L-精氨酸/谷氨酸，6％丙二醇，10％山梨醇，pH 8.0；其中相应地调整组分。在加入PG的情况下，表7中显示的值是终浓度，所述终浓度经校正以包含已经在DSB中的量。

随后，选择具有不同V_H浓度(分别为20mg/mL和30mg/mL)以及原料药(分别为20、30和40mg/mL)的两个制剂(表7)进行长期稳定性研究，通过SE-UPLC和AIEX-HPLC进行测量。

表7：药品制剂

所有制剂在5℃下(图11)和在更低的温度下(图12和图13)均是稳定的。结果还表明高PG浓度在稳定性方面提供一些额外的益处。

喷雾干燥和冻干制剂

将V_H 1.1制剂喷雾干燥或冻干以生产能够长期保存并且能够随后在使用时复溶的散装(bulk)原料药。复溶允许在复溶溶液中使用具有有益性质(例如，增强渗透性或粘度)的其他赋形剂。例如，可以将不太适于长期贮存的赋形剂(例如，由于稳定性有限，特别是在升高的温度下)包含在复溶溶液中。

在一个实例中，将如上文所述的原料药喷雾干燥或冻干。或者，将在缓冲液中配制的活性分子喷雾干燥或冻干，其中所述缓冲液对应于原料药缓冲液，但不包含PG和/或山梨醇。可以在用以将喷雾干燥或冻干制剂复溶的复溶溶液中使用PG和/或山梨醇。图14显示了在1个月的时程中在不含PG的DSB中V_H 1.1的稳定性测试结果。结果表明了所述制剂在-70℃下达1个月的良好稳定性。

参考文献

Ayehunie,S.e.(2012).Development and characterization 3D psoriatictissue model.JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY.,Vol.132.75.

MatTek Corporation.(2016,06 16).Psoriasis-Application-Note.Retrievedfrom www.mattek.com:https://www.mattek.com/wordpress/media/Psoriasis-Application-Note.pdf

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含

a）有效量的至少一种能够结合人IL-17A的单可变重链结构域抗体，

b）10-150 mM的Tris-甘氨酸，

其中所述组合物的pH是5至9，

其中所述单可变重链结构域抗体包含具有SEQ ID NO: 2的CDR1、具有SEQ ID NO: 3的CDR2和具有SEQ ID NO: 4的CDR3。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述单可变重链结构域抗体包含SEQ ID NO: 1或与其具有至少75%同源性的序列，并且所述单可变重链结构域抗体包含具有SEQ ID NO:2的CDR1、具有SEQ ID NO: 3的CDR2和具有SEQ ID NO: 4的CDR3。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含下述赋形剂中的一种或多种：0.1-150 mM的L-精氨酸谷氨酸、0.1-15%的山梨醇和0.1-30%的丙二醇。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，所述组合物包含50-150 mM的Tris-甘氨酸、50-150 mM的L-精氨酸谷氨酸、5-15%的山梨醇和4-30%的丙二醇，其中所述组合物的pH是5至9。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，所述组合物包含100 mM的Tris-甘氨酸、125 mM的L-精氨酸谷氨酸、10%的山梨醇和6%的丙二醇，其中所述组合物的pH是7.5至8.5。

6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述同源性是至少80%。

7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述同源性是至少85%。

8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述同源性是至少90%。

9.根据权利要求2所述的组合物，其中所述同源性是至少95%。

10.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述单可变重链结构域抗体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:74。

11.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于局部施用。

12.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，所述组合物还包含渗透增强剂。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述渗透增强剂选自Transcutol®、硬脂醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-2、辛基癸醇或肉豆蔻酸异丙酯。

14.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，所述组合物还包含粘度调节剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述粘度调节剂是泊洛沙姆。

16.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述单可变重链结构域抗体的浓度是10 mg/ml至50 mg/ml。

17.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物在2-8°C、-20°C或-70°C下储存至少1个月后是稳定的。

18.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物在2-8°C、-20°C或-70°C下储存至少2个月后是稳定的。

19.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物在2-8°C、-20°C或-70°C下储存至少3个月后是稳定的。

20.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物在2-8°C、-20°C或-70°C下储存至少6个月后是稳定的。

21.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物在2-8°C、-20°C或-70°C下储存至少12个月后是稳定的。

22.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物在制备用于治疗银屑病的药物中的用途。

23.一种冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，所述组合物包含

a）有效量的至少一种单可变重链结构域抗体，所述单可变重链结构域抗体包含能够结合人IL-17A的V_H结构域，和

b）10-150 mM的Tris-甘氨酸，

其中所述组合物的pH是5至9，

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述单可变重链结构域抗体包含SEQ ID NO:1或与其具有至少75%同源性的序列，且其中所述单可变重链结构域抗体包含具有SEQ IDNO: 2的CDR1、具有SEQ ID NO: 3的CDR2和具有SEQ ID NO: 4的CDR3。

25.根据权利要求24所述的组合物，所述组合物还包含0.1-150 mM的L-精氨酸谷氨酸。

26.根据权利要求24或25所述的组合物，所述组合物包含100 mM的Tris-甘氨酸和125mM的L-精氨酸谷氨酸，其中所述组合物的pH是8。

27.一种容器，所述容器包含权利要求1至21或者权利要求23至26中任意一项所述的组合物。

28.一种复溶的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，所述组合物包含根据权利要求23至26中任意一项所述的组合物，还包含复溶剂。

29.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至21、23至26或28中任意一项所述的组合物以及任选的使用说明书。

30.一种用于制备供局部施用的复溶制剂的方法，所述方法包括提供根据权利要求23至26中任意一项所述的组合物，以及添加复溶剂。

31.一种供局部施用的乳膏、乳液或凝胶，所述乳膏、乳液或凝胶包含根据权利要求1至21中任意一项所述的组合物。

32.一种制备权利要求1至21中任意一项所述的组合物的方法，所述方法包括将赋形剂与能够结合IL-17A的单域抗体组合。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述单域抗体包含SEQ ID NO: 1或与其具有至少75%同源性的序列，且其中所述单可变重链结构域抗体包含具有SEQ ID NO: 2的CDR1、具有SEQ ID NO: 3的CDR2和具有SEQ ID NO: 4的CDR3。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述赋形剂包含10-150 mM的Tris-甘氨酸。

35.一种乳膏、粉剂、乳液、凝胶、敷料或贴片，所述乳膏、粉剂、乳液、凝胶、敷料或贴片包含根据权利要求1至21或28中任意一项所述的组合物。

36.一种供局部施用的液体，所述液体包含根据权利要求1至21中任意一项所述的组合物。

37.一种膏药，所述膏药包含根据权利要求1至21或28中任意一项所述的组合物。