CN108728402A - 一种活检培养液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种活检培养液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。所述活检培养液是将蔗糖以0.05‑0.3mol/L的浓度溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。本发明是将低摩尔浓度的蔗糖溶解于无钙、镁离子的缓冲盐溶液中，来温和地保护胚胎的活力及其质膜完整性，并使胚胎细胞收缩，且不粘连活检针，不仅能提高胚胎活检后的活力和DNA完整性，保护活检细胞的活性，进而确保活检样品的检测结果，提高胚胎的着床率，同时，也为活检样品的检测和辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。

Description

一种活检培养液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种活检培养液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。
背景技术
人类辅助生殖技术中，活检培养液主要应用于人类辅助生殖技术中胚胎活检。目前，临床使用的常规的活检培养液为仅以HEPES或者MOPS盐溶液为缓冲的蛋白溶液，不能有效地保持活检胚胎的活力和完整性，尤其对活检样品的保存不够完好。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种各项质控达标的活检培养液，不仅能有效地保存活检胚胎的活力，提高胚胎DNA的完整性，也为辅助生殖技术的安全性提供有力保证。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种活检培养液，其特征在于：是将蔗糖以0.05-0.3mol/L的浓度溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。
优选的：所述抗菌素为庆大霉素，浓度为5-25μg/mL。
优选的：所述指示剂为酚红，浓度4.5-10.0μg/mL。
优选的：所述盐溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠98.11-102.00mmol/L、氯化钾4.55-4.70mmol/L、碳酸氢钠3.90-4.10mmol/L、HEPES或MOPS19.99-22.00mmol/L、葡萄糖2.68-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.31-0.33mmol/L、乳酸钠21.11-21.66mmol/L、磷酸二氢钾0.36-0.39mmol/L；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成，终浓度为2.0-10.0mg/mL。
本发明所述活检培养液的制备方法，包括以下步骤：
1、配制盐溶液：先按照盐溶液的各组分用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得盐溶液；
2、检测步骤1所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为310-325mOsm/Kg，所述pH值保持为7.25-7.55；
3、按照预配置的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为2.0-10.0mg/mL补充到盐溶液中；
4、将蔗糖以0.05-0.3mmol/L的浓度溶解于盐溶液中；
5、将步骤4所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
A、20-25℃条件下pH值：7.25-7.55；
B、渗透压：310-325mOsm/Kg；
C、内毒素：＜0.15EU/mL；
D、一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
6、将配置好的溶液在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
有益效果：与现有技术相比，本发明是将低摩尔浓度的蔗糖溶解于无钙、镁离子的缓冲盐溶液中，来温和地保护胚胎的活力及其质膜完整性，并使胚胎细胞收缩，且不粘连活检针，不仅能提高胚胎活检后的活力和DNA完整性，保护活检细胞的活性，进而确保活检样品的检测结果，提高胚胎的着床率，同时，也为活检样品的检测和辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
具体实施方式
下面结合具体实施实施方式对本发明做进一步说明。
本发明所述的活检培养液，是将蔗糖以0.05-0.3mol/L的浓度溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。所述抗菌素为庆大霉素，浓度为5-25μg/mL。所述指示剂为酚红，浓度4.5-10.0μg/mL。所述盐溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠98.11-102.00mmol/L、氯化钾4.55-4.70mmol/L、碳酸氢钠3.90-4.10mmol/L、HEPES或MOPS19.99-22.00mmol/L、葡萄糖2.68-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.31-0.33mmol/L、乳酸钠21.11-21.66mmol/L、磷酸二氢钾0.36-0.39mmol/L；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成，终浓度为2.0-10.0mg/mL。
本发明所述活检培养液的制备方法，包括以下步骤：
1、配制盐溶液：先按照盐溶液的各组分用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得盐溶液；
2、检测步骤1所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为310-325mOsm/Kg，所述pH值保持为7.25-7.55；
3、按照预配置的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为2.0-10.0mg/mL补充到盐溶液中；
4、将蔗糖以0.05-0.3mmol/L的浓度溶解于盐溶液中；
5、将步骤4所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
A、20-25℃条件下pH值：7.25-7.55；
B、渗透压：310-325mOsm/Kg；
C、内毒素：＜0.15EU/mL；
D、一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
6、将配制好的溶液在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
【存储说明和稳定性】
存储：将分装好的活检培养液存放于2℃至8℃；避免液体暴露于CO2的环境，防止pH降低到7.0或更低的水平；不要暴露在高于39℃的温度下。
稳定性：产品稳定性可以直到标签上显示的到期日期；使用无菌程序除去所需体积的产品，一旦移除，不要将任何量的产品返回原始容器；如果产品变色、浑浊或有微生物污染迹象，请勿使用；为避免污染问题，使用无菌技术进行处理，并在完成操作后丢弃瓶子或小瓶中剩余的任何多余产品。
【具体使用方法】
第1天：收集受精卵；
第2天：将1-2mL活检培养液置于培养皿中，用预平衡的液体石蜡覆盖，并在含5-6％CO2的环境中平衡至37℃，至少2小时；
第3天：胚胎活检
在受精后第3天早晨，进行早期胚胎活检；活检前半小时，为每个胚胎准备活检盘；用10×10μL活检培养液冲洗吸头的尖端；吸取三滴活检培养液和一滴PVP；立即用4mL预平衡的石蜡油覆盖培养皿，以避免蒸发，并将制备的培养皿在含5-6％CO2的环境中温热至37℃，同时，准备胚胎培养液的微滴，用于在诊断时进行胚胎的洗涤和最终培养；
取预平衡的培养皿，并将胚胎转移到培养皿的中间小液滴中；用活检吸管吸取PVP液滴，以避免胚胎粘附在移液管上；
执行透明带激光打孔操作；已经获得了透明带中的小孔，则使用取样吸移管接近卵裂球；为了使质量减少最小化，将一个或两个最小的卵裂球进行活检并放置在相应的活检培养液小滴中；
第5天：囊胚活检
第3天的打孔胚胎形成囊胚后，多余的滋养层细胞突出孔外，用活检吸管吸取突出孔外的滋养层细胞，用激光断裂细胞样品。
活检后，立即通过将胚胎在几滴/孔的囊胚培养液之间转移来彻底洗涤胚胎；最后，将胚胎转移到具有用预平衡的液体石蜡覆盖的胚胎培养液的微滴/孔的新皿中；将具有分离的卵裂球的活检皿，用于样品制备。

Claims (5)

1.一种活检培养液，其特征在于：是将蔗糖以0.05-0.3mol/L的浓度溶解于含有抗菌素和指示剂的盐溶液中配制而成。
2.根据权利要求1所述的活检培养液，其特征在于：所述抗菌素为庆大霉素，浓度为5-25μg/mL。
3.根据权利要求2所述的活检培养液，其特征在于：所述指示剂为酚红，浓度4.5-10.0μg/mL。
4.根据权利要求3所述的活检培养液，其特征在于：所述盐溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠98.11-102.00mmol/L、氯化钾4.55-4.70mmol/L、碳酸氢钠3.90-4.10mmol/L、HEPES或MOPS 19.99-22.00mmol/L、葡萄糖2.68-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.31-0.33mmol/L、乳酸钠21.11-21.66mmol/L、磷酸二氢钾0.36-0.39mmol/L；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成，终浓度为2.0-10.0mg/mL。
5.如权利要求4所述活检培养液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制盐溶液：先按照盐溶液的各组分用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得盐溶液；
(2)检测步骤(1)所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为310-325mOsm/Kg，所述pH值保持为7.25-7.55；
(3)按照预配制的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为2.0-10.0mg/mL补充到盐溶液中；
(4)将蔗糖以0.05-0.3mmol/L的浓度溶解于盐溶液中；
(5)将步骤(4)所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
A、20-25℃条件下pH值：7.25-7.55；
B、渗透压：310-325mOsm/Kg；
C、内毒素：＜0.15EU/mL；
D、一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
(6)将配制好的溶液在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
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