CN108949910A - 一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器 - Google Patents

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王恩惠
代佳丽
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Abstract

本发明公开了一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器。所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，包括以下步骤：(1)探针制备；(2)生物传感器制备；(3)miRNA表达谱检测。所述生物传感器，包括氧化石墨烯基质、以及具有特异发射光谱的量子点标记的miRNA‑量子点探针，所述miRNA‑量子点探针通过π‑π堆积作用与所述氧化石墨烯基质吸附。本发明设计简单、扩增特异性高、成本低。

Description

一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种高通量miRNAs标志物的检测方法生物传感器。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为19～24个核苷酸的非编码小RNA分子，在生物进化中相对保守，不编码蛋白质，但它能通过直接与靶mRNA 3’非翻译区的结合以此调节靶基因。研究表明，miRNAs可调控约60％的基因表，在细胞发展的过程如发育、变异、增殖和细胞凋亡中扮演着重要角色，在疾病的各个发展阶段发挥着非常重要的作用。多种miRNAs在各种肿瘤中 (如肺癌、乳腺癌、结肠癌等)呈现异常表达。表达上调的miRNAs可能发挥与癌基因相似的作用(即促癌作用)，而表达下调的miRNAs可能发挥与抑癌基因有相似的作用(即抑癌作用)，这对肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有十分重要的指导意义。因而，miRNAs作为一种新型的肿瘤标志物，备受关注。
miRNAs具有低丰度，高序列同源性和短序列的特征。正是这些特征使得miRNAs的检测困难重重。目前检测低含量miRNAs的主要方法之一是聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)，但由于其序列短，不能直接作为PCR扩增的模板，因此目前多采用逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)。由于其广泛的动态范围和高精度，已成为miRNAs定量的“金标准”方法。miRNA的逆转录方法，常见的有两种：一种是茎环RT引物法，另一种是聚A聚合酶法。Schmittgen等开发了SYBR Green RT-PCR方法来定量前体和前体miRNA。改进后的方法大大提高了RT- PCR的效率，提高检测miRNA的灵敏度和特异性，但是需要复杂的设计和昂贵的费用，具有一定的局限性(Methods,2008,44:31-38)。恒温核酸扩增技术(Isothermal Nucleic Acid Testing,INAT)是在恒定温度下扩增核酸的技术，与PCR、定量RT-PCR等核酸扩增方法相比，最大的区别就在于其反应温度的单一性。因此INAT技术在水浴锅、金属浴，甚至在一个保温效果好的保温杯中即可完成反应，大大缩减甚至消除了PCR等技术所需要的精密而复杂的变温仪器，大大简化了核酸检测的操作步骤，非常适用于现场与临床快速检测。常见的有依赖于核酸序列的扩增、滚环扩增、等温指数扩增等，但都存在设计复杂、非特异性扩增、扩增效率低下等问题。
同时，miRNA的表达模式相比单一miRNA的表达量而言，能更准确的反映细胞状态和生理病理过程，然而目前尚无技术能一次批量检测多中miRNA 的表达量从而构建miRNA的表达模式图谱。目前的miRNA表达模式图谱是多次检测获得的miRNA表达丰度谱，不能准确反映细胞的状态。
量子点(quantumdots,QDs)又称半导体纳米微晶体，是一种纳米材料，由于其高量子产率和宽激发范围，在一个可检测到的光谱范围内，可同时使用多个探针而发射光谱不出现交叠，是组合检测多种miRNAs生物标志物的理想荧光标签。氧化石墨烯，作为一种单原子二维无机碳纳米材料，由于其独特的物理性质，潜在的应用于纳米电子器件、透明导体和纳米复合材料等，迅速在材料领域崛起。2012年，cui等人使用了基于氧化石墨烯保护的酶循环放大的方法来对复杂样品中多种miRNA进行单一分析(Chemical Communications,2012,48:194-196)。这种方法利用氧化石墨烯本身能够吸附探针，并对多种荧光具有淬灭作用，能区分极为相似的不同miRNA的序列。由于简单易得，相对金属氧化物，对环境污染和人体健康伤害小，氧化石墨烯越来越受到研究者们的青睐。但相关研究大多局限于单个miRNA分子的检测或者多个激发光分别检测，费时费力，成本较高。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种一种高通量 miRNAs标志物的检测方法生物传感器，其目的在于通过改进引物生成-恒温滚环扩增方法，将量子点(QDs)和氧化石墨烯(GO)这两种纳米材料结合起来，构建了一种特异性同时检测生物标志物miRNAs的纳米生物传感器方法，由此解决了设计复杂、非特异性扩增、成本高以及miRNA家族多，同源性高，难于区分的问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种高通量miRNAs 表达谱的检测方法，包括以下步骤：
(1)探针制备：对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA，将其互补的探针序列与具有特异发射光谱的量子点共价结合，获得具有特异发射光谱的miRNA-量子点探针；
(2)生物传感器制备：将步骤(1)中获得的所有具有特异发射光谱的 miRNA-量子点探针与氧化石墨烯室温孵化，使得所述miRNA-量子点探针吸附在所述纳米石墨烯表面，获得miRNAs纳米生物传感器；
(3)miRNA表达谱检测：将经扩增的待检测寡核苷酸混合物与步骤(2) 中获得的miRNAs纳米生物传感器避光孵化后洗脱，并将检测洗脱液的荧光信号谱，对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA，根据荧光信号谱中其用于标记所述miRNA的miRNA-量子点探针的特异发射光谱强度，按照强度越强表达量越高的原则，确定所述miRNA表达丰度。
优选地，所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，其步骤(1)具体为：
(1-1)对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA：将其互补的探针序列5’端采用氨基标记，获得氨基标记的探针；
(1-2)对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA：将步骤(1-1) 中获得的氨基标记的探针3’端采用量子点标记。
优选地，所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，其步骤(1-1)所述将其互补的探针序列5’端采用氨基标记，在氨基和碱基之间插入烷基链，所述烷基链可表示为-(CH2)2n-，其中1≤n≤12。
优选地，所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，其步骤(1-2)所述量子点为羧基水溶性量子点。
优选地，所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，其所述氨基标记的探针与所述量子点的质量比例为30～50:1。
优选地，所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，其步骤(3)所述miRNAs 纳米生物传感器浓度以其中氧化石墨烯浓度记在10μg/ml至14μg/ml。
优选地，所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，其步骤(3)所述将经扩增的待检测寡核苷酸混合物，其扩增方法为滚环扩增，具体方法如下：
将寡核苷酸混合物变性、退火后，加入连接缓冲液混合物、连接酶、锁式探针、以及待检测的miRNAs，恒温孵育，将所述miRNAs与滚环连接起来，再在扩增反应条件下进行滚环扩增。
按照本发明的另一个方面提供了一种应用于所述高通量miRNAs表达谱的检测方法的生物传感器，其特征在于，包括氧化石墨烯基质、以及具有特异发射光谱的量子点标记的miRNA-量子点探针，所述miRNA-量子点探针通过π-π堆积作用与所述氧化石墨烯基质吸附。
优选地，所述生物传感器，其所述量子点标记的miRNA-量子点探针，包括与其靶标miRNA互补的探针序列、以及羧基水溶性量子点，所述探针序列的3’端与羧基水溶性量子点共价结合。
优选地，所述生物传感器，其所述探针序列为5’端氨基标记核糖核苷酸序列，其氨基与核糖核苷酸5’端插入烷基链，所述烷基链可表示为- (CH2)2n-，其中1≤n≤12。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明通过选用两种纳米材料，一种是具有高量子产率和宽激发范围的量子点(QDs)，其作为miRNAs生物标志物DNA探针的荧光标签；另一种是基于荧光共振能量转移(FRET)显示出依赖于距离荧光猝灭的氧化石墨烯 (GO)，其作为构建生物传感器的荧光猝灭剂。并在引物生成-恒温滚环扩增 (PG-ERCA)的基础上改进，创造性发明了一种挂锁探针-恒温滚环扩增(P- ERCA)方法，增加了扩增方法的特异性。在设计锁式探针之后，在恒温条件下即可实现合理的miRNA作为模板和滚环特异性连接循环扩增，锁链探针的连接反应和靶标依赖性环化可以有效地提高miRNA测定的特异性，切口内切酶的剪切进一步提高了扩增的高效性。我们利用P-ERCA这种指数扩增模式将QDs和GO这两种纳米材料结合起来，构建了一种检测miRNAs的纳米生物传感器方法。其灵敏高，具有检测特异性，可同时检测多种miRNAs，解决了miRNA家族多，同源性高，难于区分的问题。此外，该方法中扩增反应和检测体系相互独立，有效避免了酶的污染，提高了扩增效率，保证了扩增反应的特异性，在临床检测中具有重要的潜在应用价值。
附图说明
图1是本发明的技术路线图。
图2是本发明实施例二P1/P2-GO复合物中，GO浓度对荧光强度的影响。
图3是本发明是实施例三的锁式探针滚环扩增条件优化结果图，其中图3A为dNTP浓度的优化结果，图3B是聚合酶浓度的优化结果，图3C是内切酶浓度的优化结果，图3D是滚换扩增时间的优化结果，图3E是滚换扩增温度的优化结果。
图4是不同靶标存在时，波长与荧光值的关系光谱图。
图5是不同浓度的miR-190和miR-422a与荧光值的关系光谱图。
图6是不用浓度的miR-190和miR-422a与荧光值的线性关系图，其中图6A为miR-190与荧光值的线性关系图，图6B为miR-422a与荧光值的线性关系图。
图7是本发明的P1/P2-GO复合物系统对miR-190的特异性检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的高通量miRNAs表达谱的检测方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)探针制备：对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA，将其互补的探针序列与具有特异发射光谱的量子点共价结合，获得具有特异发射光谱的miRNA-量子点探针；所述探针序列为锁式探针序列，其5’和3’末端被与靶标miRNA序列互补，可以与靶标miRNA特异性的连接。因此能够高特异性地区分各种碱基错配，并能准确检测系统相对应的靶标。
(1-1)对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA：将其互补的探针序列5’端采用氨基标记，获得氨基标记的探针；所述将其互补的探针序列 5’端采用氨基标记，在氨基和碱基之间插入烷基链，所述烷基链可表示为 -(CH2)2n-，其中1≤n≤12，使得杂交后的双链与氧化石墨烯之间有足够的距离，确保荧光的恢复。
(1-2)对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA：将步骤(1-1) 中获得的氨基标记的探针3’端采用量子点标记；步骤(1-2)所述量子点为羧基水溶性量子点。具体地，将所述所述氨基标记的探针与所述量子点，按照质量比例为30～50:1呼唤和，进行恒温反应，用超滤膜过滤，离心并用缓冲液洗涤和溶解最终产物，得到所述mi-RNA量子点探针。
(2)生物传感器制备：将步骤(1)中获得的所有具有特异发射光谱的 miRNA-量子点探针与氧化石墨烯室温孵化，使得所述miRNA-量子点探针吸附在所述纳米石墨烯表面，获得miRNAs纳米生物传感器；具体地，将具有特异发射光谱的miRNA-量子点探针与氧化石墨烯共同加入到缓冲溶液中，室温下孵化，形成稳定的探针-氧化石墨烯复合物。所述miRNA-量子点探针与氧化石墨烯通过π-π堆积作用吸附到氧化石墨烯表面，实现纳米生物传感器的组装。
(3)miRNA表达谱检测：将经扩增的待检测寡核苷酸混合物与步骤(2) 中获得的miRNAs纳米生物传感器避光孵化后洗脱，并将检测洗脱液的荧光信号谱，对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA，根据荧光信号谱中其用于标记所述miRNA的miRNA-量子点探针的特异发射光谱强度，按照强度越强表达量越高的原则，确定所述miRNA表达丰度。其中，所述miRNAs 纳米生物传感器浓度以其中氧化石墨烯浓度记在10μg/ml至14μg/ml。
所述将经扩增的待检测寡核苷酸混合物，其扩增方法为滚环扩增，具体方法如下：
将寡核苷酸混合物变性、退火后，加入连接缓冲液混合物、连接酶、锁式探针、以及待检测的miRNAs，恒温孵育，将所述miRNAs与滚环连接起来，再在扩增反应条件下进行滚环扩增。所述扩增反应条件为400～800μM dNTP， 0.4～0.5U Phi29DNA聚合酶，1U Nb.BbvCI，2h连接时间，5h扩增时间， 40℃的连接温度，30℃的扩增温度。所述连接缓冲液为40mMTris-HCl， 10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)，500mM ATP(pH＝7.8)。
当待检测的miRNAs中不存在靶标序列时，生物miRNA-量子点探针能够稳定的共存于氧化石墨烯基质上；当加入扩增产物靶标序列后，靶标序列作为引发剂即会引发杂交反应，形成双螺旋结构，有效地将miRNA-量子点探针从氧化石墨烯表面脱离，被氧化石墨烯淬灭的荧光得以恢复，实现荧光信号快速放大，通过检测荧光信号的强度的变化，即可定性或定量检测生物标志物miRNA表达谱。
本发明提供的应用于所述高通量miRNAs表达谱的检测方法的生物传感器，包括氧化石墨烯基质、以及具有特异发射光谱的量子点标记的miRNA- 量子点探针，所述miRNA-量子点探针通过π-π堆积作用与所述氧化石墨烯基质吸附。
所述量子点标记的miRNA-量子点探针，包括与其靶标miRNA互补的探针序列、以及羧基水溶性量子点，所述探针序列的3’端与羧基水溶性量子点共价结合。所述探针序列为5’端氨基标记核糖核苷酸序列，其氨基与核糖核苷酸5’端插入烷基链，所述烷基链可表示为-(CH2)2n-，其中1≤n≤12。
以下为实施例：
下面以测miR-190和miR-422a表达谱检测为例，具体说明本发明提供的高通量miRNAs表达谱的检测方法：
实施例一、探针制备
将miR-190和miR-422a的DNA探针5’端采用氨基标记，在氨基和碱基之间加入6个CH2，5’端分别采用羧基水溶性量子点QDs-3625和QDs- 3565标记，即将氨基标记的探针分别与QDs-3565和QDs-3625(1μM)以摩尔比为30：1的比例混合，在恒温37℃下温育30分钟。用Nanosep 100K OMEGA管状超滤膜(Pall，USA)过滤，以除去过量的探针。在5000rpm/min 条件下离心，并用PBS(1×)洗涤2次，并重新溶解最终产物，最后在4℃条件下储存。QDs探针的终浓度为10nM。所得荧光标记的探针如表1。
表1 miR-190和miR-422a荧光标记的探针
实施例二、P1/P2-GO复合生物传感器的构建及GO浓度的优化
将荧光标记的发夹探针Probe 1和Probe 2(P1/P2)与氧化石墨烯 (grapheneoxide,GO)同加入到1×PBS缓冲溶液中，在室温下孵化0.5h，形成稳定的P1/P2-GO复合物。在该体系中，这两种DNA探针在没有靶标DNA 的溶液中能够稳定地共存，但是在加入扩增产物靶标DNA(DNA1和DNA2) 后，靶标DNA作为引发剂，会引发杂交反应，形成双螺旋DNA结构。本实施例中研究了不同GO的浓度(2、4、8、10、12和14μg/ml)对荧光值影响。将探针荧光值定义为F，加入GO后探针的荧光值定义为F0，F-F0值达到最大时，此时GO浓度达到最优。如图2所示，在靶标存在的情况下的荧光值是F1，当GO浓度为12μg/ml时，荧光值F1/F0达到最大；当GO浓度为14μg/ml时，荧光值F1/F0开始下降。这说明GO浓度达到一定值后，会对双链进行部分吸附，导致荧光值降低。因而，在P1/P2-GO复合物传感荧光信号检测过程中，GO的最佳浓度是12μg/mL。
实施例三、挂锁探针滚环扩增反应
(1)连接反应。寡核苷酸混合物在65℃条件下变性3分钟，并缓慢冷却至室温。退火后，将2U T4RNA连接酶2、2μL锁式探针、2μL的miRNA 和连接缓冲液[40mM Tris-HCl，10mMMgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)， 500mM ATP(pH＝7.8)]加入到反应混合物中，反应物总体积为10μL，在37℃孵育2小时。其中，miR-190和miR-422a的锁式探针由其杂交序列和切口内切酶的切口位点组成。锁式探针的5′-和3′-末端被设计为与靶标miR-190 或miR-422a互补。锁式环状探针设计如表2。
(2)滚环扩增条件的优化。滚环扩增反应产物包括：连接反应产物、缓冲液、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、dNTP、Triton X-100、Phi29DNA聚合酶和Nb.BbvCI。本实施例中研究了dNTP浓度(100、200、400、600和800 μM)、Phi29DNA聚合酶浓度(0.05、0.10、0.20、0.40和0.50U)、Nb.BbvCI 切口酶的用量(0.1、0.2、0.5、1.0和2.0U)、连接和扩增时间(1.5、2、3h；4、 5、6h)、连接温度(30、37和40℃)扩增温度(30和37℃)对荧光强度的变化影响。滚环扩增条件优化结果见图3。如图3A所示，在所选dNTP浓度范围内，随着其浓度的升高，荧光强度逐渐增加，并在400～800μM浓度范围内趋于稳定。如图3B所示，在所选Phi29DNA聚合酶浓度范围内，随着其浓度的升高，荧光强度逐渐增加，在0.4U时达到最高，并在0.4～0.5U 浓度范围内趋于稳定。如图3C所示，在所选的Nb.BbvCI切口酶的剂量范围内，荧光信号都趋于稳定，变化甚微。此外，还研究了连接和扩增时间对荧光强度的变化影响(图3D)，选择2和5h作为miRNA检测的最佳连接时间和扩增时间。对连接温度和扩增温度也进行了优化，如图3E所示，选择40℃作为最佳连接温度，30℃作为最佳扩增温度。因此，综合考虑，为了获得最佳检测灵敏度，滚环扩增优化条件如下：400～800μM dNTP，0.4～0.5 U Phi29DNA聚合酶，1UNb.BbvCI，2h连接时间，5h扩增时间，40℃的连接温度，30℃的扩增温度。
(3)滚环扩增反应。将10μL的连接反应产物，20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.8)，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，6mM MgSO4，400μM dNTP， 0.1％Triton X-100，0.4U Phi29DNA聚合酶，和1U Nb.BbvCI混合，反应混合物的总体积为20μL，在30℃条件下进行滚环扩增反应。扩增miR-190 和miR-422a分别得到其对应的扩增产物，单链DNA1和DNA2。
在本实施例中，锁式探针的5′-和3′-末端被设计为与miRNA靶标互补，并可以与靶标特异性的连接，在T4 RNA连接物2存在的情况下以miR-190 或miR-422a作为模板环化。一旦靶标miRNA和锁式探针形成复合物， Phi29DNA聚合酶通过线性滚动合成长锁链探针的连续序列拷贝圈放大。此后，多个锁式探针可以与线性滚环扩增DNA产物的多个位点杂交，并且切口内切核酸酶识别该位点并切割双链形成的序列，产生多个短DNA产物作为新的触发剂以启动多个反应循环，直到某些反应(如dNTP)组分耗尽。因此，线性滚环扩增和切割可以循环连续进行，将常规线性滚环扩增转换为指数扩增，从而可实现对miRNA的高灵敏度测定。
表2 miR-190和miR-422a的锁式滚环探针
实施例四、靶标miRNA对荧光值的影响
选取四只离心管，分别标记为A、B、C、D。这三支离心管中均含有P1/P2- GO复合物的1×PBS缓冲溶液体系。向A管中加入含有靶标miR-190和miR- 422a的滚环扩增产物DNA1和DNA2；B管中只加入扩增产物DNA1；C管中只加入扩增产物DNA2；D管作为对照管，加入不含任何一种靶标的扩增产物。在37℃条件下避光孵化30min，反应完成后离心，取100μL上清，加入900uL 1×PBS，检测产物的荧光信号强度。结果如图4所示。ABCD四条曲线分别对应A、B、C、D管所测得的结果。可以发现，当探针不存在对应的靶标时，探针的荧光值被GO淬灭；当存在对应的靶标时，探针与靶标杂交，荧光值恢复，在发射波长处出现峰值。
实施例五、靶标miRNA的灵敏度检测
将前述实施例中优化后的分析方案应用于靶标灵敏度检测中。在所得优化条件下，分别对不同浓度的靶标miR-190和miR-422a(1am、10am、 1fm、10fm、1nm、10nm)进行滚环扩增，再在含有P1/P2-GO复合物的 1×PBS缓冲溶液体系中，分别检测不同浓度靶标浓度下所得扩增产物的荧光信号强度。每组数据重复三次，取平均值,并计算出标准误差。如图4所示，随着靶标浓度从0不断增加到10nm，检测系统的荧光信号强度也随之升高，这表明荧光信号强度与靶标的浓度之间具有很大的关联性。通过绘制浓度与荧光强度的线性关系图，在三个数量级之间获得相关系数为的良好线性关系曲线。miR-190浓度与荧光值的线性关系相关方程为F- F0＝14.2+0.09X，R2为0.998，表明在3am～2.5fm浓度范围内具有良好的线性关系。miR-422a浓度与荧光值的线性关系相关方程为F- F0＝37.5160+0.089X，R2为0.997，说明此方法在3am～2.5fm范围内具有良好的线性。其中，F和F0代表GO加入之前和加入之后扩增产物的荧光强度。此外，11次对10am的miRNA重复测量获得的相对标准偏差为4.5％, 说明此检测系统重复性良好。检测限为1am。因此，本发明方法的检测上限为1am。与Lu Z等人报道的无扩增反应方法的检测限50nm(Nanoscale, 2012；4(19):5840-5842)相比，其检测限的检测灵敏度要高出三个数量级。
实施例六、纳米生物传感器的特异性检测
本发明中的扩增方法能区分仅有一个核普酸序列的差异。本实施例选用相同浓度的miR-190和miR-190-1来探究该纳米生物传感器的检测特异性。在前述实施例的优化条件下，使用与miR-190进行完美互补的锁式探针，同时使用与miR-190有一个碱基差别的miR-190-1，分别进行滚环扩增反应，再在含有P1/P2-GO复合物的1×PBS缓冲溶液体系中，分别对扩增产物的荧光信号强度进行检测。每组数据重复三次，取平均值,并计算出标准误差。如图6所示，纳米生物传感器检测miR-190a的荧光强度是miR-190- 1荧光强度的9倍。这说明将挂锁探针滚环扩增方法和传感平台结合起来所得的纳米生物传感器，能够高特异性地区分各种碱基错配，并能准确检测系统相对应的靶标。这为此纳米生物传感器成功应用于临床诊断不同序列提供了依据。
本发明所构建的一种检测miRNAs的纳米生物传感器方法，其灵敏高，具有检测特异性，可同时检测多种miRNAs，解决了miRNA家族多，同源性高，难于区分的问题。此外，该方法中扩增反应和检测体系相互独立，有效避免了酶的污染，提高了扩增效率，保证了扩增反应的特异性，在临床检测中具有重要的潜在应用价值。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)探针制备：对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA，将其互补的探针序列与具有特异发射光谱的量子点共价结合，获得具有特异发射光谱的miRNA-量子点探针；
(2)生物传感器制备：将步骤(1)中获得的所有具有特异发射光谱的miRNA-量子点探针与氧化石墨烯室温孵化，使得所述miRNA-量子点探针吸附在所述纳米石墨烯表面，获得miRNAs纳米生物传感器；
(3)miRNA表达谱检测：将经扩增的待检测寡核苷酸混合物与步骤(2)中获得的miRNAs纳米生物传感器避光孵化后洗脱，并将检测洗脱液的荧光信号谱，对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA，根据荧光信号谱中其用于标记所述miRNA的miRNA-量子点探针的特异发射光谱强度，按照强度越强表达量越高的原则，确定所述miRNA表达丰度。
2.如权利要求1所述的高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，步骤(1)具体为：
(1-1)对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA：将其互补的探针序列5’端采用氨基标记，获得氨基标记的探针；
(1-2)对于待检测的miRNAs表达谱中的每一miRNA：将步骤(1-1)中获得的氨基标记的探针3’端采用量子点标记。
3.如权利要求2所述的高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，步骤(1-1)所述将其互补的探针序列5’端采用氨基标记，在氨基和碱基之间插入烷基链，所述烷基链可表示为-(CH2)2n-，其中1≤n≤12。
4.如权利要求2所述的高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，步骤(1-2)所述量子点为羧基水溶性量子点。
5.如权利要求2所述的高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，所述氨基标记的探针与所述量子点的质量比例为30～50:1。
6.如权利要求1所述的高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述miRNAs纳米生物传感器浓度以其中氧化石墨烯浓度记在10μg/ml至14μg/ml。
7.如权利要求1所述的高通量miRNAs表达谱的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述将经扩增的待检测寡核苷酸混合物，其扩增方法为滚环扩增，具体方法如下：
将寡核苷酸混合物变性、退火后，加入连接缓冲液混合物、连接酶、锁式探针、以及待检测的miRNAs，恒温孵育，将所述miRNAs与滚环连接起来，再在扩增反应条件下进行滚环扩增。
8.一种应用于如权利要求1至7任意一项所述高通量miRNAs表达谱的检测方法的生物传感器，其特征在于，包括氧化石墨烯基质、以及具有特异发射光谱的量子点标记的miRNA-量子点探针，所述miRNA-量子点探针通过π-π堆积作用与所述氧化石墨烯基质吸附。
9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述量子点标记的miRNA-量子点探针，包括与其靶标miRNA互补的探针序列、以及羧基水溶性量子点，所述探针序列的3’端与羧基水溶性量子点共价结合。
10.如权利要求9所述的生物传感器，其特征在于，所述探针序列为5’端氨基标记核糖核苷酸序列，其氨基与核糖核苷酸5’端插入烷基链，所述烷基链可表示为-(CH2)2n-，其中1≤n≤12。
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