CN108782094A

CN108782094A - 接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的应用方法

Info

Publication number: CN108782094A
Application number: CN201810674935.6A
Authority: CN
Inventors: 罗明; 骆建敏; 韩剑; 李卫军; 郭海玉; 皇甫彩娟; 热比古丽
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明涉及一种接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的方法，属于农业微生物应用领域。该应用方法包括：将苜蓿种子在根瘤菌菌液中浸泡30min后，阴干后播种。播种后随头水滴施根瘤菌液1次。第1茬苜蓿刈割后随第二茬苜蓿返青水滴施根瘤菌液1次，同时施少量氮肥1次。第二茬苜蓿收获随第三茬苜蓿返青水滴施根瘤菌1次，同时施少量氮肥1次。本发明利用地下滴灌的地下毛管在灌水的同时将根瘤菌液滴施到苜蓿植株根区土壤中，实现菌剂的可控、均匀和靶向施入，与常规的拌种接种方法相比，能显著增加不同种植年限、不同茬次的根瘤菌在苜蓿根际定殖密度、结瘤数和占瘤率，提升固氮率和固氮量，降低氮肥使用量，提高苜蓿的产量和改善品质，为干旱区苜蓿生产的高产、优质和高效提供了新的途径。

Description

接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的应用方法

技术领域

本发明属于农业微生物应用领域，涉及接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿提高产量和改善品质的方法。

背景技术

苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上种植面积最大的高蛋白豆科饲草作物。根瘤菌—苜蓿形成的高效共生体系能固定90～386kg/hm²的纯氮，可提供其生长期所需46%～92％的氮素。利用优良的根瘤菌接种，可以促进苜蓿早结瘤、多结瘤，增加固氮量，大幅减少化肥投入，降低生产成本，对苜蓿生产的提质增效具有显著作用。

苜蓿是一种高耗水作物，整个生育期的耗水最大可达2250 mm，严重制约了其在水资源短缺的西北干旱和半干旱地区的生产规模与效益。长期以来，苜蓿生产一直沿用漫灌方式，单次灌水量大，不仅水分利用率低、水资源的浪费，还造成根系相对集中，根冠比小，会直接影响根瘤菌的侵染、结瘤和固氮。地下滴灌是用管道系统输水、通过埋在地下的毛管上的灌水器将灌溉用水（肥）释放到作物根区土壤中，供作物吸收利用的一种灌水方法。近年来地下滴灌开始在苜蓿生产中试验应用。研究证明，苜蓿地下滴灌较地面灌溉节水增产效果显著，同时具有减少地表无效蒸发、改善作物根区土壤条件、方便田间管理作业、防止毛管老化等优点。

目前接种根瘤菌的应用均为在常规漫灌灌溉模式下。生产中根瘤菌接种方法有拌种、沟施、撒施及与土壤混施等方法，最常用的是拌种法。拌种法接种根瘤菌，由于根系生长快于根瘤菌的迁移速度，根瘤菌与根的接触时间短，侵染占瘤率较低，接种效果不理想。通过拌种法接种根瘤菌，刈割1次后苜蓿上的根瘤数会迅速减少；种植1～2年后苜蓿上根瘤数急剧下降，高龄苜蓿因根瘤减少，降低了固氮效能，由此带来的氮素供应缺乏问题直接影响苜蓿的产量和品质。有试验表明沟施比拌种有更明显的接种效果。研究中发现，根瘤菌在不同种植年限、不同茬次的苜蓿根部的结瘤率、根瘤的分布和数量、有效根瘤等都有显著差异。因此，需针对不同区域、土壤和气候环境特点，建立相适宜的根瘤菌接种技术才能充分发挥根瘤菌的固氮功能。

地下滴灌改变了土壤水分运动规律和苜蓿根系分布的特点，必然会对根瘤菌的定殖、侵染和结瘤固氮产生影响。地下滴灌条件下根瘤菌接种技术研究未见报道。

在地下滴灌这种新的生产模式下，筛选相匹配的优良菌株，建立适宜的接种方法，促进接种根瘤菌在土壤大量繁殖存活、稳定定殖，充分发挥根瘤菌的固氮效能，增加苜蓿的氮素营养，提高产量和品质，对于建立苜蓿高产、优质、高效的生产体系具有重要作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的应用方法。该方法接种根瘤菌能在苜蓿根际大量存活、稳定定殖，竞争结瘤率高，增加结瘤数，提高第1、2、3茬苜蓿的固氮率和固氮量，降低氮肥使用量，显著提高苜蓿的产草量和改善品质，适合大规模应用。

本发明为实现上述目，通过以下技术方案实现。

1. 将苜蓿根瘤菌转接到平板培养基上，活化后，挑取单菌落接种至YMA液体培养基中培养至有效活菌数不低于1×10¹⁰CFU /mL。

2. 将苜蓿种子在菌液中(1000mL菌液/Kg种子) 浸泡30min后，阴干后播种。

3. 播种后随头水滴施根瘤菌液1次（接种量45 L菌液·hm^-2）。

4. 第1茬苜蓿刈割后随第2茬苜蓿返青水滴施根瘤菌1次（接种量45 L菌液·hm^-2），同时施少量氮肥（尿素20 kg·hm^-2）。

5.第2茬苜蓿收获随第3茬苜蓿返青水滴施根瘤菌1次（接种量45 L菌液·hm^-2），同时施少量氮肥（尿素20 kg·hm^-2）。

6. 所述的根瘤菌为专利文件CN106987541A记载的具有抗逆、促生性能的高效苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026菌株。

7. 所述的根瘤菌液滴施方法，采用地下滴灌带对苜蓿灌溉时（浇水时间10-18h），在停水前1-2 h时，用施肥泵将根瘤菌液打入到地下滴灌带的支管中，根瘤菌液即随着毛管中的灌溉水均匀扩散到苜蓿根部土壤中。

8. 本发明中所述的方法应用于新疆多年生紫花苜蓿的生产。

9. 本发明中所述的方法应用于地下滴灌苜蓿栽培模式。

本发明提供的方法具有以下有益效果：本发明利用地下滴灌的地下毛管在灌水的同时将根瘤菌液滴施到苜蓿植株根区土壤中，实现菌剂的可控、均匀和靶向施入，与拌种等常规的接种方法相比，能显著增加不同种植年限、不同茬次的根瘤菌在苜蓿根际定殖密度、结瘤数和占瘤率，提升固氮率和固氮量，提高苜蓿的产量和改善品质，为干旱区苜蓿产业的高产、优质和高效提供了新的途径。

附图说明

图1所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026 -GFP 标记菌株在荧光显微镜下的菌落特征。

图2所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026-GFP 标记菌株在荧光显微镜下的菌体形态图。

图3所示为小区试验根瘤菌不同接种处理在苜蓿根际的定殖动态图。

图4为小区试验根瘤菌不同接种处理对苜蓿结瘤率的影响。

图5为小区试验地根瘤菌不同接种处理对小区试验地占瘤率的影响。

图6为小区试验地根瘤菌不同接种处理对小区试验地苜蓿鲜草产量的影响。

图7为根瘤菌不同接种处理对小区试验地苜蓿干草产量的影响。

图8 为根瘤菌不同接种处理对小区试验地苜蓿草粗蛋白含量的影响。

图9 为根瘤菌不同接种处理对小区试验地苜蓿草中性洗涤纤维（NDF）含量的影响。

图10 为根瘤菌不同接种处理对小区试验地苜蓿草酸性洗涤纤维（ADF）含量的影响。

图11 为大田试验地接种根瘤菌在苜蓿根际土壤的定殖率。

图12 为大田试验地接种根瘤菌的占瘤率。

图13 为大田试验地根瘤菌不同接种处理苜蓿的结瘤数。

图14 为大田试验地根瘤菌不同接种处理苜蓿的干草产量。

图15 为大田试验地根瘤菌不同接种处理苜蓿的粗蛋白含量。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1根瘤菌接种方法在苜蓿地下滴灌小区试验中的应用

1. 材料和方法

（1）根瘤菌菌株：苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026-GFP菌株。是对XGL026 菌株进行GFP （Green Fluorescent Protein）基因标记，构建出的遗传性能稳定、在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光（见图1，图2）、兼具四环素抗性，对苜蓿的共生结瘤、生长性状无明显影响的标记功能菌株。

（2）供试苜蓿品种：‘新牧1号’紫花苜蓿。

（3）菌液培养：将根瘤菌XGL026菌株活化，接种至YMA液体培养基中，摇瓶培养至菌液OD_600nm值为0.8～1.0，测定活菌浓度为2.4×10¹⁰CFU·mL^-1。

（4）试验处理：在地下滴灌打草苜蓿地设小区试验，地下滴灌采用主管+支管+毛管系统。根瘤菌接种共7个处理（表1），采用完全随机区组设计，每处理3次重复，共21个小区。小区面积25.9 m²。

表1 试验处理

（5）根瘤菌的接种方式：

① 拌种（B）：播种前将苜蓿种子在菌液中(1000mL/Kg) 浸泡30min后，阴干后播种。

② 滴施根瘤菌（D）：苜蓿播种后，第一次灌溉时（浇水时间10-18h），在停水前1-2h时，用施肥泵将根瘤菌液（接种量45 L菌液·hm^-2）打入到地下滴灌带的支管中，根瘤菌液即随着毛管中的灌溉水均匀扩散到苜蓿根部土壤中。

③ 拌种结合滴施1次根瘤菌（B+D1）：播种前用根瘤菌拌种，第1茬苜蓿刈割后，在第二茬苜蓿浇返青水时将根瘤菌液(接种量45L菌液·hm^-2) 打入到地下滴灌带的支管中随毛管水滴施到苜蓿根部土壤中。

④ 拌种结合滴施1次根瘤菌同时施氮肥1次（B+D1+N1）：同③，并在滴施菌液后，再将氮肥（尿素20 kg·hm^-2））溶解后加入地下滴灌带的支管中随毛管水滴施。

⑤ 拌种结合滴施2次根瘤菌（B+D2）：播种前用根瘤菌拌种，分别在第1茬、第2茬苜蓿刈割后，第2茬、第3茬苜蓿浇返青水时将根瘤菌液（接种量45 L菌液·hm^-2）打入到地下滴灌带的支管中随毛管水滴施到苜蓿根部土壤中。

⑥ 拌种结合滴施2次根瘤菌同时施氮肥2次（B+D2+N2）：同⑤，并在滴施菌液后，再将氮肥（尿素20 kg·hm^-2）溶解后加入地下滴灌带的支管中随毛管水滴施。

⑦ 对照（CK）：不接菌，不施氮肥。

2. 接种处理对根瘤菌在苜蓿根际土壤定殖的影响

结果表明（见图3），播前拌种根瘤菌（B），在第1茬苜蓿苗期根际定殖密度最大，至第2茬苜蓿定殖密度下降，第3茬苜蓿仅有少量存留。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌（D），拌种结合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌（B+D1），拌种结合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌（B+D2）和拌种结合滴施同时增施少量氮肥（B+D1+N1，B+D2+N2）处理，根瘤菌的定殖数量显著高于B处理，在第2、3茬定殖数量持续升高，保持较高的定殖量。

3. 根瘤菌接种处理对结瘤数、占瘤率的影响

结果表明（见图4、图5），B处理在第1茬苜蓿上的结瘤量最多，第2、3茬苜蓿上的结瘤数减少。而B+D1+N1处理第2、3茬苜蓿的结瘤数、占瘤率都明显高于拌种（B）、滴施（D）和拌种结合滴施（B+D1、B+D2）处理。B+D2+N2第3茬苜蓿的结瘤数、接种菌占瘤率均达到最高，明显优于其他处理。

4. 根瘤菌不同接种处理对苜蓿固氮效率的影响

结果表明（见表2），播前拌种（B）处理对第1茬苜蓿的固氮效应最突出，之后明显下降。第2茬苜蓿上， B+D1+N1处理根瘤菌的固氮率和固氮量增幅最为显著。在第3茬苜蓿上，B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2处理都有较高的固氮率，其中B+D2+N2处理的固氮量增加最大。

表2 根瘤菌不同接种处理苜蓿的生物固氮率和固氮量

5. 根瘤菌不同接种处理对苜蓿草产量的影响

接种根瘤菌能增加紫花苜蓿鲜草（见图6）、干草产量（见图7），鲜草增产幅度可达9.50%～121.71%，干草增产幅度则为31.81%～124.66%。拌种（B）能显著提高苜蓿干鲜比（4.03%～20.35%）。B+D1、B+D2和B+D1+N、B+D2+N对第2茬、第3茬苜蓿均能显著增加茎叶比（P<0.05），其中B+D1+N，B+D2+N的增幅最为突出。

6. 根瘤菌不同接种处理对苜蓿草品质的影响

结果表明，对地下滴灌苜蓿接种根瘤菌能明显提高苜蓿粗蛋白含量和叶茎比（见图8），降低中性洗涤纤维（NDF）(见图9)和酸性洗涤纤维（ADF）(见图10)，显著提升苜蓿品质。第1、第2、第3茬苜蓿，接种处理苜蓿粗蛋白含量平均分别较对照增加0.4%、5.14%和3.27%，叶茎比增加7.78、5.14和3.27。NDF和ADF分别减少5.71%和2.82%、2.34%和1.70%、5.71%和4.75%。B+D1+N和B+D2+N对第2、3茬的苜蓿粗蛋白含量和叶茎比提高、降低NDF和ADF效果最佳。

实例2根瘤菌接种方法在地下滴灌大田苜蓿中的应用

1. 材料和方法

（1）根瘤菌菌株：苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026-GFP菌株。是对XGL026 菌株进行GFP （Green Fluorescent Protein）基因标记，构建出的遗传性能稳定、在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光、兼具四环素抗性，对苜蓿的共生结瘤、生长性状无明显影响的标记功能菌株。

（2）苜蓿品种：‘新牧1号’紫花苜蓿，‘金皇后’紫花苜蓿。

（3）试验处理：在地下滴灌大田苜蓿打草地进行，3年生苜蓿（品种为金皇后，面积为7.8亩），4年生苜蓿（品种为新牧1号，面积为4.5亩）。设5个处理：①3(XGL026+N+P）：3年生苜蓿第1、2、3茬苜蓿各滴施1次根瘤菌液，同时施少量尿素（20kg/hm²）和磷酸一铵（30kg/hm²）1次；② 4（XGL026+N+P）：4年生苜蓿第1、2、3茬草各滴施1次根瘤菌液，同时施少量尿素（20kg/hm²）、磷酸一铵（30kg/hm²）1次；③4（XGL026+P3）：4年生苜蓿第1、2、3茬草各在头水滴施1次根瘤菌液，同时施磷酸一铵（30kg/hm²）1次；④对照组(CK)，不接菌、1-3茬均在头水施磷酸一铵（30kg/hm²）1次；⑤（N+P+K）：大田常规施肥、管理。不接菌，1、2、3茬苜蓿各浇水3次，每次浇水均施肥。第1、2茬苜蓿施肥（尿素30kg/hm²+磷酸一铵30kg/hm²），第3茬苜蓿施肥（尿素45kg/hm²+磷酸一铵15kg/hm²+硫酸钾45kg/hm²）。

（4）根瘤菌接种方法：将根瘤菌XGL026菌株活化，接种至YMA液体培养基中，摇瓶培养至菌液OD_600nm值为0.8～1.0，测定活菌浓度为3.5×10¹⁰CFU·mL^-1。在1、2、3茬苜蓿浇头水时，在停止浇水前1-2 h时，用施肥泵将根瘤菌液(接种量45L菌液·hm^-2)打入到地下滴灌带的支管中，根瘤菌液即随着毛管中的灌溉水均匀扩散到苜蓿根部土壤中。

2. 接种根瘤菌在大田地下滴灌苜蓿根际的定殖动态和结瘤性能

结果表明（见图11），滴施接种根瘤菌XGL026菌株在地下滴灌3年生、4年生大田苜蓿根际均能稳定定殖。三年生苜蓿在2茬草定殖量最高，可达6.56x10⁴±3.47（CFU/g干土）；四年生苜蓿第2茬开花期达到最高，平均定殖量6.6x10⁴±1.94（CFU/g干土）。滴施根瘤菌同时施用少量氮肥的处理，各茬定殖量最高。

结果表明（见图12），接种根瘤菌能显著提高苜蓿单株结瘤数量、根瘤重量，接种后3年生苜蓿3茬苜蓿平均结瘤数较不接种不施肥的CK、常规施肥大田提高35～55个/株；4年生苜蓿3茬苜蓿增加35～48个/株。

结果表明（见图13），接种根瘤菌在3年生、4年生3茬草苜蓿根部的占瘤率分别可达35.2%～72.38%、20.23～75.32%。施菌加施氮肥的处理占瘤率较稳定，至第三茬草仍能稳定在50%以上。

3. 接种根瘤菌对大田地下滴灌苜蓿草产量的影响

在3年生、4年生苜蓿1-3茬随头水滴施1次根瘤菌，并施用少量氮肥（尿素20kg/hm²）的处理，较常规大田处理（1-3茬每茬浇3水，每次施尿素30- 45kg/hm² ），干草产量增加20.31%～30.1%，3年生苜蓿增产更加显著（见图14）。

4. 接种根瘤菌对地下滴灌苜蓿草品质的影响

接种苜蓿草粗蛋白含量16.50%～17.07%，较对照增加0.76%～1.33%；明显降低NDF和ADF 含量，显著改善了饲草品质（见图15）。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将苜蓿根瘤菌转接到YMA平板培养基上，活化后，挑取单菌落接种至YMA液体培养基中培养至有效活菌数不低于1×10¹⁰CFU /mL；

（2）将苜蓿种子在根瘤菌菌液中浸泡后，阴干后播种；

（3）播种后随头水滴施根瘤菌液1次；

（4）第1茬苜蓿刈割后随第2茬苜蓿返青水滴施根瘤菌1次，同时施少量氮肥；

（5）第2茬苜蓿收获随第3茬苜蓿返青水滴施根瘤菌1次，同时施少量氮肥。

2.如权利要求1所述方法中，苜蓿种子在根瘤菌菌液中的浸泡方法为1000mL菌液浸泡1Kg种子，浸种时间为30分钟。

3.如权利要求1所述的滴施根瘤菌液方法，采用地下滴灌带对苜蓿灌溉时，在停水前1-2 h时，用施肥泵将根瘤菌液打入到地下滴灌带的支管中，根瘤菌液即随毛管中的灌溉水均匀扩散到苜蓿根部土壤中。

4.如权利要求1所述的方法中，第2茬苜蓿和3茬苜蓿施用氮肥种类为尿素，施用量均为20 kg·hm^-2。

5.如权利要求1所述的方法，每次滴施根瘤菌的接种量为45 L菌液·hm^-2。

6.根据权利要求1所述的接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的应用方法，其特征在于应用于新疆多年生紫花苜蓿的生产。

7.根据权利要求1所述的接种根瘤菌促进地下滴灌苜蓿增产提质的应用方法，其特征在于应用于地下滴灌苜蓿栽培模式。