CN109536546A - 一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中小分子量燕麦β–葡聚糖的制备方法和应用。所述的制备方法包括使用酶对底物进行酶解反应；其中：所述的酶包括β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶，所述的底物包括待酶解燕麦β–葡聚糖，所述底物的浓度为0.5％～10％，所述的百分比为质量百分比；所述酶与所述底物的质量比为1:(100～100000)；所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为60000道尔顿以下。本发明首次发现燕麦β‑葡聚糖具有促进HaCaT细胞中caspase‑14基因表达的作用，且分子量越小的燕麦β‑葡聚糖在促进HaCaT细胞中caspase‑14基因表达上效果越好。

Description

一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用。

背景技术

燕麦(拉丁学名：Avena sativa L.)为禾本科植物,《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子。燕麦耐寒、抗旱，对土壤的适应性很强，能自播繁衍。当前燕麦的谷粒供磨面食用，麸皮主要用作饲料，已经有部分麸皮用于提取燕麦β-葡聚糖，用于新资源食品，但占比不高，本发明通过新的发现及工艺，对燕麦β-葡聚糖做了深层次的开发和利用，进一步拓宽了燕麦副产品的应用范围，增加了其社会及经济价值。

北纬41°～43°是世界公认的燕麦黄金生长纬度带，那里是海拔1000米以上高原地区，年均气温2.5℃，日照平均可达16小时，是燕麦生长的最佳自然环境。

燕麦在中国种植历史悠久，遍及各山区、高原和北部高寒冷凉地带。种植燕麦有210个县，集中产区是内蒙古自治区的阴山南北，河北省阴山和燕山地区，山西省朔州西山山区、太行山和吕梁山区，陕、甘、宁、青的六盘山、贺兰山和祁连山，云、贵、川的大、小凉山高海拔地区。近这些年来，全国播种面积1500万亩，在新品种的不断推广和栽培技术水平的提高，平均亩产从50公斤提高到75公斤。

燕麦中的β-(1→3，1→4)葡聚糖简称燕麦β-葡聚糖，是存在于燕麦胚乳和糊粉层细胞壁(即麸皮)的一种非淀粉多糖。它由单体β-D-吡喃葡萄糖，通过β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键连接起来形成的一种高分子聚合物。在燕麦胚乳和糊粉层细胞壁成分中，β-葡聚糖占85％以上。燕麦β-葡聚糖是一种相对分子质量较小的短链葡聚糖，市售燕麦β-葡聚糖粉及燕麦β-葡聚糖溶液平均相对分子质量约为130000～180000道尔顿。

Caspase是一组半肌氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，均为半肌氨酸蛋白酶类，并且都具有特异性天冬氨酸酶切位点，故又称为Caspase蛋白酶家族。

Caspase蛋白酶家族还具有以下共同特征：均含有保守的OACRG五肽序列，常以异构体的形式存在，通常以无活性的酶原形式存在，须通过水解其氨基端一段序列而被激活。活化的Caspase可水解底物并通过级联放大效应及诱发凋亡。

至今发现的Caspase蛋白酶家族共有14种，Caspase-14属于其中的一员，其基因的翻译片段总长度约为2.4kb共编码257个氨基酸，体内存在形式为Caspase-14酶原。人类的Capase-14定位于染色19p13.1，具有皮肤特异性，主要分布在表皮角质层和颗粒层、表达于具有角化倾向的上皮组织。在皮肤中，仅表达于处于分化阶段的KC，尤其在分化的最终阶段发挥活性作用。但也有资料显示Caspase-14在毛囊和皮脂腺可少量出现。Caspase-14具有组织特异性，主要在维持表皮的稳态平衡中发挥重要作用。KC特有的Caspase-14主要功能是参与细胞终末分化，形成完整角质层，发挥皮肤屏障的作用。

Caspase-14(半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14)是反映皮肤屏障功能的重要因子。它轻度的表达下降可能导致角质层持水量降低，皮肤干燥，诱发多种皮肤亚健康状况；严重的表达缺陷则可导致角质层NMF的严重不足，角质层脱水，影响皮肤的屏障功能，诱发各种皮肤病。

角质形成细胞在分化为表皮颗粒层细胞时首先表达Faliggrin前体——丝聚合蛋白原(proiflaggrin)并被磷酸化，形成不溶性的聚合物存在于透明角质颗粒中；随角质细胞分化为角质形成细胞，丝聚合蛋白原去磷酸化并降解成为可溶性的Faliggrin，在新形成的角质层最内层2～3层的角质形成细胞内，Faliggrin可达总蛋白的25％以上；随着角质形成细胞成熟，Faliggrin进一步被蛋白酶降解生成大量的NMF。Caspase-14是催化Filaggrin降解的关键酶，因而是NMF生成的关键酶。Filaggrin首先被Caspase-14迅速降解为中间短肽，进而水解成各种天然保湿因子。Caspase-14仅表达于颗粒层和新形成的角质层角质形成细胞中，与profilaggrin和兜甲蛋白(loricrin)一样是角质形成细胞晚期分化的代表性标志蛋白，Caspase-14的基因缺陷则导致profilaggrin降解异常，NMF产生不足。

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)与Caspase-14基因突变密切关联，AD患者的角质层中的Filaggrin与Casepase-14表达强度都有减少，生成的NMF量也随之降低，这是引起AD患者皮肤干燥的重要因素之一，因此Filaggrin与Casepase-14在AD发病中扮演着重要的角色。Caspase-14是Filaggrin生成的关键酶，间接影响自由氨基酸与天然保湿因子的产生,在寻常型鱼鳞病的发生过程中起着重要的作用。银屑病患者皮损处Filaggrin的表达下降同时Caspase-14的表达缺陷，产生的NMF减少，出现皮肤干燥、角化明显现象，可能是由于长期慢性炎症反复发作，导致患者体内Filaggrin及Caspase-14基因表达异常，出现降低现象。研究发现老年皮肤Filaggrin及Caspase-14的表达量显著降低，造成NMF的生成不足，紫外线也可破坏角质细胞内Caspase-14基因表达，影响Faliggrin降解生成NMF的过程，从而使内源性的NFM生成不足，这可能是自然老化和光老化皮肤干燥的重要原因之一。

随着社会的发展，人们亟待发明、发现安全有效的物质，来实现对抗皮肤疾病及光衰老。基于现代分子生物学的研究手段，人们不断的研制各类能够用于对抗光老化、预防和治疗各类因基因表达缺陷或表达不足，导致的各类皮肤疾病的药物。

由于燕麦β-葡聚糖的特殊结构，利用酶法检测(AOAC Method 995.16)，具有很强的专一性，具体原理为：利用lichenase地衣酶(专一性的(1-3)-β-糖苷键,(1-4)-β-糖苷键内部4-葡聚糖水解酶EC 3.2.1.73)进行第一步酶水解，水解后的寡糖利用β-葡聚糖酶(EC3.2.1.21)进行第二步水解。这种方法具有很强的专一性，除了(1-3),(1 4)-β-葡聚糖外，其它的多糖都不会被水解。最后用GOPOD葡萄糖检测试剂检测生成的多糖含量，定性定量检测燕麦β-葡聚糖。然而利用该方法进行燕麦β-葡聚糖的水解具有中小分子量燕麦β-葡聚糖产率低的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏能够提高caspase-14基因表达的物质、且获得中小分子量的燕麦β-葡聚糖的方法产量低等缺陷，提供一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用。所得到的中小分子量燕麦β-葡聚糖可以有效促进caspase-14基因的表达，发挥其直接的皮肤靶向作用，并可用于治疗和预防因caspase-14基因表达缺陷所导致的疾病，以及因紫外照射所导致的皮肤光老化疾病。

本发明研究发现，自然存在的燕麦β-葡聚糖，对HaCaT细胞中caspase-14基因表达具有一定的促进作用，但其效果非常不明显；经本发明团队研究发现，小分子量的燕麦β-葡聚糖对HaCaT细胞中caspase-14基因表达具有明显的促进作用。然而自然界存在的小分量燕麦β-葡聚糖的量是极其微量的。直接从燕麦中分离小分子量燕麦β-葡聚糖，存在存量低微，分离成本较高，且资源浪费的问题。本发明人创造性地发明一种制备方法，利用该制备方法制备得到的燕麦β-葡聚糖由于分子量小，其透皮率更高，更容易到达HaCaT细胞，发挥促进Caspase-14的基因表达的作用。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题。

本发明的技术方案之一为：一种中小分子量燕麦β–葡聚糖的制备方法，所述的制备方法包括使用酶对底物进行酶解反应；

其中：所述的酶包括β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶，所述的底物包括待酶解燕麦β–葡聚糖，所述底物的浓度为0.5％～10％，所述的百分比为质量百分比；所述酶与所述底物的质量比为1:(100～100000)；

所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为60000道尔顿以下。

较佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为30000道尔顿以下；更佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为10000道尔顿以下；进一步更佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为360.32～1000道尔顿。

其中，所述的待酶解燕麦β-葡聚糖可为使用各种方法从燕麦麸皮中直接提取纯化浓缩的燕麦β–葡聚糖溶液，或者市售的各种规格的燕麦β–葡聚糖，例如市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉。另外，只要分子量大于所要获得的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量，均可称作待酶解燕麦β-葡聚糖，例如当所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为30000道尔顿以下，所述的待酶解燕麦β–葡聚糖可为30000道尔顿以上的燕麦β–葡聚糖。所述的待酶解燕麦β-葡聚糖可以单独的形式存在，或者与其他分子量的燕麦β-葡聚糖以共同的形式存在。

为进一步提高酶解反应的效率，所述底物的浓度较佳地为1％～5％，所述的百分比为质量百分比。

较佳地，所述酶与所述的底物的质量比为1:(1000～10000)，更佳地为1:5000。

较佳地，所述酶解反应的pH为3.0～9.0，更佳地为4.5～6.5，进一步更佳地为5.0。

较佳地，所述酶解反应的温度为20～80℃，更佳地为45～65℃，进一步更佳地为50℃。

较佳地，所述酶解反应的时间为0.1～10小时，较佳地为0.5～2小时。

本发明中对所述酶解反应的pH、温度和时间进行限定的目的在于使所述酶与所述底物高效反应。当所述酶与所述底物的比值(即酶底比)高的时候，在达到相同效果的情况下、且保证所述酶的活性不受影响的前提下，所述的温度和时间可以相应降低。同理，当仅仅考虑所述温度和所述时间时，当所述温度提高，相应的反应时间可相应降低；反之亦然(前提同上)。

所述酶解反应的体系可为本领域常规，例如溶液。本发明中，所述酶解反应较佳地以水为载体。

所述的酶可为本领域中常规的含有β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶的酶，例如纤维素酶或者β-葡聚糖酶(均可购买得到)，所述的纤维素酶和β-葡聚糖酶可单独或者混合使用。其中，所述的β-葡聚糖酶为催化水解β-葡聚糖的多种酶的总称，所述的纤维素酶为降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、β-内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。

本发明中，进行上述酶解反应后，较佳地还进行以下操作：

对所述酶解反应后所得产物进行分子量分级，保留所述产物中的中小分子量燕麦β-葡聚糖、并将所述产物中分子量大于所述中小分子量燕麦β–葡聚糖再次进行酶解反应；

所述的操作较佳地重复1次以上；更佳地，所述的操作重复2～4次。

本发明中，所述的分级方法可为本领域常规，例如沉淀、超滤、分子筛或者层析。

进一步地，为获得浓缩液，可将所述酶解反应所得中小分子量燕麦β–葡聚糖进行灭酶、除蛋白和浓缩处理；较佳地，所述浓缩液中所述中小分子量燕麦β–葡聚糖的浓度为0.5％以上，更佳地为2.5％以上，所述的百分比为质量百分比；

其中，所述灭酶的方法可为本领域常规，例如加热法，较佳地为95℃加热30分钟。

所述除蛋白的方法可为本领域常规，较佳地为等电点法或者絮凝法。

所述的浓缩处理的方法可为本领域常规，例如常压浓缩、减压浓缩等。

本发明中，可根据本领域常规对所述的浓缩液进行进一步处理。较佳地，对所述浓缩液进行干燥处理后保存，或者进行所述干燥处理后用醇洗涤再干燥或用所述醇沉淀后干燥；较佳地，所述的醇为乙醇；更佳地为75％乙醇，所述的百分比为体积百分比。

所述的干燥处理的方法可为本领域常规，例如真空干燥法、冷冻干燥法以及喷雾干燥法等。

在本发明一较佳实施例中，如上所述的制备方法包括下述步骤：

(1)将所述的酶与所述的底物混合进行酶解反应、并进行分子量分级；

(2)收集步骤(1)中进行所述分级后获得的中小分子量燕麦β–葡聚糖，将分子量为60000道尔顿以上的燕麦β–葡聚糖再进行步骤(1)的处理；

(3)重复步骤(1)-(2)1次以上；

(4)合并以上步骤中获得的中小分子量燕麦β–葡聚糖，并进行灭酶除蛋白和浓缩处理，得浓缩液；

(5)将步骤(4)所得浓缩液进行干燥处理；较佳地，进行所述干燥处理后，用乙醇洗涤再干燥或者用乙醇沉淀后干燥，即可。

本发明的技术方案之二为：如上所述的制备方法制备得到的中小分子量燕麦β–葡聚糖。

本发明的技术方案之三为：如上所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖在制备人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者用于防治caspase-14基因表达缺陷所导致的疾病的药物中的应用。

本发明的技术方案之四为：一种中小分子量燕麦β–葡聚糖在制备人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者用于防治caspase-14基因表达缺陷所导致的疾病的药物中的应用。对所述中小分子量燕麦β–葡聚糖的具体限定如上所述。

较佳地，如上所述的疾病为皮肤疾病；更佳地，所述的疾病为光老化、特应性皮炎、银屑病、寻常型鱼鳞病或者干痒蜕皮。

较佳地，所述的人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者所述的用于防治caspase-14基因表达下降所导致的疾病的药物适用于化妆品或者护肤品中。

本发明最终制备得到的中小分子量燕麦β-葡聚糖可以多种方式存在于市场，例如：粉末的形式，含丁二醇8％、中小分子量燕麦β-葡聚糖1％的水溶液的形式，含甘油5％、中小分子量燕麦β-葡聚糖1.5％的水溶液的形式，仅用水配制的浓度为0.5％的中小分子量燕麦β-葡聚糖溶液(该段内容中提及的百分比均为质量百分比)。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明首次发现燕麦β-葡聚糖具有促进HaCaT细胞中caspase-14基因表达的作用，分子量越小的燕麦β-葡聚糖在促进HaCaT细胞中caspase-14基因表达上效果越好，并创造性地通过凝胶、保湿乳霜、面膜等形式将其应用于治疗和预防caspase-14基因表达缺陷疾病；

(2)本发明人的制备方法应用现代生物技术，通过酶解、分级的方法，大幅度提高了小分子燕麦β-葡聚糖的产量，利用本发明的方法制备燕麦β-葡聚糖的最终得率可高达80％，充分利用了资源，避免了资源浪费问题。

附图说明

图1为实施例与对比例燕麦β-葡聚糖得率的比较。

图2为实施例与对比例燕麦β-葡聚糖透皮效果的比较。

图3为100μg/ml实施例与对比实施例燕麦β-葡聚糖促进HaCaT细胞中caspase-14基因表达的效果图。

图4为实施例与对比例燕麦β-葡聚糖促进HaCaT细胞中caspase-14基因表达的量效关系。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所涉及的酶，是市场上成熟商品纤维素酶或β-葡聚糖酶，并可以从商业途径获得。本发明所用的酶为在市场上随机购买的两种酶，酶1：枣庄市杰诺生物酶有限公司的纤维素酶；酶2：北京卫诺恩生物技术有限公司的β-葡聚糖酶。

若没有特别指明，以下实施例或者对比实施例中所涉及到的百分比均为质量百分比。

另，以下实施例中的浓缩方法均为减压浓缩。

实施例1

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为5％，以酶1为水解酶；调整酶底比(酶：底物质量比)为1:1000；调节pH为4.5；酶解温度为45℃；酶解时间为0.5h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，大于30000道尔顿分子量部分继续酶解、超滤，重复以上步骤3次，合并小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法(本领域常规技术)除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

实施例2

酶解方法为：以水为载体，以燕麦麸皮为底物原料，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为1％，以酶2为水解酶；调整酶底比为1：5000；调节pH为5.0；酶解温度为50℃；每次酶解时间为1h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于10000道尔顿部分和小于10000道尔顿分子量部分，大于10000道尔顿分子量部分继续酶解超滤，重复以上步骤2次，合并小于10000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，絮凝法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于2.5％的溶液，加去离子水、丁二醇，配制成含丁二醇8％、燕麦β-葡聚糖含量为1％的溶液。

实施例3

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为10％，以酶2为水解酶；调整酶底比为1:100；调节pH为9.0，酶解温度为80℃，每次酶解时间为0.1h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用分子筛的方法，将分子量分成大于1000道尔顿部分和小于1000道尔顿分子量部分，大于1000道尔顿分子量部分继续酶解分级，重复以上步骤1次，合并小于1000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，絮凝法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于0.5％的溶液进行冷冻干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末，加去离子水、甘油，配制成含甘油5％、燕麦β-葡聚糖含量为1.5％的溶液。

实施例4

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为0.5％；调整酶底比为1:100000；调节调节pH为3.0，酶解温度为20℃，每次酶解时间为10h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用层析的方法，将分子量分成大于60000道尔顿部分和小于60000道尔顿分子量部分，大于60000道尔顿分子量部分继续酶解分级，重复以上步骤5次，合并小于60000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，絮凝法(本领域常规技术)除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量为大于等于0.5％的溶液，加乙醇，在4℃下静置12h，离心后真空干燥，得燕麦β-葡聚糖粉，加水溶解配制成0.5％的燕麦β-葡聚糖溶液。

对比实施例1

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为0.3％；调整酶底比为1:1000；调节pH为4.5；酶解温度为45℃；每次酶解时间为0.5h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，大于30000道尔顿分子量部分继续酶解超滤，重复3次，合并小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例2

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为5％；调整酶底比为1:50；调节pH为4.5；酶解温度为45℃；每次酶解时间为0.5h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，大于30000道尔顿分子量部分继续酶解超滤，重复3次，合并小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例3

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为5％；调整酶底比为1:1000；调节pH为2.5；酶解温度为45℃；每次酶解时间为0.5h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，大于30000道尔顿分子量部分继续酶解超滤，重复3次，合并小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例4

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为5％；调整酶底比为1:1000；调节pH为4.5；酶解温度为15℃；每次酶解时间为0.5h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，大于30000道尔顿分子量部分继续酶解超滤，重复3次，合并小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例5

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为5％；调整酶底比为1:1000；调节pH为4.5；酶解温度为45℃；每次酶解时间为0.01h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，大于30000道尔顿分子量部分继续酶解超滤，重复3次，合并小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例6

酶解方法为：以水为载体，以市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉为底物原料，以酶1为水解酶，调整底物(即燕麦β–葡聚糖)浓度为5％；调整酶底比为1:1000；调节pH为4.5；酶解温度为45℃；酶解时间为0.5h。酶解后进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于30000道尔顿部分和小于30000道尔顿分子量部分，将小于30000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例7

对市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉，以水为载体，调整燕麦β–葡聚糖浓度为1％，进行分子量分级，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于60000道尔顿部分和小于60000道尔顿分子量部分，将小于60000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例8

对市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉，以水为载体，调整燕麦β–葡聚糖浓度为1％，分子量分级方法为：用超滤膜将分子量分成大于60000道尔顿部分和小于60000道尔顿分子量部分，将大于60000道尔顿的燕麦β-葡聚糖溶液，加热至95℃灭酶30分钟，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

对比实施例9

对市售含量70％的燕麦β-葡聚糖粉，以水为载体，调整燕麦β–葡聚糖浓度为1％，等电点法除蛋白后，浓缩至β-葡聚糖含量大于等于2.5％的溶液，进行喷雾干燥，得燕麦β-葡聚糖粉末。

效果实施例1燕麦β-葡聚糖得率的测试

一、得率测试方法

得率的计算公式为：得率＝(获得燕麦β-葡聚糖总量×燕麦β-葡聚糖含量)/(酶解前投入的燕麦β-葡聚糖总量×燕麦β-葡聚糖含量)100％。

燕麦β-葡聚糖含量检测方法，依据AOAC Method 995.16。具体方法步骤如下：

1、F因子测定

1.1取3个试管，1个用作空白，两个用作反应。

1.2向空白加入0.1mL水，0.1mL 50mM，pH4.0的醋酸盐缓冲液，向反应管各加入0.1mL50mM,pH4.0的醋酸盐缓冲液和0.1mL 1mg/mL的葡萄糖标准液。

1.3向各试管内加入3mL GOPOD试剂，50℃反应20min。

1.4检测每一管液体在510nm下的吸光值(EA)和空白吸光值(EB1)。

1.5F因子计算：F＝100μg葡萄糖/100μg葡萄糖的吸光度值，即100/(EA-EB1)。

2、标准大麦粉的测定

2.1称取标准大麦粉100mg左右，两份，分别装在10mL以上试管中。

2.2加入0.8mL乙醇水溶液(50/50,v/v)，将粉分散后，再加入5.0mL20mM(pH6.5)的磷酸盐缓冲液，沸水中加热1min，取出振荡，再在沸水加热3min，取出振荡，(加热3min，振荡过程重复进行两次)冷却至50℃以下。

2.3加入0.2mL lichenase(10U)至每个管中，50℃反应1h。

2.4反应后将试管中的溶液离心，离心条件：3000r/min，10min。

2.5精密取离心后上清液体0.1mL至干净试管的底部，加入0.1mL的β-gulucosidase(0.2U)，50℃反应15min。

2.6向步骤2.5反应后的各试管内加入3mL GOPOD试剂，50℃反应20min。

2.7检测每一管液体在510nm下的吸光值(EA)和空白吸光值(EB1)。

3、供试品燕麦β-葡聚糖的测定(液体样品)

3.1称取样品500mg，置于10mL以上试管中，加入50％(体积百分比)乙醇水溶液0.3mL，磷酸缓冲液(20mM，pH＝6.5)5mL，混匀，50℃水浴预热，平行制备两份样品。

3.2分别加入0.2mL lichenase(10U)至每个试管中，50℃反应1h。

3.3取3.2反应液0.1mL，两份，分别加入0.1mLβ-gulucosidase(0.2U)，50℃反应15min。

3.4加入3ml向步骤3.3反应后的各试管内加入3mL GOPOD试剂，50℃反应20min。

3.5检测每一管液体在510nm下的吸光值(EA)和空白吸光值(EB1)。

4、供试品燕麦β-葡聚糖的测定

称取供试品粉末适量(标示含量与标准大麦粉为对照确定取样量)，两份，分别装在10mL以上试管中。以下步骤同2。

5、计算

5.1标准品含量

标准品含量测定按公式(1)计算，公式(1)中涉及的供试品溶液中燕麦β-葡聚糖的含量按公式(2)计算。

β-葡聚糖(％W/W)＝c×100/(100-10.9)＝c×100/89.1……………(1)

式中：

c——供试品溶液中燕麦β-葡聚糖的含量，％。

5.2供试品溶液中的含量

供试品溶液中的含量测定按公式(2)计算

β-葡聚糖(％W/W)＝△A×F×60×(1/1000)×(162/180)＝(△A×F×5.4)/W

式中：

△A——反应吸光值(EA)与空白吸光值(EB1)之差；

F——每单位(μg)葡萄糖吸光度值；

60——体积修正(从6mL里取出0.1mL)；

1/1000——μg向mg的换算；

162/180——修正因子，葡萄糖向β-葡聚糖转化时失去的水。

5.3供试品

固体样品的含量测定按公式(3)计算，公式(3)中涉及的供试品溶液中燕麦β-葡聚糖的含量按公式(2)计算。

β-葡聚糖(％W/W)＝c×100………………………(3)

式中：

c——供试品溶液中燕麦β-葡聚糖的含量，％；

注意：

1)标准大麦粉实际测定含量与标定值误差±5％；

2)吸光度值控制在0.5～1.2左右；

3)操作过程中要严格控制移入或移出液体的体积；

根据上述测试计算结果，带入公式：得率＝(获得燕麦β-葡聚糖总质量×燕麦β-葡聚糖含量)/(酶解前投入的燕麦β-葡聚糖总质量×燕麦β-葡聚糖含量)×100％，计算出各实施例的得率。

二、测试结果

各方法，燕麦β-葡聚糖得率如图1所示。

三、结果分析

根据图1结果可以看出，实施例制备的小分子燕麦β-葡聚糖得率，远高于对比例制备的燕麦β-葡聚糖的得率。根据对比例7，可以看出，未经酶解的燕麦β-葡聚糖中，小分子量的含量较少，约占20％。

效果实施例2、实施例所得燕麦β-葡聚糖、与对比实施例所得燕麦β-葡聚糖的透皮实验

效果实施例2测试燕麦β-葡聚糖的透皮率实验如下：

一、实验方法：

1、实验分组及处理

选取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比实施例8、对比实施例9，即分子量分别为小于30000道尔顿、小于10000道尔顿、小于1000道尔顿、小于60000道尔顿、大于60000道尔顿的燕麦β-葡聚糖、平均分子量为150000道尔顿的燕麦β-葡聚糖，分别配制成燕麦β-葡聚糖含量为0.5％的水溶液。

2、离体鼠皮的制备

将昆明种合格小鼠(购自广西医科大学实验动物中心)用10％Na₂S脱去背部皮毛，脱颈椎处死后，立即剥取背部皮肤，除去皮下脂肪层，用蒸馏水洗净，浸于蒸馏水中备用。

3、透皮吸收实验

采用Franz实验装置，将皮肤固定于扩散池的给药室与接受室之间，两池有效接触面积为2.06cm²，真皮一侧与接受液接触，注意结合紧密，勿有气泡，接受液为18ml生理盐水。磁力搅拌速度为100r/min，水浴温度为37±1℃，在设定的时间内取样，测试接受室中燕麦β-葡聚糖含量。

二、测试结果

各实施例燕麦β-葡聚糖接受液含量如图2。

三、结果分析

从图2中可以看出，燕麦β-葡聚糖分子量越小，其透皮效果越好。

效果实施例3实施例燕麦β-葡聚糖、与对比实施例燕麦β-葡聚糖对HaCaT细胞(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)中caspase-14的mRNA表达水平的影响

一、实验方法

1、实验分组及处理

选取实施例1、实施例2、实施例4、实施例5、对比实施例8、对比实施例9的燕麦β-葡聚糖，分别配制成燕麦β-葡聚糖含量为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml，100μg/ml水溶液。

2、药物处理细胞

取浓度为1×10⁵cells/ml的HaCaT细胞1ml加入96孔板中，再加入1ml DMEM培养基培养24h后，加入药物—步骤(1)中各组燕麦β-葡聚糖溶液，作用72h，同时设置高钙对照组(10mM氯化钙)。

3、RNA提取

参照Biomiga RNA提取试剂盒说明书：

3.1使用前：将560μlβ-巯基乙醇加入到28mL buffer LY；RNA Washbuffer中加入96ml无水乙醇。

3.2吸弃培养基，细胞用预冷的PBS洗涤3遍。每孔加入500μl bufferLY。用枪头吹打裂解物5次后转入DNA Clearance colume中(已套在2mlCollection tube中)，13000rpm室温离心2min，以除去基因组DNA。

3.3在Collection tube中的细胞裂解物中加入250μl无水乙醇，轻柔吹打5次混匀。

3.4将细胞裂解物转入RNA colume(已套在新的2ml Collection tube中)，13000rpm离心1min，将RNA colume套在新的2ml Collection tube中。

3.5将500μl buffer RB加入到RNA colume，13000rpm离心30s，弃掉滤液。

3.6RNA colume中加入500μl RNA Wash buffer，12000rpm离心1min，弃去滤液。重复此步骤一次。最后将RNA colume盖子打开，放入新的Collection tube，12000rpm空离1min。

3.7将RNA colume套在RNase-free的1.5ml EP管，加入50μlRNase-free ddH₂O，13000rpm离心1min，收集得到RNA，-20℃保存待用。

4、RNA定量检测

用Epoch超微量微孔板检测RNA含量，方法同质粒检测，用ddH₂O做本底。根据仪器得到的比值R(A260/A280)得到RNA纯度。若R在1.9-2.1的范围内，说明提取的RNA符合实验要求；若R<1.8，表明RNA中存在蛋白质污染；若R>2.2时，则表明RNA有水解。

5、RNA定性检测

RNA电泳方法同前面质粒定性。如在胶块上能清晰的见到28S和18S两条带，且18S条带的亮度明显低于28S条带，表明RNA符合实验要求；如出现5S条带且较明显，说明RNA有降解；若在胶的顶部出现条带，则说明有基因组DNA污染，均应舍弃。

6、逆转录：

6.1按照PrimeScriptTM逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，配方如表1所示：

表1

6.2试剂盒提供的逆转录反应条件如下：

37℃15min(逆转录)

85℃5s(逆转录酶失活)

4℃4min

反应结束后，4℃保存待用。

7、qPCR扩增反应

7.1使用PowerUpTM SYBR Green进行qPCR，反应液配制在冰上进行，PCR扩增反应体系详见表2。

表2

7.2PCR扩增程序如下：

Stage 1：UDG活化

50℃ 1min

Stage 2：预变性

95℃ 2min

Stage 3：PCR扩增(循环40次)

95℃ 15s

60℃ 1min

Stage 4：溶解曲线分析

二、测试结果

各实施例，燕麦β-葡聚糖HaCaT细胞中caspase-14的mRNA表达水平的影响如图3、图4所示，图3为各实施例制备的燕麦β-葡聚糖，在含量为100μg/ml时，对HaCaT细胞中caspase-14基因(mRNA)表达的促进作用，图4各实施例制备的燕麦β-葡聚糖，在促进HaCaT细胞中caspase-14基因表达的量效关系。

三、结果分析

从图3结果可以看出：各实施例制备的燕麦β-葡聚糖在含量为100μg/ml时，均对HaCaT细胞中caspase-14的基因(mRNA)的表达具有促进作用；在含量为100μg/ml时，实施例制备的小分子燕麦β-葡聚糖，对HaCaT细胞中caspase-14基因表达的促进作用明显高于对比实施例的大分子燕麦β-葡聚糖，及未分子量分级的燕麦β-葡聚糖。从图4可以看出，实施例制备的小分子燕麦β-葡聚糖，在促进HaCaT细胞中caspase-14基因表达时，有明显的量效关系，浓度越高，促进效果约明显。

应用实施例1抗光老化凝胶的制备

表3

该抗光老化凝胶的制备按本领域常规制备，具体为：按配比称量好上述物料，先把卡波U21分散在丙二醇中，然后加水分散；同时升温到60℃，分散完全后，加入透明质酸钠，继续分散；分散完成后，将A相所有组分分散到水中并同时升高温度到85℃，搅拌均匀；预先把D相增溶好；将A相冷却到45℃后，加入B相，搅拌均匀后，加入C、D相各组分；搅拌均匀后出料，pH控制在5.0～6.0。

应用实施例2鱼鳞病保湿乳

表4

该鱼鳞病保湿乳的制备按本领域常规制备，具体为：按配比称量好上述物料，先把卡波、黄原胶分散在甘油中，然后加水分散；同时升温到60℃，分散完全后，加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮，升高温度到90℃，搅拌溶解均匀；精确称取B相各物料，混合加热至90℃；将B相加入A相中，均质乳化完全后，缓慢搅拌下冷却到55℃后，加入C相，搅拌均匀后，继续降温至45℃，加入D相；搅拌均匀后出料，pH控制在5.0～6.0。

应用实施例3特应性皮炎霜

表5

该特应性皮炎霜的制备按本领域常规制备，具体为：按配比称量好上述物料，先把卡波、黄原胶分散在甘油中，然后加水分散；同时升温到60℃，分散完全后，加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮，升高温度到90℃，搅拌溶解均匀；精确称取B相各物料，混合加热至90℃；将B相加入A相中，均质乳化完全后，缓慢搅拌下冷却到55℃后，加入C相，搅拌均匀后，继续降温至45℃，加入D相；搅拌均匀后出料，pH控制在5.0～6.0。

应用实施例4自保湿面膜

表6

该自保湿面膜的制备按本领域常规制备，具体为：将A相中依次加入后600rpm搅拌60min,之后降低搅拌速度之300rpm加热升温至80℃；

待A相全部溶解后，将料体放入水浴锅中自然冷却，同时低速搅拌，至65℃以下缓慢加入B相，中和结束后搅拌状态下加入预溶好的C相，搅拌均匀；

当料体温度降至45℃以下时，缓慢搅拌加入预溶好的D相组分。

Claims (10)

1.一种中小分子量燕麦β–葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括使用酶对底物进行酶解反应；

其中：所述的酶包括β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶，所述的底物包括待酶解燕麦β–葡聚糖，所述底物的浓度为0.5％～10％，所述的百分比为质量百分比；所述酶与所述底物的质量比为1:(100～100000)；

所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为60000道尔顿以下。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为30000道尔顿以下；较佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为10000道尔顿以下；更佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量342.32～1000道尔顿；

和/或，所述底物的浓度为1％～5％，所述的百分比为质量百分比；

和/或，所述酶与所述的底物的质量比为1:(1000～10000)，较佳地为1:5000；

和/或，所述酶解反应的pH为3.0～9.0，较佳地为4.5～6.5，更佳地为5.0；

和/或，所述酶解反应的温度为20～80℃，较佳地为45～65℃，更佳地为50℃；

和/或，所述酶解反应的时间为0.1～10小时，较佳地为0.5～2小时；

和/或，所述酶解反应中，以水为载体；

和/或，所述的酶为纤维素酶或者β-葡聚糖酶。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行所述酶解反应后还进行以下操作：

对所述酶解反应后所得产物进行分子量分级，保留所述产物中的中小分子量燕麦β-葡聚糖、并将所述产物中分子量大于所述中小分子量燕麦β-葡聚糖的燕麦β–葡聚糖再次进行酶解反应；

较佳地，所述的操作重复1次以上；更佳地，所述的操作重复2～4次。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的分级方法为沉淀、超滤、分子筛或者层析。

5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述酶解反应所得中小分子量燕麦β–葡聚糖进行灭酶、除蛋白和浓缩处理，得浓缩液，所述灭酶的方法优选95℃加热30分钟，所述除蛋白的方法优选等电点法或者絮凝法；较佳地，所述浓缩液中所述中小分子量燕麦β–葡聚糖的浓度为0.5％以上，更佳地为2.5％以上，所述的百分比为质量百分比。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，对所述的浓缩液进行干燥处理后保存，或者所述干燥处理后用的醇洗涤再干燥或用所述醇沉淀后干燥；较佳地，所述的醇为乙醇；更佳地为75％乙醇，所述的百分比为体积百分比。

7.根据如权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的中小分子量燕麦β–葡聚糖。

8.如权利要求7所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖在制备人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者用于防治caspase-14基因表达下降所导致的疾病的药物中的应用；较佳地：

所述的疾病为皮肤疾病，所述的皮肤疾病优选、特应性皮炎、银屑病、寻常型鱼鳞病或者干痒蜕皮；

和/或，所述的人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者所述的用于防治caspase-14基因表达下降所导致的疾病的药物适用于化妆品或者护肤品中。

9.一种中小分子量燕麦β–葡聚糖在制备人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者用于防治caspase-14基因表达缺陷所导致的疾病的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖分子量为60000道尔顿以下，优选30000道尔顿以下，更优选10000道尔顿以下，进一步优选360.32～1000道尔顿；

和/或，所述的疾病为皮肤疾病，所述的皮肤疾病优选光老化、特应性皮炎、银屑病、寻常型鱼鳞病或者干痒蜕皮；

和/或，所述的人皮肤中caspase-14基因表达上调剂或者所述的用于防治caspase-14基因表达下降所导致的疾病的药物适用于化妆品或者护肤品中。