CN109486926A - 一种基于高通量测序检测人DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于高通量测序检测人DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组。本发明保护一种引物组，由序列表的序列1至序列45所示的45条引物组成。本发明还保护一种建立DNA文库的方法，依次包括如下步骤：(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行PCR扩增，回收扩增产物；(2)以扩增产物为模板，采用测序平台的通用上游引物和测序平台的通用下游引物进行PCR扩增，回收扩增产物，即为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。本发明中提供的引物组可以实现在一管中进行多重PCR扩增。采用本发明提供的引物组或方法获得TCRβ链免疫组库，具有灵敏度高、特异性高、可重复性高、实验成本低的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于高通量测序检测人DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组。
背景技术
T细胞依赖抗原主要组织相容性复合体分子(MHC)和T细胞受体(TCR)的相互作用介导抗原识别。TCRs是高度多样性的异质二聚体，由两条肽链组成(α链和β链，偶见γ链和δ链)。每条肽链均由可变区和恒定区组成，可变区在抗原识别的过程中起到重要作用。α链(或δ链)的可变区由V区和J区组成，β链(或γ链)的可变区由V区、D区和J区组成。因为不同的VDJ亚型重排在一起，加上在重排的过程中会伴有插入缺失等突变变异的发生等因素导致了VDJ重排的种类数大幅提升，最终构成了一个庞大的免疫组库群体。
随着疾病的发生和发展，TCR免疫组库可能会发生很大的变化，这就是为什么现在不同疾病条件下免疫组库状态越来越受到关注的原因，如癌症、自身免疫、炎症和传染病。而研究免疫组库多样性的主要难点也在于其多样性，理论上TCR VDJ重排组合形式能达到10的10-20次方。
基于研究的目标不同，不同的起始材料也各有优缺点。基因组DNA具有更高的稳定性，而且在每个细胞里面都是单一模板，能够更好的进行单克隆TCR定量。然而基因组DNA模板无法提供目标基因的表达信息，同时可能会受到内含子带来的影响。当用RNA作为起始模板的时候，单克隆TCR定量因为多个TCR转录本会带来很多偏差，而且不得不面对样本容易降解的问题。
高通量测序，是将DNA分子进行随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中bridge amplification形成的克隆进行延伸反应，检测对应的信号，最终获得序列信息。相比于一代Sanger测序，高通量测序能够一次对几十万到几百万条DNA进行测序，处理大规模样本时具有显著地优势，耗时也较一代测序短很多，是目前研究基因序列主要的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组。
本发明保护一种引物组(引物组甲)，由如下45条引物组成：
上游引物-1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；上游引物-2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；上游引物-3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；上游引物-4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；上游引物-5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；上游引物-6为序列表的序列6所示的单链DNA分子；上游引物-7为序列表的序列7所示的单链DNA分子；上游引物-8为序列表的序列8所示的单链DNA分子；上游引物-9为序列表的序列9所示的单链DNA分子；上游引物-10为序列表的序列10所示的单链DNA分子；上游引物-11为序列表的序列11所示的单链DNA分子；上游引物-12为序列表的序列12所示的单链DNA分子；上游引物-13为序列表的序列13所示的单链DNA分子；上游引物-14为序列表的序列14所示的单链DNA分子；上游引物-15为序列表的序列15所示的单链DNA分子；上游引物-16为序列表的序列16所示的单链DNA分子；上游引物-17为序列表的序列17所示的单链DNA分子；上游引物-18为序列表的序列18所示的单链DNA分子；上游引物-19为序列表的序列19所示的单链DNA分子；上游引物-20为序列表的序列20所示的单链DNA分子；上游引物-21为序列表的序列21所示的单链DNA分子；上游引物-22为序列表的序列22所示的单链DNA分子；上游引物-23为序列表的序列23所示的单链DNA分子；上游引物-24为序列表的序列24所示的单链DNA分子；上游引物-25为序列表的序列25所示的单链DNA分子；上游引物-26为序列表的序列26所示的单链DNA分子；上游引物-27为序列表的序列27所示的单链DNA分子；上游引物-28为序列表的序列28所示的单链DNA分子；上游引物-29为序列表的序列29所示的单链DNA分子；上游引物-30为序列表的序列30所示的单链DNA分子；上游引物-31为序列表的序列31所示的单链DNA分子；上游引物-32为序列表的序列32所示的单链DNA分子；
下游引物-1为序列表的序列33所示的单链DNA分子；下游引物-2为序列表的序列34所示的单链DNA分子；下游引物-3为序列表的序列35所示的单链DNA分子；下游引物-4为序列表的序列36所示的单链DNA分子；下游引物-5为序列表的序列37所示的单链DNA分子；下游引物-6为序列表的序列38所示的单链DNA分子；下游引物-7为序列表的序列39所示的单链DNA分子；下游引物-8为序列表的序列40所示的单链DNA分子；下游引物-9为序列表的序列41所示的单链DNA分子；下游引物-10为序列表的序列42所示的单链DNA分子；下游引物-11为序列表的序列43所示的单链DNA分子；下游引物-12为序列表的序列44所示的单链DNA分子；下游引物-13为序列表的序列45所示的单链DNA分子。
本发明还保护一种引物组(引物组乙)，由如下45条引物组成：
上游引物-1自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-1；基因特异上游区段-1如序列表的序列1第30-54位核苷酸组成；上游引物-2自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-2；基因特异上游区段-2如序列表的序列2第30-53位核苷酸组成；上游引物-3自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-3；基因特异上游区段-3如序列表的序列3第30-51位核苷酸组成；上游引物-4自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-4；基因特异上游区段-4如序列表的序列4第30-52位核苷酸组成；上游引物-5自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-5；基因特异上游区段-5如序列表的序列5第30-53位核苷酸组成；上游引物-6自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-6；基因特异上游区段-6如序列表的序列6第30-52位核苷酸组成；上游引物-7自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-7；基因特异上游区段-7如序列表的序列7第30-52位核苷酸组成；上游引物-8自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-8；基因特异上游区段-8如序列表的序列8第30-52位核苷酸组成；上游引物-9自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-9；基因特异上游区段-9如序列表的序列9第30-52位核苷酸组成；上游引物-10自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-10；基因特异上游区段-10如序列表的序列10第30-52位核苷酸组成；上游引物-11自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-11；基因特异上游区段-11如序列表的序列11第30-53位核苷酸组成；上游引物-12自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-12；基因特异上游区段-12如序列表的序列12第30-53位核苷酸组成；上游引物-13自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-13；基因特异上游区段-13如序列表的序列13第30-53位核苷酸组成；上游引物-14自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-14；基因特异上游区段-14如序列表的序列14第30-55位核苷酸组成；上游引物-15自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-15；基因特异上游区段-15如序列表的序列15第30-51位核苷酸组成；上游引物-16自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-16；基因特异上游区段-16如序列表的序列16第30-51位核苷酸组成；上游引物-17自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-17；基因特异上游区段-17如序列表的序列17第30-54位核苷酸组成；上游引物-18自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-18；基因特异上游区段-18如序列表的序列18第30-53位核苷酸组成；上游引物-19自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-19；基因特异上游区段-19如序列表的序列19第30-53位核苷酸组成；上游引物-20自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-20；基因特异上游区段-20如序列表的序列20第30-51位核苷酸组成；上游引物-21自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-21；基因特异上游区段-21如序列表的序列21第30-54位核苷酸组成；上游引物-22自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-22；基因特异上游区段-22如序列表的序列22第30-51位核苷酸组成；上游引物-23自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-23；基因特异上游区段-23如序列表的序列23第30-55位核苷酸组成；上游引物-24自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-24；基因特异上游区段-24如序列表的序列24第30-52位核苷酸组成；上游引物-25自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-25；基因特异上游区段-25如序列表的序列25第30-54位核苷酸组成；上游引物-26自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-26；基因特异上游区段-26如序列表的序列26第30-49位核苷酸组成；上游引物-27自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-27；基因特异上游区段-27如序列表的序列27第30-53位核苷酸组成；上游引物-28自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-28；基因特异上游区段-28如序列表的序列28第30-54位核苷酸组成；上游引物-29自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-29；基因特异上游区段-29如序列表的序列29第30-48位核苷酸组成；上游引物-30自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-30；基因特异上游区段-30如序列表的序列30第30-47位核苷酸组成；上游引物-31自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-31；基因特异上游区段-31如序列表的序列31第30-53位核苷酸组成；上游引物-32自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-32；基因特异上游区段-32如序列表的序列32第30-52位核苷酸组成；
下游引物-1自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-1；基因特异下游区段-1如序列表的序列33第22-46位核苷酸组成；下游引物-2自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-2；基因特异下游区段-2如序列表的序列34第22-46位核苷酸组成；下游引物-3自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-3；基因特异下游区段-3如序列表的序列35第22-46位核苷酸组成；下游引物-4自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-4；基因特异下游区段-4如序列表的序列36第22-44位核苷酸组成；下游引物-5自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-5；基因特异下游区段-5如序列表的序列37第22-46位核苷酸组成；下游引物-6自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-6；基因特异下游区段-6如序列表的序列38第22-43位核苷酸组成；下游引物-7自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-7；基因特异下游区段-7如序列表的序列39第22-42位核苷酸组成；下游引物-8自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-8；基因特异下游区段-8如序列表的序列40第22-42位核苷酸组成；下游引物-9自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-9；基因特异下游区段-9如序列表的序列41第22-42位核苷酸组成；下游引物-10自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-10；基因特异下游区段-10如序列表的序列42第22-40位核苷酸组成；下游引物-11自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-11；基因特异下游区段-11如序列表的序列43第22-40位核苷酸组成；下游引物-12自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-12；基因特异下游区段-12如序列表的序列44第22-42位核苷酸组成；下游引物-13自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-13；基因特异下游区段-13如序列表的序列45第22-43位核苷酸组成；
所有上游引物中的通用上游区段相同，通用上游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用上游引物3’端的15-25个核苷酸相同；所有下游引物中的通用下游区段相同，通用下游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用下游引物3’端的15-20个核苷酸相同。
所有上游引物均由所述两个区段组成。所有下游引物均由所述两个区段组成。
通用上游区段具体如序列表的序列48所示。通用下游区段具体如序列表的序列49所示。
本发明还保护一种引物组(引物组丙)，由如下45条引物组成：
上游引物-1自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-1；基因特异上游区段-1如序列表的序列1第30-54位核苷酸组成；上游引物-2自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-2；基因特异上游区段-2如序列表的序列2第30-53位核苷酸组成；上游引物-3自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-3；基因特异上游区段-3如序列表的序列3第30-51位核苷酸组成；上游引物-4自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-4；基因特异上游区段-4如序列表的序列4第30-52位核苷酸组成；上游引物-5自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-5；基因特异上游区段-5如序列表的序列5第30-53位核苷酸组成；上游引物-6自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-6；基因特异上游区段-6如序列表的序列6第30-52位核苷酸组成；上游引物-7自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-7；基因特异上游区段-7如序列表的序列7第30-52位核苷酸组成；上游引物-8自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-8；基因特异上游区段-8如序列表的序列8第30-52位核苷酸组成；上游引物-9自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-9；基因特异上游区段-9如序列表的序列9第30-52位核苷酸组成；上游引物-10自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-10；基因特异上游区段-10如序列表的序列10第30-52位核苷酸组成；上游引物-11自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-11；基因特异上游区段-11如序列表的序列11第30-53位核苷酸组成；上游引物-12自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-12；基因特异上游区段-12如序列表的序列12第30-53位核苷酸组成；上游引物-13自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-13；基因特异上游区段-13如序列表的序列13第30-53位核苷酸组成；上游引物-14自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-14；基因特异上游区段-14如序列表的序列14第30-55位核苷酸组成；上游引物-15自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-15；基因特异上游区段-15如序列表的序列15第30-51位核苷酸组成；上游引物-16自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-16；基因特异上游区段-16如序列表的序列16第30-51位核苷酸组成；上游引物-17自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-17；基因特异上游区段-17如序列表的序列17第30-54位核苷酸组成；上游引物-18自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-18；基因特异上游区段-18如序列表的序列18第30-53位核苷酸组成；上游引物-19自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-19；基因特异上游区段-19如序列表的序列19第30-53位核苷酸组成；上游引物-20自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-20；基因特异上游区段-20如序列表的序列20第30-51位核苷酸组成；上游引物-21自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-21；基因特异上游区段-21如序列表的序列21第30-54位核苷酸组成；上游引物-22自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-22；基因特异上游区段-22如序列表的序列22第30-51位核苷酸组成；上游引物-23自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-23；基因特异上游区段-23如序列表的序列23第30-55位核苷酸组成；上游引物-24自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-24；基因特异上游区段-24如序列表的序列24第30-52位核苷酸组成；上游引物-25自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-25；基因特异上游区段-25如序列表的序列25第30-54位核苷酸组成；上游引物-26自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-26；基因特异上游区段-26如序列表的序列26第30-49位核苷酸组成；上游引物-27自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-27；基因特异上游区段-27如序列表的序列27第30-53位核苷酸组成；上游引物-28自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-28；基因特异上游区段-28如序列表的序列28第30-54位核苷酸组成；上游引物-29自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-29；基因特异上游区段-29如序列表的序列29第30-48位核苷酸组成；上游引物-30自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-30；基因特异上游区段-30如序列表的序列30第30-47位核苷酸组成；上游引物-31自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-31；基因特异上游区段-31如序列表的序列31第30-53位核苷酸组成；上游引物-32自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-32；基因特异上游区段-32如序列表的序列32第30-52位核苷酸组成；
下游引物-1自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-1；基因特异下游区段-1如序列表的序列33第22-46位核苷酸组成；下游引物-2自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-2；基因特异下游区段-2如序列表的序列34第22-46位核苷酸组成；下游引物-3自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-3；基因特异下游区段-3如序列表的序列35第22-46位核苷酸组成；下游引物-4自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-4；基因特异下游区段-4如序列表的序列36第22-44位核苷酸组成；下游引物-5自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-5；基因特异下游区段-5如序列表的序列37第22-46位核苷酸组成；下游引物-6自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-6；基因特异下游区段-6如序列表的序列38第22-43位核苷酸组成；下游引物-7自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-7；基因特异下游区段-7如序列表的序列39第22-42位核苷酸组成；下游引物-8自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-8；基因特异下游区段-8如序列表的序列40第22-42位核苷酸组成；下游引物-9自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-9；基因特异下游区段-9如序列表的序列41第22-42位核苷酸组成；下游引物-10自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-10；基因特异下游区段-10如序列表的序列42第22-40位核苷酸组成；下游引物-11自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-11；基因特异下游区段-11如序列表的序列43第22-40位核苷酸组成；下游引物-12自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-12；基因特异下游区段-12如序列表的序列44第22-42位核苷酸组成；下游引物-13自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-13；基因特异下游区段-13如序列表的序列45第22-43位核苷酸组成；
所有上游引物中的通用上游区段相同，通用上游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用上游引物3’端的15-25个核苷酸相同；所有下游引物中的通用下游区段相同，通用下游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用下游引物3’端的15-20个核苷酸相同；
所有上游引物中的引物标签区段相同，引物标签区段由6-10个N组成(具体由8个N组成)。
所有上游引物均由所述三个区段组成。所有下游引物均由所述三个区段组成。
通用上游区段具体如序列表的序列48所示。通用下游区段具体如序列表的序列49所示。
本发明还保护以上任一所述引物组在制备DNA文库中的应用；所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
本发明还保护一种建立DNA文库的方法，依次包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用以上任一所述引物组进行PCR扩增(多重PCR扩增)，回收扩增产物；
(2)以扩增产物为模板，采用测序平台的通用上游引物和测序平台的通用下游引物进行PCR扩增，回收扩增产物，即为DNA文库；
所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
所述步骤(1)中，32条上游引物在反应体系中的浓度均可为0.001-1μM，具体均可为0.005-0.1μM，更具体均可为0.01-0.03μM，更具体均可为0.022μM。所述步骤(1)中，13条下游引物在反应体系中的浓度均可为0.001-1μM，具体均可为0.005-0.3μM，更具体均可为0.01-0.12μM，更具体均可为0.077μM。所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系具体如表1所示。32条上游引物在上游引物混合液中的浓度均为1μM。13条下游引物在下游引物混合液中的浓度均为1μM。所述步骤(1)中，PCR扩增的反应程序具体如表2所示。
所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系具体如表3所示。上游引物溶液中，通用上游引物的浓度为50μM。下游引物溶液中，通用下游引物的浓度为50μM。所述步骤(2)中，PCR扩增的反应程序具体如表4所示。
本发明还保护以上任一所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为制备DNA文库；所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
本发明还保护以上任一所述引物组的应用；所述应用为从人DNA中获得TCRβ链免疫组库。
本发明还保护一种从人DNA中获得TCRβ链免疫组库的方法，依次包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用以上任一所述引物组进行PCR扩增(多重PCR扩增)，回收扩增产物；
(2)以扩增产物为模板，采用测序平台的通用上游引物和测序平台的通用下游引物进行PCR扩增，回收扩增产物，即为DNA文库；
(3)将DNA文库进行高通量测序，获得TCRβ链免疫组库。
所述步骤(1)中，32条上游引物在反应体系中的浓度均可为0.001-1μM，具体均可为0.005-0.1μM，更具体均可为0.01-0.03μM，更具体均可为0.022μM。所述步骤(1)中，13条下游引物在反应体系中的浓度均可为0.001-1μM，具体均可为0.005-0.3μM，更具体均可为0.01-0.12μM，更具体均可为0.077μM。所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系具体如表1所示。32条上游引物在上游引物混合液中的浓度均为1μM。13条下游引物在下游引物混合液中的浓度均为1μM。所述步骤(1)中，PCR扩增的反应程序具体如表2所示。
所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系具体如表3所示。上游引物溶液中，通用上游引物的浓度为50μM。下游引物溶液中，通用下游引物的浓度为50μM。所述步骤(2)中，PCR扩增的反应程序具体如表4所示。
本发明还保护以上任一所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为从人DNA中获得TCRβ链免疫组库。
本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述引物组；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：
(a)制备DNA文库；所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库；
(b)从人DNA中获得TCRβ链免疫组库。
以上任一所述通用上游引物具体如序列表的序列46所示(3’末端的两个核苷酸之间的磷酸酯键为硫代磷酸酯键)。以上任一所述通用下游引物具体如序列表的序列47所示(3’末端的两个核苷酸之间的磷酸酯键为硫代磷酸酯键)。
以上任一所述测序平台具体可为Illumina平台。
以上任一所述进行高通量测序具体可为采用Illumina平台进行高通量测序。
以上任一所述待测样本为人。
以上任一所述基因组DNA可为从外周血中提取的基因组DNA。
以上任一所述基因组DNA也可从如下细胞中提取的基因组DNA：从外周血中分选获得的免疫细胞。
本发明中提供的引物组可以实现在一管中进行多重PCR扩增，再进行测序即可获得TCRβ链免疫组库。采用本发明提供的引物组或方法获得TCRβ链免疫组库，具有灵敏度高、特异性高、可重复性高、实验成本低的优势。
附图说明
图1为示例性的一个样本的V-J基因usage图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。CMpure磁珠：江苏康为世纪生物技术有限公司，CW2508。
实施例1、引物组的设计
基于大量序列分析、引物设计、引物组合和效果验证，筛选出一组性能良好的适于通过高通量测序检测人DNAβ链免疫组库的引物组。
引物组的靶序列覆盖人DNA中编码TCRβ链中特异区段的部分。特异区段为：V区中的下游部分、整个D区和整个J区。
引物组由32条上游引物和13条下游引物组成。
上游引物-1：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNATTTCACTCTGAAGATCCGGTCCAC-3’；
上游引物-2：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAAACAGTTCCAAATCGMTTCTCAC-3’；
上游引物-3：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCAAGTCGCTTCTCACCTGAATG-3’；
上游引物-4：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGCCAGTTCTCTAACTCTCGCTCT-3’；
上游引物-5：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTCAGGTCGCCAGTTCCCTAAYTAT-3’；
上游引物-6：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCACGTTGGCGTCTGCTGTACCCT-3’；
上游引物-7：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCAGGCTGGTGTCGGCTGCTCCCT-3’；
上游引物-8：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCAGGCTGGAGTCAGCTGCTCCCT-3’；
上游引物-9：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAGTCGCTTGCTGTACCCTCTCAG-3’；
上游引物-10：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGGGGTTGGAGTCGGCTGCTCCCT-3’；
上游引物-11：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGGGATCCGTCTCCACTCTGAMGAT-3’；
上游引物-12：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGGGATCCGTCTCTACTCTGAAGAT-3’；
上游引物-13：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGGGATCTTTCTCCACCTTGGAGAT-3’；
上游引物-14：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCT-3’；
上游引物-15：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCCTCACTCTGGAGTCTGCTGCC-3’；
上游引物-16：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCCTCACTCTGGAGTCMGCTACC-3’；
上游引物-17：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGCAGAGAGGCTCAAAGGAGTAGACT-3’；
上游引物-18：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGAAGGTGCAGCCTGCAGAACCCAG-3’；
上游引物-19：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGAAGATCCAGCCCTCAGAACCCAG-3’；
上游引物-20：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTCGATTCTCAGCTCAACAGTTC-3’；
上游引物-21：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGGAGGGACGTATTCTACTCTGAAGG-3’；
上游引物-22：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTTCTTGACATCCGCTCACCAGG-3’；
上游引物-23：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACGA-3’；
上游引物-24：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTAGATGAGTCAGGAATGCCAAAG-3’；
上游引物-25：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGG-3’；
上游引物-26：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAACCATGCAAGCCTGACCTT-3’；
上游引物-27：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCTCCCTGTCCCTAGAGTCTGCCAT-3’；
上游引物-28：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGCCCTCACATACCTCTCAGTACCTC-3’；
上游引物-29：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGATCCTGGAGTCGCCCAGC-3’；
上游引物-30：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNATTCTGGAGTCCGCCAGC-3’；
上游引物-31：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAACTCTGACTGTGAGCAACATGAG-3’；
上游引物-32：5’-TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCAGATCAGCTCTGAGGTGCCCCA-3’；
下游引物-1：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTACCTACAACTGTGAGTCTGGTG-3’；
下游引物-2：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTACCTACAACGGTTAACCTGGTC-3’；
下游引物-3：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTACCTACAACAGTGAGCCAACTT-3’；
下游引物-4：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGACAGAGAGCTGGGTTCCACT-3’；
下游引物-5：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTACCTAGGATGGAGAGTCGAGTC-3’；
下游引物-6：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATACCTGTCACAGTGAGCCTG-3’；
下游引物-7：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTCTTACCTAGCACGGTGA-3’；
下游引物-8：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTACCCAGTACGGTCAGCCT-3’；
下游引物-9：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGCTTACCGAGCACTGTCAG-3’；
下游引物-10：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCACTGAGAGCCGGGTCC-3’；
下游引物-11：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGCACCAGGAGCCGCGT-3’；
下游引物-12：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCGCCCAGCACGGTCAGCCT-3’；
下游引物-13：5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTACCTGTGACCGTGAGCCTG-3’；
M代表A/C，Y代表C/T。
上游引物-1至上游引物-32依次如序列表的序列1至序列32所示。下游引物-1至下游引物-13依次如序列表的序列33至序列45所示。
32条上游引物中具有相同的上游通用序列，见下划线标注的区域。上游引物中的8个N为引物标签(N为A、T、C或G)，对于每个样本来说，32条上游引物中具有的引物标签相同，每个样本采用独有的引物标签。13条下游引物中具有相同的下游通用序列，见下划线标注的区域。
实施例2、应用引物组构建人DNA TCR beta链免疫组库建库的DNA文库
1、取人全血，采用康为世纪Universal Genomic DNA Kit并按说明书操作，提取基因组DNA，得到DNA溶液。对DNA溶液进行DNA含量检测，DNA浓度不能低于50ng/μl。
2、取离心管，按照表1配制反应体系，混匀后短暂离心，然后置于PCR仪中进行扩增，反应程序见表2。
表1
上游引物混合液中的有效成分为实施例1中设计的32条上游引物，该32条上游引物在上游引物混合液中的浓度均为1μM。
下游引物混合液中的有效成分为实施例1中设计的13条下游引物，该13条下游引物在下游引物混合液中的浓度均为1μM。
2×Multiplex PCR Master Mix和5×Q-Solution均为Qiagen Multiplex PCRplus kit(#206151)的组分。
表2
3、取完成步骤2的离心管，加入50μl CMpure磁珠进行纯化。
纯化的具体步骤：用移液器吸打混匀至少五次，然后室温静置5分钟(使DNA充分被吸附在磁珠上)；将离心管置于磁力架上，室温静置5分钟后用移液器将澄清的液体移弃，向离心管中加入180μl 80％乙醇溶液，室温静置30s后用移液器将澄清的液体移弃，向离心管中加入180μl 80％乙醇溶液，室温静置30s后用移液器将澄清的液体移弃；将离心管从磁力架取下，用30-50μl无酶水将DNA从磁珠上洗脱下来，得到DNA溶液。
4、取离心管，按照表3配制反应体系(总体积为50μl)，然后置于PCR仪中进行扩增，反应程序见表4。
表3
| 试剂 | 加入量 |
| 5×HF buffer | 10μl |
| dNTP溶液 | 4.8μl |
| 上游引物溶液 | 2μl |
| Phusion聚合酶 | 1μl |
| 下游引物溶液 | 2μl |
| 步骤3制备的DNA溶液 | 30.2μl |
表3中的上游引物为PE1.0，序列如下(序列表的序列46)：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’；
表3中的下游引物为Barcode，序列如下(序列表的序列47)：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT*C-3’；
Barcode中的8个N为样本标签(N为A、T、C或G)，每个样本采用独有的样本标签。
PE1.0中，3’末端的两个核苷酸之间的磷酸酯键为硫代磷酸酯键(用*表示)。
Barcode中，3’末端的两个核苷酸之间的磷酸酯键为硫代磷酸酯键(用*表示)。
表3中的Phusion聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2U/μL)，Thermo#F530L。5×HF buffer为Phusion聚合酶的市售配套缓冲液。
表3中的dNTP溶液中，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为2.5mM。
上游引物溶液中，PE1.0的浓度为50μM。
下游引物溶液中，Barcode的浓度为50μM。
表4
5、取完成步骤4的离心管，加入50μl CMpure磁珠进行纯化。
纯化的具体步骤：用移液器吸打混匀至少五次，然后室温静置5分钟(使DNA充分被吸附在磁珠上)；将离心管置于磁力架上，室温静置5分钟后用移液器将澄清的液体移弃，向离心管中加入180μl 80％乙醇溶液，室温静置30s后用移液器将澄清的液体移弃，向离心管中加入180μl 80％乙醇溶液，室温静置30s后用移液器将澄清的液体移弃；将离心管从磁力架取下，用30-50μl无酶水将DNA从磁珠上洗脱下来，得到DNA溶液，该DNA溶液即为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
实施例3、效果验证
取5个志愿者的全血，按照实施例2的方法进行建库，得到DNA文库。
将5个DNA文库混合，然后用Illumina平台进行高通量测序。
数据结果统计见表5。测序结果经过生物信息学方法与IMGT数据库数据对比，得到的数据clean data占比在80％以上，与数据库中目标区域的mapped率在80％以上，满足目前项目分析的基本要求，Shannon entropy和Inverse Simpson's为多样性指数的结果。rawdata base，即原始数据量。cleandata base，即过滤后数据量。Successfully.aligned.reads，即成功比对上的reads数。Successfully.aliqned.percent，即成功比对百分比。Shannon entropy，即香农熵。Clonality即克隆率。Read count即Reads数。Clone count克隆数。cdr3count即Cdr3数。
表5
图1为示例性的一个样本的V-J基因usage图，反应了免疫系统免疫细胞的多样性，多样性越高，系统越稳定，对抗原的抵抗力也越强。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120> 一种基于高通量测序检测人DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组
<130> GNCYX182161
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna tttcactctg aagatccggt ccac 54
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna aacagttcca aatcgmttct cac 53
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc aagtcgcttc tcacctgaat g 51
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng ccagttctct aactctcgct ct 52
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnt caggtcgcca gttccctaay tat 53
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc acgttggcgt ctgctgtacc ct 52
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
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<223> n is a, c, g, or t
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<213> Artificial sequence
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<223> n is a, c, g, or t
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna gtcgcttgct gtaccctctc ag 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng gggttggagt cggctgctcc ct 52
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng ggatccgtct ccactctgam gat 53
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng ggatccgtct ctactctgaa gat 53
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<212> DNA
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng ggatctttct ccaccttgga gat 53
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc ctgacttgca ctctgaacta aacct 55
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 15
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc ctcactctgg agtctgctgc c 51
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<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc ctcactctgg agtcmgctac c 51
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 17
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng cagagaggct caaaggagta gact 54
<210> 18
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng aaggtgcagc ctgcagaacc cag 53
<210> 19
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng aagatccagc cctcagaacc cag 53
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnt cgattctcag ctcaacagtt c 51
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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<400> 21
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng gagggacgta ttctactctg aagg 54
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<212> DNA
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tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnt tcttgacatc cgctcaccag g 51
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 23
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc tgtagccttg agatccaggc tacga 55
<210> 24
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 24
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnt agatgagtca ggaatgccaa ag 52
<210> 25
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<221> misc_feature
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<400> 25
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnt cctttcctct cactgtgaca tcgg 54
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<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 26
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna accatgcaag cctgacctt 49
<210> 27
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 27
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc tccctgtccc tagagtctgc cat 53
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 28
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng ccctcacata cctctcagta cctc 54
<210> 29
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 29
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng atcctggagt cgcccagc 48
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<212> DNA
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<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 30
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna ttctggagtc cgccagc 47
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 31
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna actctgactg tgagcaacat gag 53
<210> 32
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc agatcagctc tgaggtgccc ca 52
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
agacgtgtgc tcttccgatc tcttacctac aactgtgagt ctggtg 46
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
agacgtgtgc tcttccgatc tcttacctac aacggttaac ctggtc 46
<210> 35
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 35
agacgtgtgc tcttccgatc tcttacctac aacagtgagc caactt 46
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 36
agacgtgtgc tcttccgatc taagacagag agctgggttc cact 44
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 37
agacgtgtgc tcttccgatc tcttacctag gatggagagt cgagtc 46
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 38
agacgtgtgc tcttccgatc tcatacctgt cacagtgagc ctg 43
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 39
agacgtgtgc tcttccgatc tccttcttac ctagcacggt ga 42
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 40
agacgtgtgc tcttccgatc tcttacccag tacggtcagc ct 42
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 41
agacgtgtgc tcttccgatc tccgcttacc gagcactgtc ag 42
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 42
agacgtgtgc tcttccgatc tagcactgag agccgggtcc 40
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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agacgtgtgc tcttccgatc tcgagcacca ggagccgcgt 40
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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agacgtgtgc tcttccgatc tctcgcccag cacggtcagc ct 42
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<211> 43
<212> DNA
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agacgtgtgc tcttccgatc tcttacctgt gaccgtgagc ctg 43
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<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 46
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 47
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
caagcagaag acggcatacg agnnnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 48
tacacgacgc tcttccgatc t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 49
agacgtgtgc tcttccgatc t 21
Claims (10)
1.引物组，由如下45条引物组成：
上游引物-1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；上游引物-2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；上游引物-3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；上游引物-4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；上游引物-5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；上游引物-6为序列表的序列6所示的单链DNA分子；上游引物-7为序列表的序列7所示的单链DNA分子；上游引物-8为序列表的序列8所示的单链DNA分子；上游引物-9为序列表的序列9所示的单链DNA分子；上游引物-10为序列表的序列10所示的单链DNA分子；上游引物-11为序列表的序列11所示的单链DNA分子；上游引物-12为序列表的序列12所示的单链DNA分子；上游引物-13为序列表的序列13所示的单链DNA分子；上游引物-14为序列表的序列14所示的单链DNA分子；上游引物-15为序列表的序列15所示的单链DNA分子；上游引物-16为序列表的序列16所示的单链DNA分子；上游引物-17为序列表的序列17所示的单链DNA分子；上游引物-18为序列表的序列18所示的单链DNA分子；上游引物-19为序列表的序列19所示的单链DNA分子；上游引物-20为序列表的序列20所示的单链DNA分子；上游引物-21为序列表的序列21所示的单链DNA分子；上游引物-22为序列表的序列22所示的单链DNA分子；上游引物-23为序列表的序列23所示的单链DNA分子；上游引物-24为序列表的序列24所示的单链DNA分子；上游引物-25为序列表的序列25所示的单链DNA分子；上游引物-26为序列表的序列26所示的单链DNA分子；上游引物-27为序列表的序列27所示的单链DNA分子；上游引物-28为序列表的序列28所示的单链DNA分子；上游引物-29为序列表的序列29所示的单链DNA分子；上游引物-30为序列表的序列30所示的单链DNA分子；上游引物-31为序列表的序列31所示的单链DNA分子；上游引物-32为序列表的序列32所示的单链DNA分子；
下游引物-1为序列表的序列33所示的单链DNA分子；下游引物-2为序列表的序列34所示的单链DNA分子；下游引物-3为序列表的序列35所示的单链DNA分子；下游引物-4为序列表的序列36所示的单链DNA分子；下游引物-5为序列表的序列37所示的单链DNA分子；下游引物-6为序列表的序列38所示的单链DNA分子；下游引物-7为序列表的序列39所示的单链DNA分子；下游引物-8为序列表的序列40所示的单链DNA分子；下游引物-9为序列表的序列41所示的单链DNA分子；下游引物-10为序列表的序列42所示的单链DNA分子；下游引物-11为序列表的序列43所示的单链DNA分子；下游引物-12为序列表的序列44所示的单链DNA分子；下游引物-13为序列表的序列45所示的单链DNA分子。
2.引物组，由如下45条引物组成：
上游引物-1自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-1；基因特异上游区段-1如序列表的序列1第30-54位核苷酸组成；上游引物-2自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-2；基因特异上游区段-2如序列表的序列2第30-53位核苷酸组成；上游引物-3自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-3；基因特异上游区段-3如序列表的序列3第30-51位核苷酸组成；上游引物-4自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-4；基因特异上游区段-4如序列表的序列4第30-52位核苷酸组成；上游引物-5自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-5；基因特异上游区段-5如序列表的序列5第30-53位核苷酸组成；上游引物-6自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-6；基因特异上游区段-6如序列表的序列6第30-52位核苷酸组成；上游引物-7自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-7；基因特异上游区段-7如序列表的序列7第30-52位核苷酸组成；上游引物-8自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-8；基因特异上游区段-8如序列表的序列8第30-52位核苷酸组成；上游引物-9自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-9；基因特异上游区段-9如序列表的序列9第30-52位核苷酸组成；上游引物-10自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-10；基因特异上游区段-10如序列表的序列10第30-52位核苷酸组成；上游引物-11自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-11；基因特异上游区段-11如序列表的序列11第30-53位核苷酸组成；上游引物-12自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-12；基因特异上游区段-12如序列表的序列12第30-53位核苷酸组成；上游引物-13自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-13；基因特异上游区段-13如序列表的序列13第30-53位核苷酸组成；上游引物-14自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-14；基因特异上游区段-14如序列表的序列14第30-55位核苷酸组成；上游引物-15自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-15；基因特异上游区段-15如序列表的序列15第30-51位核苷酸组成；上游引物-16自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-16；基因特异上游区段-16如序列表的序列16第30-51位核苷酸组成；上游引物-17自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-17；基因特异上游区段-17如序列表的序列17第30-54位核苷酸组成；上游引物-18自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-18；基因特异上游区段-18如序列表的序列18第30-53位核苷酸组成；上游引物-19自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-19；基因特异上游区段-19如序列表的序列19第30-53位核苷酸组成；上游引物-20自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-20；基因特异上游区段-20如序列表的序列20第30-51位核苷酸组成；上游引物-21自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-21；基因特异上游区段-21如序列表的序列21第30-54位核苷酸组成；上游引物-22自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-22；基因特异上游区段-22如序列表的序列22第30-51位核苷酸组成；上游引物-23自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-23；基因特异上游区段-23如序列表的序列23第30-55位核苷酸组成；上游引物-24自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-24；基因特异上游区段-24如序列表的序列24第30-52位核苷酸组成；上游引物-25自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-25；基因特异上游区段-25如序列表的序列25第30-54位核苷酸组成；上游引物-26自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-26；基因特异上游区段-26如序列表的序列26第30-49位核苷酸组成；上游引物-27自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-27；基因特异上游区段-27如序列表的序列27第30-53位核苷酸组成；上游引物-28自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-28；基因特异上游区段-28如序列表的序列28第30-54位核苷酸组成；上游引物-29自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-29；基因特异上游区段-29如序列表的序列29第30-48位核苷酸组成；上游引物-30自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-30；基因特异上游区段-30如序列表的序列30第30-47位核苷酸组成；上游引物-31自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-31；基因特异上游区段-31如序列表的序列31第30-53位核苷酸组成；上游引物-32自上游至下游依次包括如下两个区段：通用上游区段和基因特异上游区段-32；基因特异上游区段-32如序列表的序列32第30-52位核苷酸组成；
下游引物-1自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-1；基因特异下游区段-1如序列表的序列33第22-46位核苷酸组成；下游引物-2自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-2；基因特异下游区段-2如序列表的序列34第22-46位核苷酸组成；下游引物-3自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-3；基因特异下游区段-3如序列表的序列35第22-46位核苷酸组成；下游引物-4自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-4；基因特异下游区段-4如序列表的序列36第22-44位核苷酸组成；下游引物-5自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-5；基因特异下游区段-5如序列表的序列37第22-46位核苷酸组成；下游引物-6自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-6；基因特异下游区段-6如序列表的序列38第22-43位核苷酸组成；下游引物-7自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-7；基因特异下游区段-7如序列表的序列39第22-42位核苷酸组成；下游引物-8自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-8；基因特异下游区段-8如序列表的序列40第22-42位核苷酸组成；下游引物-9自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-9；基因特异下游区段-9如序列表的序列41第22-42位核苷酸组成；下游引物-10自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-10；基因特异下游区段-10如序列表的序列42第22-40位核苷酸组成；下游引物-11自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-11；基因特异下游区段-11如序列表的序列43第22-40位核苷酸组成；下游引物-12自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-12；基因特异下游区段-12如序列表的序列44第22-42位核苷酸组成；下游引物-13自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-13；基因特异下游区段-13如序列表的序列45第22-43位核苷酸组成；
所有上游引物中的通用上游区段相同，通用上游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用上游引物3’端的15-25个核苷酸相同；所有下游引物中的通用下游区段相同，通用下游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用下游引物3’端的15-20个核苷酸相同。
3.引物组，由如下45条引物组成：
上游引物-1自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-1；基因特异上游区段-1如序列表的序列1第30-54位核苷酸组成；上游引物-2自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-2；基因特异上游区段-2如序列表的序列2第30-53位核苷酸组成；上游引物-3自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-3；基因特异上游区段-3如序列表的序列3第30-51位核苷酸组成；上游引物-4自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-4；基因特异上游区段-4如序列表的序列4第30-52位核苷酸组成；上游引物-5自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-5；基因特异上游区段-5如序列表的序列5第30-53位核苷酸组成；上游引物-6自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-6；基因特异上游区段-6如序列表的序列6第30-52位核苷酸组成；上游引物-7自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-7；基因特异上游区段-7如序列表的序列7第30-52位核苷酸组成；上游引物-8自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-8；基因特异上游区段-8如序列表的序列8第30-52位核苷酸组成；上游引物-9自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-9；基因特异上游区段-9如序列表的序列9第30-52位核苷酸组成；上游引物-10自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-10；基因特异上游区段-10如序列表的序列10第30-52位核苷酸组成；上游引物-11自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-11；基因特异上游区段-11如序列表的序列11第30-53位核苷酸组成；上游引物-12自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-12；基因特异上游区段-12如序列表的序列12第30-53位核苷酸组成；上游引物-13自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-13；基因特异上游区段-13如序列表的序列13第30-53位核苷酸组成；上游引物-14自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-14；基因特异上游区段-14如序列表的序列14第30-55位核苷酸组成；上游引物-15自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-15；基因特异上游区段-15如序列表的序列15第30-51位核苷酸组成；上游引物-16自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-16；基因特异上游区段-16如序列表的序列16第30-51位核苷酸组成；上游引物-17自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-17；基因特异上游区段-17如序列表的序列17第30-54位核苷酸组成；上游引物-18自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-18；基因特异上游区段-18如序列表的序列18第30-53位核苷酸组成；上游引物-19自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-19；基因特异上游区段-19如序列表的序列19第30-53位核苷酸组成；上游引物-20自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-20；基因特异上游区段-20如序列表的序列20第30-51位核苷酸组成；上游引物-21自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-21；基因特异上游区段-21如序列表的序列21第30-54位核苷酸组成；上游引物-22自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-22；基因特异上游区段-22如序列表的序列22第30-51位核苷酸组成；上游引物-23自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-23；基因特异上游区段-23如序列表的序列23第30-55位核苷酸组成；上游引物-24自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-24；基因特异上游区段-24如序列表的序列24第30-52位核苷酸组成；上游引物-25自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-25；基因特异上游区段-25如序列表的序列25第30-54位核苷酸组成；上游引物-26自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-26；基因特异上游区段-26如序列表的序列26第30-49位核苷酸组成；上游引物-27自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-27；基因特异上游区段-27如序列表的序列27第30-53位核苷酸组成；上游引物-28自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-28；基因特异上游区段-28如序列表的序列28第30-54位核苷酸组成；上游引物-29自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-29；基因特异上游区段-29如序列表的序列29第30-48位核苷酸组成；上游引物-30自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-30；基因特异上游区段-30如序列表的序列30第30-47位核苷酸组成；上游引物-31自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-31；基因特异上游区段-31如序列表的序列31第30-53位核苷酸组成；上游引物-32自上游至下游依次包括如下三个区段：通用上游区段、引物标签区段和基因特异上游区段-32；基因特异上游区段-32如序列表的序列32第30-52位核苷酸组成；
下游引物-1自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-1；基因特异下游区段-1如序列表的序列33第22-46位核苷酸组成；下游引物-2自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-2；基因特异下游区段-2如序列表的序列34第22-46位核苷酸组成；下游引物-3自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-3；基因特异下游区段-3如序列表的序列35第22-46位核苷酸组成；下游引物-4自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-4；基因特异下游区段-4如序列表的序列36第22-44位核苷酸组成；下游引物-5自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-5；基因特异下游区段-5如序列表的序列37第22-46位核苷酸组成；下游引物-6自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-6；基因特异下游区段-6如序列表的序列38第22-43位核苷酸组成；下游引物-7自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-7；基因特异下游区段-7如序列表的序列39第22-42位核苷酸组成；下游引物-8自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-8；基因特异下游区段-8如序列表的序列40第22-42位核苷酸组成；下游引物-9自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-9；基因特异下游区段-9如序列表的序列41第22-42位核苷酸组成；下游引物-10自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-10；基因特异下游区段-10如序列表的序列42第22-40位核苷酸组成；下游引物-11自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-11；基因特异下游区段-11如序列表的序列43第22-40位核苷酸组成；下游引物-12自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-12；基因特异下游区段-12如序列表的序列44第22-42位核苷酸组成；下游引物-13自上游至下游依次包括如下两个区段：通用下游区段和基因特异下游区段-13；基因特异下游区段-13如序列表的序列45第22-43位核苷酸组成；
所有上游引物中的通用上游区段相同，通用上游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用上游引物3’端的15-25个核苷酸相同；所有下游引物中的通用下游区段相同，通用下游区段5’端的15-25个核苷酸与测序平台的通用下游引物3’端的15-20个核苷酸相同；
所有上游引物中的引物标签区段相同，引物标签区段由6-10个N组成。
4.权利要求1或2或3所述引物组在制备DNA文库中的应用；所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
5.一种建立DNA文库的方法，依次包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2或3所述引物组进行PCR扩增，回收扩增产物；
(2)以扩增产物为模板，采用测序平台的通用上游引物和测序平台的通用下游引物进行PCR扩增，回收扩增产物，即为DNA文库；
所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
6.权利要求1或2或3所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为制备DNA文库；所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库。
7.权利要求1或2或3所述引物组的应用；所述应用为从人DNA中获得TCRβ链免疫组库。
8.一种从人DNA中获得TCRβ链免疫组库的方法，依次包括如下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2或3所述引物组进行PCR扩增，回收扩增产物；
(2)以扩增产物为模板，采用测序平台的通用上游引物和测序平台的通用下游引物进行PCR扩增，回收扩增产物，即为DNA文库；
(3)将DNA文库进行高通量测序，获得TCRβ链免疫组库。
9.权利要求1或2或3所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为从人DNA中获得TCRβ链免疫组库。
10.一种试剂盒，包括权利要求1或2或3所述引物组；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：
(a)制备DNA文库；所述DNA文库为人DNA中编码TCRβ链免疫组库的DNA文库；
(b)从人DNA中获得TCRβ链免疫组库。
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| Title |
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| XIANLIANG HOU ET AL: "The conserved T cell receptor repertoire observed in patients with systemic lupus erythematosus", 《INT J CLIN EXP MED》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113122618A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-07-16 | 武汉弘康医学检验实验室股份有限公司 | 一种基于高通量测序精准检测t细胞免疫组库的方法及其引物体系 |
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