CN108893416A - 一种降解呕吐毒素的酵母菌及其应用 - Google Patents

一种降解呕吐毒素的酵母菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种降解呕吐毒素的酵母菌及其应用，解决了现有技术中动物饲料中含有呕吐毒素引起中毒带来巨大经济损失的技术问题。本申请的酿酒酵母降解呕吐毒素在生产中的应用有两个方面：首先，作为饲料添加剂添加到动物全价料中；其次，固态发酵饲料原料和动物全价料。可显著地降解饲料或全价料中的呕吐毒素，消除呕吐毒素对畜禽与水产的危害，提高畜禽与水产的生产性能、饲料转化率及免疫力，维护机体健康。

Description

一种降解呕吐毒素的酵母菌及其应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别是指一种降解呕吐毒素的酵母菌及其应用。
背景技术
呕吐毒素（vomotoxin），又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是世界范围内谷物和食物中最常见的霉菌毒素之一。人与畜摄入含DON的食物后引起下列一系列的中毒症状：（1）细胞毒性：改变细胞形态，促进炎性因子的升高，促进细胞凋亡，抑制蛋白的合成等；（2）肠道毒性：诱导肠道组织的组织损伤、降低营养物质的吸收和消化功能障碍、影响肠道细胞的渗透性、降低肠道免疫力、改变肠道微生物区系等；（3）免疫毒性：通过作用核糖体，诱导核糖体毒性应激反应，引发炎症相关基因表达为促炎细胞因子，有明显胚胎毒性和一定致畸作用；（4）急性和慢性毒性：猪对DON最敏感，猪进食含DON的饲料后，急性中毒表现为呕吐、腹泻、血便、皮肤黏膜红肿和坏死、体温下降，慢性中毒表现食欲减退和增重减慢，降低生产性能，拒食，呈现“僵猪”现象。
呕吐毒素的脱毒方法有物理（吸附剂吸附、γ-射线照射等）、化学（强酸、强碱和强氧化剂等）和生物学方法（微生物发酵和酶解等）。物理和化学方法存在操作困难、效果差、造成营养物质损失和环境污染等问题。大量的研究证实，依靠微生物发酵和酶解的呕吐毒素生物脱毒法是最有效的方法。
发明内容
本发明提出一种降解呕吐毒素的酵母菌及其应用，解决了现有技术中呕吐毒素脱毒难的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种降解呕吐毒素的酵母菌，所述酵母菌为酿酒酵母，保藏号为CGMCC No:2.3866。
所述酿酒酵母的培养方法为，将酿酒酵母按1-5%的接种量，接入新鲜的YPD培养基中，于25-32℃、150-200 r/min培养24-48 h。
述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，在畜禽或水产生物每吨的全价料中加入300-3000 g酿酒酵母。
所述酿酒酵母的活力大于1×108 cfu/g。
所述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，以饲料原料或动物全价料为基准，加入35-40%质量的水，再加入一定质量的酿酒酵母，搅拌均匀后于25-32℃下发酵2-4天，得降解呕吐毒素的酵母菌的饲料或全价料。
所述酿酒酵母的接种量为饲料原料或动物全价料质量的1-5%。
所述酿酒酵母的活力大于1×108 cfu/g。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过对本实验室保存购买的菌种进行DON降解的筛选，最终发现酿酒酵母能够降解DON，并且在48 h的降解率为73.12%。
2、本申请的酿酒酵母降解呕吐毒素在生产中的应用有两个方面：首先，作为饲料添加剂添加到动物全价料中；其次，固态发酵饲料原料和动物全价料。可显著地降解饲料或全价料中的呕吐毒素，消除呕吐毒素对畜禽与水产的危害，提高畜禽与水产的生产性能、饲料转化率及免疫力，维护机体健康。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明中降解呕吐毒素的菌株的筛选：
1 材料与方法
1.1 试剂
胰蛋白胨、酵母浸粉、蛋白胨（生物试剂），葡萄糖，氯化钾，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，乙酸钠，柠檬酸铵，吐温80，硫酸镁，硫酸锰等，以上均为国产分析纯。
1.2 DON标准品的配制
DON纯品：购买自Sigma公司，用乙醇将DON纯品稀释，配制成1 mg·mL-1的母液，取1 mL母液配置成100 μg·mL-1的工作液，过0.22 μm滤膜，4℃保存备用。
1.3 培养基及试剂的配制
（1）MRS培养基（乳酸杆菌、粪肠球菌和丁酸梭菌的培养）：胰蛋白胨1.5 g、酵母浸粉0.1g、葡萄糖2.0 g、柠檬酸铵0.2 g、吐温-80 0.1 mL、硫酸锰0.005 g、磷酸氢二钾0.2 g、乙酸钠0.5 g、硫酸镁0.02 g，固体培养基加入1.5%的琼脂，用蒸馏水定容至100 mL，在121℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用。
（2）LB液体培养基（枯草芽孢杆菌的培养）：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10g 用蒸馏水定容至1L，调节pH至 7.0，121℃，高压20 min，备用。在LB液体培养基加入1.5-2.0% 琼脂制备LB固体培养基。
（3）YPD培养基（酵母菌的培养）：蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，无水葡萄糖20 g 用蒸馏水定容至1000 mL， 121℃，高压20min，备用。
1.4 实验室保存的菌种对DON降解的测定
1.4.1 菌种的活化与培养
实验室保存的枯草芽孢杆菌（7株，分别标号K1-K7）、酵母菌（3株，分别为产朊假丝酵母、布拉迪酵母、酿酒酵母）分别在LB、YPD液体培养基中活化，枯草芽孢杆菌在37℃、180 r/min培养，酵母菌在30℃、180 r/min培养，24 h后分别按2%的接种量接入新鲜培养基，在各自培养条件下培养24 h，连续培养两代。干酪乳杆菌、植物乳杆菌、青贮乳杆菌、乳酸乳杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌采用MRS培养基，在37℃下静置培养24 h。
1.4.2 枯草芽孢杆菌对DON的降解
将培养24 h的7株枯草芽孢杆菌分别按2%的接种量接入新鲜LB培养基中，加入DON，使其终浓度为1 μg·mL-1，反应总体积为5 mL，对照组用等体积的LB培养基代替菌液，37℃、180 r/min培养24 h后，8000 r/min离心3 min，取上清待测DON的浓度。
1.4.3 酵母菌对DON的降解
将培养24 h的酵母菌分别按2%的接种量接入新鲜YPD培养基中，加入DON，使其终浓度为1 μg·mL-1，反应总体积为5 mL，对照组用等体积的YPD培养基代替菌液，37℃、180 r/min培养24 h后，8000 r/min离心3 min，取上清待测DON的浓度。
1.4.4 乳酸杆菌等微生物对DON的降解
将培养24 h的乳酸杆菌等微生物分别按2%的接种量接入新鲜MRS培养基中，加入DON，使其终浓度为1 μg·mL-1，反应总体积为5 mL，对照组用等体积的MRS培养基代替菌液，37℃下静置培养24 h后，8000 r/min离心3 min，取上清待测DON的浓度。
1.5 数据分析
试验结果用SPSS20进行统计分析，结果用平均值±标准差表示，用Turkey法对数据进行差异性分析，P<0.05表示差异显著。
2 结果分析
本实验室保存的细菌和酵母菌分别与DON共培养24 h后测其降解率，结果如表1。
由表可知，实验室保存的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌在一定程度上均对DON有降解，但降解率都较低，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，CGMCC2.3866）最高，为73.12%。
表1 实验室保存菌种对DON 的降解率（%）（n=3）
注：两列同时比较，小写英文字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)。
呕吐毒素降解菌的应用：
酿酒酵母降解呕吐毒素在生产中的应用主要由两个方面：
1、作为畜禽与水产养殖的饲料添加剂：在畜禽与水产全价料中酿酒酵母（大于1×108cfu/g）的添加量为300-3000 g/吨，可显著地降解呕吐毒素，消除呕吐毒素对畜禽与水产的危害，提高畜禽与水产的生产性能、饲料转化率及免疫力，维护机体健康。
2、通过微生物发酵降解饲料中的呕吐毒素：按饲料原料或动物全价料35-40%的重量，称取一定量的水；按干物质1-5%的接种量称取酿酒酵母（大于1×108 cfu/g），加入到水中混匀，与饲料原料或动物全价料进行混合，在25-32℃下进行需氧发酵2-4天，可显著地降解饲料原料或动物全价料中的呕吐毒素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种降解呕吐毒素的酵母菌，其特征在于：所述酵母菌为酿酒酵母，保藏号为CGMCCNo:2.3866。
2.如权利要求1所述的降解呕吐毒素的酵母菌，其特征在于：所述酿酒酵母的培养方法为，将酿酒酵母按1-5%的接种量，接入新鲜的YPD培养基中，于25-32℃、150-200 r/min培养24-48 h。
3.如权利要求1或2所述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，其特征在于：在畜禽或水产生物每吨的全价料中加入300-3000 g酿酒酵母。
4.如权利要求3所述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，其特征在于：所述酿酒酵母的活力大于1×108 cfu/g。
5.如权利要求1或2所述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，其特征在于：以饲料原料或动物全价料为基准，加入35-40%质量的水，再加入一定质量的酿酒酵母，搅拌均匀后于25-32℃下发酵2-4天，得降解呕吐毒素的酵母菌的饲料或全价料。
6.如权利要求5所述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，其特征在于：所述酿酒酵母的接种量为饲料原料或动物全价料质量的1-5%。
7.如权利要求5所述的降解呕吐毒素的酵母菌的应用，其特征在于：所述酿酒酵母的活力大于1×108 cfu/g。
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