CN109090483A - 一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，包括：(1)优势菌株的选取与活化：从豆豉诸多细菌中筛选出来芽孢杆菌属亚种菌株A和B、C菌种，活化后用培养基培养，所得活化菌液备用；(2)制备黄豆培养床：挑选颗粒饱满的黄豆，用冷水浸泡，沥干，高压蒸煮，取出冷却，即为黄豆培养床；(3)菌株的培养制曲：在无菌条件下，将活化菌液接种到黄豆培养床中，混匀，按照优化培养条件制曲，即得直投式细菌型豆豉复合发酵剂。本方法对制备工艺进行优化，在不添加稳定剂、增稠剂和防腐剂的情况下，能很好地提高豆制品的稳定性和营养价值，同时降低生产成本和增强食品的安全性，为工厂标准化奠定基础，适用于食品豆豉的发酵工艺。

Description

一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，属于细菌型豆豉发酵剂制备技术领域。
背景技术
某些地区的豆豉属于细菌型发酵豆豉，它是利用芽胞杆菌类细菌发酵蒸熟的大豆，因其蛋白酶分解蛋白质等营养物质生产出风味独特的豆豉。细菌型豆豉含有大量的蛋白质、维生素(VB1、VB2和VE等)以及多种保健成分，例如大豆异黄酮、氨基酸和多肽等。豆豉可药食同源，具有缓解疲劳、虚弱、失眠和食欲不振的作用，并有研究表明，豆豉还具有抗糖尿病特性，能够很好的预防和治疗糖尿病。但是豆豉在自然发酵过程中品质不稳定，会受到季节限制；同时在发酵过程中一些杂菌污染产生的毒素，如具有强致癌的黄曲霉毒素，这使得豆豉产品的安全性降低，对食用者的生命健康也构成严重的威胁。
中国专利数据库中涉及细菌型豆豉发酵的专利申请有：申请号为2006101554310、发明名称为“细菌型豆豉直投式发酵菌剂的制作方法”；申请号为2016110600025、发明名称为“一种细菌发酵型黑豆豆豉的制备方法”等。虽然已经有关于细菌型豆豉发酵菌剂研究的报道，如：细菌型豆豉的研究现状及发展前景{J},中国酿造2007,3；又如：细菌型豆豉发酵机理及功能性研究[D],山东农业大学，2011,5等，但这些科研成果尚未成为工业技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，以期提高菌株产蛋白酶活力，缩短发酵时间，使豆豉品质稳定及减少有毒有害物质产生，提高食用安全性。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)优势菌株的选取与活化：从诸多细菌型菌株中选取出3株均属于杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属，分别为枯草芽孢杆菌A(Bacillus subtilisLC360095.1)和枯草芽孢杆菌B(Bacillus subtilis AY881635.1)、枯草芽孢杆菌C(Bacillus subtilisMF581443.1)，活化后用培养基培养，所得活化菌液备用；
(2)制备黄豆培养床：挑选颗粒饱满的黄豆，用冷水浸泡后沥干，高压蒸煮，取出冷却，得到黄豆培养床备用；
(3)菌株的优化培养制曲：在无菌条件下，将步骤(1)的活化菌液接种到黄豆培养床中，混匀，按照优化培养条件制曲，即得最佳条件下生长的菌株；
(4)制备复合菌剂：对菌株A、B和C进行扩大摇床培养，分别接种于l000mL的三角瓶，离心，弃上清发酵残液，收集菌体，然后添加乳化剂和淀粉，干燥，即得直投式细菌型豆豉复合发酵剂。
前述步骤(1)中，所述用培养基培养的时间为24小时。
前述步骤(1)中，所述培养基是牛肉膏蛋白胨液体，其成分为：蛋白胨10g、牛肉膏粉3g以及氯化钠5g，加蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.4。
前述步骤(2)中，所述冷水浸泡的豆水比为1∶1～3，浸泡时间12h；所述高压蒸煮的压力控制在0.1MPa,温度控制在115℃，蒸煮时间为30min；所述冷却温度为30℃～40℃。
前述步骤(3)中，所述优化培养条件是：菌种配比为A∶B∶C＝1～3∶1～2∶1～3；菌种接种量为1％～9％；培养时间为24h～72h，培养温度为25℃～45℃。
前述步骤(4)中，所述摇床速度为140～160r/min，扩大培养时间为46～50h，
前述步骤(4)中，所述乳化剂是司盘60。
由于采用了上述技术方案，本发明的优点为：本发明对细菌型豆豉复合发酵剂的制备工艺进行优化，在不添加稳定剂、增稠剂和防腐剂的情况下，能很好地提高豆制品的稳定性和营养价值，同时降低生产成本和增强食品的安全性，为工厂标准化奠定基础，适用于食品豆豉的发酵工艺。而且该方法缩短发酵时间，使豆豉品质稳定及减少有毒有害物质产生，提高了安全性。
附图说明
图1为酪氨酸标准曲线示意图；
图2为培养时间与蛋白酶活力关系图；
图3为培养温度与蛋白酶活力关系图；
图4为菌种配比与蛋白酶活力关系图；
图5为接种量与蛋白酶活力关系图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明的实施例：一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)优势菌株的选取与活化：从诸多细菌型菌株中选取出3株均属于杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属，分别为枯草芽孢杆菌A(Bacillus subtilisLC360095.1)和枯草芽孢杆菌B(Bacillus subtilis AY881635.1)、枯草芽孢杆菌C(Bacillus subtilisMF581443.1)，活化后用培养基培养，所得活化菌液备用；所述培养基是牛肉膏蛋白胨液体，其成分为：蛋白胨10g、牛肉膏粉3g以及氯化钠5g，加蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.4；
(2)制备黄豆培养床：挑选颗粒饱满的黄豆，用冷水浸泡后沥干，高压蒸煮，取出冷却，所述冷却温度为35℃，得到黄豆培养床备用；所述冷水浸泡的豆水比为1∶3，浸泡时间12h；所述高压蒸煮的压力控制在0.1MPa,温度控制在115℃，蒸煮时间为30min；
(3)菌株的优化培养制曲：在无菌条件下，将步骤(1)的活化菌液接种到黄豆培养床中，混匀，按照优化培养条件制曲，即得最佳条件下生长的菌株；所述优化培养条件是：菌种配比为A∶B∶C＝1∶1∶1；菌种接种量为5％；培养时间为48h，培养温度为35℃。
(4)制备复合菌剂：对菌株A、B和C进行扩大摇床培养，分别接种于l000mL的三角瓶，离心，弃上清发酵残液，收集菌体，然后添加司盘60和淀粉，干燥，即得直投式细菌型豆豉复合发酵剂；所述摇床速度为150r/min，扩大培养时间为48h。
上述技术方案为本发明的最优方案，以下为实验过程；
菌种在培养过程中受到很多因素的影响，但主要受培养时间、培养温度、接菌量以及菌种配比等影响，这些因素可能会对菌种产蛋白酶活力大小产生影响，因此，选定不同的培养时间、培养温度、接菌量和菌种配比，分别做单因素实验，获得菌种产蛋白酶活力最大时的单因素，从而大致确定菌种最佳的培养条件。蛋白酶活力测定法参照(SB/T 10317—1999)绘制出标准曲线见图1，通过测定吸光度计算出酶活性大小，筛选出蛋白酶活力较高的菌株。
先分别以培养时间、培养温度、接菌量和菌种配比，做单因素实验，获得菌种产蛋白酶活力最大时的单因素，从而大致确定菌种的优化培养条件；然后通过上述4因素的水平正交试验对制备直投式细菌型豆豉复合发酵剂的工艺进行优化，确定优化培养条件：
①培养时间对菌株产蛋白酶活力的影响
按照拟定的实验方法测定优势菌株在24h、36h、48h、60h、72h不同时间段上测定培养时间和蛋白酶活力的关系，绘制蛋白酶活力曲线，如图2所示。试验结果是：在24h～72h时间段内，随着培养时间的延长蛋白酶活力先增大后下降。菌种液体培养24h时，酶活力是最小为26.64u/mL，因为此时菌种数量小，不能最大的分解培养基中的养分，而造成酶活力较小。培养时间在48h时，酶活力达到最大为43.42u/mL，此时活菌数达到最大，菌种充分利用培养基中养分。当菌种随着培养时间进一步延长，酶活力不断下降，这可能是培养基的养分减少，不能满足菌种的需要，所以导致酶活力下降。因此，菌种培养时间最佳为48h，在此条件下，菌种产蛋白酶活力最高。
②培养温度对菌株产蛋白酶活力的影响
按照拟定的实验方法测定优势菌株A、B、C在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃不同温度条件下测定培养温度和蛋白酶活力的关系，绘制蛋白酶活力曲线，如图3所示。试验结果是：在25℃～45℃范围内，随着培养温度的升高，蛋白酶活力先增大后下降，高温或低温对菌种蛋白酶大小都会有一定抑制作用。当温度为25℃时，由于温度低，菌种的生长受到抑制，此时产蛋白酶活力为28.69u/mL；当温度在35℃左右时，蛋白酶活力达到最大为42.43u/mL，是菌株生长的最佳温度；当温度继续增加时，菌株产蛋白酶活力的能力逐渐降低。所以菌种培养温度最佳为35℃，在此条件下，菌种产蛋白酶活力最高。
③菌种配比对菌株产蛋白酶活力的影响
按照拟定的实验方法测定优势菌株A、B、C在菌种配比分别为3∶2∶1、1∶2∶1、1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶3不同菌种的质量配比测定其和蛋白酶活力的关系，绘制蛋白酶活力曲线，如图4所示。试验结果是：优势菌株A、B、C按不同比例发酵差异很大，当菌种配比为1∶2∶3时，产蛋白酶是最低的为21.93u/mL；当菌种配比为1∶1∶1时，产蛋白酶活力达到最大为45.28u/mL。所以菌种配比最佳为1∶1∶1，在此条件下，菌种产蛋白酶活力最高。
④接种量对菌株产蛋白酶活力的影响
按照拟定的实验方法测定优势菌株A、B、C在接种量分别为1％、3％、5％、7％、9％时测定接种量和蛋白酶活力的关系，绘制蛋白酶活力曲线，如图5所示。试验结果是：在1％～9％接种量内，随着接种量的增加蛋白酶活力先增大后下降。菌体多，培养基养分供应不足；菌体少，产蛋白酶活力不足，所以适当的接种量对于整个豆豉发酵工艺有至关重要的作用。当接种量为1％时，产蛋白酶是最低的为28.71u/mL；当接种量为5％时，产蛋白酶活力达到最大，为37.44u/mL。因此，菌种接种量最佳为5％，在此条件下，菌种产蛋白酶活力最高。
通过对单因素试验结果分析，确定以培养时间、培养温度、接菌量和菌种配比，进行四因素四水平L16(44)正交优化试验，以菌种产蛋白酶活力为判断依据，优化菌种生长条件。通过SPSS Statistics 17.0软件程序进行数据分析，对制备工艺进行优化，以获得直投式细菌型豆豉复合发酵剂最佳制备工艺参数，正交试验的结果见下表：
表1正交试验优化结果
表2正交试验方差分析
由表1可知，在考察培养时间、培养温度、菌种配比、接种量4个实验因素对菌种生长条件中，各因素对菌种产蛋白酶活力影响主次顺序为：培养时间＞培养温度＞接种量＞菌种配比，即培养时间对菌种产蛋白活力的影响最大，其次是培养温度和接种量，菌种配比对产蛋白酶活力的影响最小。同时还可以看出：培养时间的最佳时间为第二水平，即48h酶活力可达到最大；培养温度的最佳温度为第二水平，即35℃；接种量的最佳添加量为第二水平，即5％；菌种配比最佳比例为第二水平，即1:1:1，显然这与单因素实验分析的结果相吻合。另外，从极差值R分析来看，空列(误差)的极差值(R＝0.75)小于4个因素的极差值(R＝3，3.01，1.85，1.24)，可以看出空列(误差)对整个实验的影响最小，这说明实验具有良好的准确性，实验结果可靠。由表2方差分析可知，培养时间和培养温度对菌株产蛋白具有显著影响(p＜0.05)，而接种量和菌种配比对菌株产蛋白酶活力影响不显著，较优的生长条件为A2B2C2D2，该组合酶活力达到42.48u/mL。因此，在分析培养时间、培养温度、菌种配比、接种量四因素对3株优势菌株产蛋白酶活力影响的四因素四水平正交实验结果可得，A、B、C三株菌的最佳生长条件为为：培养时间为48h，培养温度为35℃，接种量为5％，菌种质量配比为1∶1∶1。
按上述菌株的最佳生长条件对芽孢杆菌株A、B和C进行扩大培养，分别接种于l000mL的三角瓶150r/min的速度培养48h，每次取320mL发酵液放入离心管中配平，3000r/min离心3min，弃上清发酵残液，收集菌体。菌株A、B、C离心抽滤得到菌泥16.6998g，添加司盘60为0.0162g，添加淀粉7.8072g，在40℃培养箱中干燥6h，最终含水量15％，真空包装。
本发明将三株芽孢杆菌A、B、C进行生长生长条件优化，通过单因素实验得出三株菌混菌发酵的最佳生长条件为：培养时间48h，培养温度35℃，菌种配比1:1:1，接种量5％。通过正交优化试验得出最佳优化组合为A2B2C2D2，该组合下菌株酶活力为42.48u/mL，且培养温度和时间对菌种的生长具有显著性差异(p＜0.05)。本试验在不添加稳定剂、增稠剂和防腐剂的情况下，能很好地提高乳制品的稳定性和营养价值，同时降低生产成本和增强食品的安全性，以期为工厂实现标准化奠定基础。

Claims (7)

1.一种直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)优势菌株的选取与活化：从诸多细菌型菌株中选取出3株均属于杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属，分别为枯草芽孢杆菌A(Bacillus subtilis LC360095.1)和枯草芽孢杆菌B(Bacillus subtilis AY881635.1)、枯草芽孢杆菌C(Bacillus subtilisMF581443.1)，活化后用培养基培养，所得活化菌液备用；
(2)制备黄豆培养床：挑选颗粒饱满的黄豆，用冷水浸泡后沥干，高压蒸煮，取出冷却，得到黄豆培养床备用；
(3)菌株的优化培养制曲：在无菌条件下，将步骤(1)的活化菌液接种到黄豆培养床中，混匀，按照优化培养条件制曲，即得最佳条件下生长的菌株；
(4)制备复合菌剂：对菌株A、B和C进行扩大摇床培养，分别接种于l000mL的三角瓶，离心，弃上清发酵残液，收集菌体，然后添加乳化剂和淀粉，干燥，即得直投式细菌型豆豉复合发酵剂。
2.根据权利要求1所述的直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述用培养基培养的时间为24小时。
3.根据权利要求1所述的直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述培养基是牛肉膏蛋白胨液体，其成分为：蛋白胨10g、牛肉膏粉3g以及氯化钠5g，加蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.4。
4.根据权利要求1所述的直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述冷水浸泡的豆水比为1∶1～3，浸泡时间12h；所述高压蒸煮的压力控制在0.1MPa,温度控制在115℃，蒸煮时间为30min；所述冷却温度为30℃～40℃。
5.根据权利要求1所述的直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述优化培养条件是：菌种配比为A∶B∶C＝1～3∶1～2∶1～3；菌种接种量为1％～9％；培养时间为24h～72h，培养温度为25℃～45℃。
6.根据权利要求1所述的直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述摇床速度为140～160r/min，扩大培养时间为46～50h。
7.根据权利要求1所述的直投式细菌型豆豉复合发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述乳化剂是司盘60。
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