CN108685980A - 一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂及其制备方法和应用，属于兽药领域。本发明的中草药复方制剂为散剂或液体制剂，由刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草、马蹄香六种药材直接混合制得或将上述药材加水煎煮，去渣取液浓缩后制得；所述刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草和马蹄香的质量比为2：2：2：1：1：1。本发明的中草药复方制剂可作为饲料添加剂或注射剂应用于畜禽养殖中，有效提升动物特异性的抗体效价，降低病毒载量，增强免疫细胞和免疫介质的数量与活性，促进免疫器官的生长发育，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力，克服了疫苗、化药、抗生素的毒副作用与食品安全隐患，研发前景乐观，临床应用广阔。

Description

一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于兽药领域，具体涉及一种中草药复方制剂及其制备方法和在改善猪免疫抑制状态方面的应用。
背景技术
目前我国养猪生产面临着日趋严峻的疫病威胁，发病情况复杂多变，生产风险与日俱增，控制成本显著提高，经济损失无法估量。其重要原因在于猪群中普遍存在免疫抑制性疾病。猪免疫抑制性疾病是通过损伤免疫组织，影响细胞活性，干扰抗原递呈，抑制抗体形成等途径，导致机体抗病能力显著下降的一类疾病，同时也是当前疫苗免疫失败与诱发混合感染的重要因素。免疫抑制的两种主要表现形式可以概括为“一高一低”，即机体对疾病的易感性增高和对疫苗的应答性降低。由于免疫抑制性疾病常以亚临床感染的形式出现，易被忽视，因此，必须加强对免疫抑制性疾病的重视，并做好防控工作。猪群中普遍存在的免疫抑制性疾病包括猪圆环病毒2型感染、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪支原体肺炎、猪伪狂犬、猪附红细胞体等疫病。
病原体在传染过程中，会遇到三道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制、特异性防御机制。这三道互相补充、相互协作，共同构成机体完整的免疫功能系统，维持机体的健康。当机体受到病原体侵入时，会调动这三方面的防御机制。猪是否发病取决于其综合防御机能的强弱，也就是抗病力水平的高低。抗病力主要受先天免疫和后天免疫影响：先天免疫快速、无特异性，是防御的第一线，主要与嗜中性细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、补体、干扰素、溶菌酶及急性蛋白因子有关；后天免疫(获得性免疫)是特异性的，由抗原递呈细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞及各种细胞因子(cytokines)共同作用而产生。
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(porcine multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。PCV2感染可造成猪体内Th1/Th2免疫应答的失衡，这可能是PCV2对猪产生免疫抑制的分子机制之一。PCV2诱导的Th1类和Th2类细胞因子间可以进行相互调节，表现为交互抑制作用。PCV2能引起细胞的凋亡，且使B细胞和T细胞的机能下降，从而使感染猪不能产生有效的免疫应答。PCV2感染引起的淋巴滤泡破坏和白细胞数量减少导致了猪的免疫抑制。淋巴枯竭的严重性与PCV2抗原在感染组织中检测到的数量积极相关。PCV2在淋巴组织中感染和复制能破坏淋巴滤泡的结构，导致淋巴枯竭，随后淋巴组织中淋巴细胞由组织细胞代替。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reprodutive and respratory syndrome，PRRS)是由冠状病毒科动脉炎病毒属的PRRSV引起的一种猪繁殖和呼吸发生障碍的传染病。本病以妊娠母猪死胎、流产、木乃伊胎、弱仔及仔猪呼吸道症状和高死亡率等为特征。PRRSV感染早期可以诱导受感染猪外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞的细胞凋亡，此凋亡可能是导致PRRSV相关病变及免疫抑制的重要机制；PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞早期细胞凋亡的表达率在病毒感染后24h达到高峰，随后逐渐下降。由于淋巴结、淋巴小结和副皮质区及脾白髓都受到了广泛性的破坏，致使机体的体液免疫和细胞免疫能力降低。仔猪感染PRRSV病毒后淋巴细胞各亚群的比例下降可能会抑制机体对其它病原体的免疫反应，扁桃体的细胞比例变化有利于其它呼吸道病原体的混合感染或继发感染。
应用中药调节机体免疫功能和防治传染病在我国已有数千年的历史，并以确切的疗效和较低的毒副残留及抗药性而广受欢迎。我国拥有丰富的中草药资源，应加速对其的研究与开发，打造具有中国特色的品牌。对解决长期困扰畜牧业发展的抗生素残留问题，发展绿色养殖业，满足人们对食品安全的需求，增强我国畜产品在国际市场的竞争力，具有重要的经济意义和社会效益。
中草药刺五加中含有皂苷、多糖和黄酮等丰富的生物活性成分，能够积极地调节动物机体的免疫功能。绞股蓝及其有效成分总皂苷、多糖对机体的免疫系统有增强作用，受到人们的广泛关注。叶下珠可明显抑制动物的肝脏损伤，具有抗病毒和调节免疫的功效。荔枝草具有止咳平喘、抗炎镇痛、抗氧化、保肝、抑菌、推进小肠运动、促进免疫器官发育等多种药理作用。紫草水提物对免疫功能低下小鼠的非特异性免疫、体液免疫以及细胞免疫功能均有显著促进作用。马蹄香对小鼠脾淋巴细胞转化能力有一定的促进作用，且能够提高其PMΦ能量代谢水平和吞噬能力。
PCV2和PRRSV感染造成兽医临床上最为常见和典型的免疫抑制性疾病，这直接导致在疾病诊治过程中使用大量药物，造成病原微生物的耐药性日新月异；同时动物机体的特异性和非特异性免疫力下降，对各种疫苗无法应答，或产生的抗体效价低下，造成低致病力的病原体或弱毒疫苗也可能感染猪体发病；更为严重的是由PCV2和PRRSV等所带来的混合感染，使疾病更为复杂，有时会造成新的综合征，甚至达到难以控制的程度，给养猪生产造成巨大的经济损失，同时带来公共卫生安全隐患。
本发明通过大量实验发现刺五加等中药联用具有解除免疫抑制和调节免疫功能的作用，现有技术没有公开过该中药复方具有解除免疫抑制和调节免疫功能的作用，也没有将该中药复方作为饲料添加剂替代抗生素应用于畜禽养殖中，基于此，做出本申请。
发明内容
本发明的目的是提供一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂及其制备方法，同时本发明还提供了上述中草药复方制剂的应用。本发明将所述中草药复方制剂作为饲料添加剂或注射剂应用于畜禽养殖中，能有效提升动物特异性的抗体效价，降低病毒载量，增强免疫细胞和免疫介质的数量与活性，促进免疫器官的生长发育，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力，克服了疫苗、化药、抗生素的毒副作用与食品安全隐患，研发前景乐观，临床应用广阔，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂，所述中草药复方制剂由刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草、马蹄香组成，所述刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草和马蹄香的质量比为2：2：2：1：1：1。
进一步地，上述技术方案中所述中草药复方制剂为固体制剂或液体制剂。
优选地，上述技术方案中所述的固体制剂为散剂。
本发明的另一个目的在于提供上述所述中草药复方制剂的制备方法。
上述所述中草药散剂的具体制备工艺步骤为：将刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草、马蹄香粉碎、并按比例混合均匀后干燥，即制得所述散剂。
上述所述中草药液体制剂的具体制备工艺步骤为：将刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草和马蹄香按所述比例制成散剂后，将其加10倍体积蒸馏水于容器内，浸泡1h后加热回流1h，趁热用纱布过滤得一次药渣，所述一次药渣再加8倍体积水加热回流1h后趁热用纱布过滤得二次药渣，所述二次药渣加6倍体积水加热回流1h后趁热用纱布过滤得三次药渣，合并上述三次药渣对应的三次滤液，减压浓缩成生药浓度为1g/mL的液体制剂。
本发明的还一目的在于提供上述所述的中草药复方制剂的应用，可作为饲料添加剂或注射剂应用于畜禽养殖中。
一种用于防治猪圆环病毒病的饲料添加剂，所述饲料添加剂为上述方法制得的中草药复方散剂。
上述所述的饲料添加剂的具体应用方法为：将所述中草药复方散剂以质量比1：100的比例与猪基础饲料混合均匀即可。
一种用于改善猪免疫抑制状态的注射剂，所述注射剂为上述所述方法制得的液体制剂。
优选地，上述技术方案中所述的注射剂的具体注射方法为：
将所述中药复方液体制剂对猪进行肌肉注射，每天一次，每次2ml，持续2周即可。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提出一种中草药复方制剂作为兽药改善猪免疫抑制状态的应用，能有效提升动物特异性的抗体效价，降低病毒载量，增强免疫细胞和免疫介质的数量与活性，促进免疫器官的生长发育，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力，克服了疫苗、化药、抗生素的毒副作用与食品安全隐患，研发前景乐观，临床应用广阔。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实例基础饲粮由南京禾嘉吉升农牧发展有限公司提供，基础饲粮组成及营养水平见表1。取同仁堂药店购得的中药刺五加：绞股蓝：叶下珠：荔枝草：紫草：马蹄香按质量为2:2:2:1:1:1制成散剂后，再按质量比1:100与基础饲粮混合均匀，进行仔猪体内试验。
表1基础饲粮组成及营养水平(风干基础)表
40头健康普通级“杜×大×长”三元杂交断奶仔猪，50日龄，购自南京农业大学江浦试验猪场。适应环境一周后，随机分为4组，每组10头，公母各半。空白组和PCV2组饲喂不添加中药复方散剂的基础日粮、预防组和药物对照组饲喂添加1％中药复方散剂的基础日粮2周后，饲喂不添加中药复方散剂的基础日粮。于试验的第三周第1dPCV2组和预防组以107TCID50/mL的PCV2AH株攻毒，每头颈部肌肉注射2.0mL，同时滴鼻2.0mL 1次，然后隔离饲养。试验总周期为4周。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采血，酶联免疫吸附法检测血清中PCV2的抗体水平，实时荧光定量PT-PCR法检测血清中PCV2的抗原含量。结果发现，PCV2组的PCV2抗体水平OD值为0.267，预防组的PCV2抗体水平OD值为0.401，两者差异极显著，空白组的PCV2抗体水平OD值为0.063，药物对照组的PCV2抗体水平OD值为0.078。PCV2组的抗原含量为7.35(lg)/μL，预防组的抗原含量为4.21(lg)/μL，两者差异极显著，空白组和药物对照组的PCV2抗原均未检测到。实验表明，该中药复方散剂可以大幅上调仔猪PCV2的抗体水平，特异性的中和、消灭PCV2病原，从而增强机体免疫功能，预防疫病的发生。同时显著降低机体内的病毒含量，抑制病毒血症的产生，具有明显的抗PCV2病毒作用。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采血，全自动生化分析仪检测机体中IgG、IgM、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)的水平。结果发现PCV2组的IgG水平为1.41mg/mL，预防组的IgG水平为1.93mg/mL，两者差异极显著，空白组的IgG水平为1.50mg/mL，药物对照组的IgG水平为1.74mg/mL。PCV2组的IgM水平为0.57mg/mL，预防组的IgM水平为1.02mg/mL，两者差异极显著，空白组的IgM水平为0.61mg/mL，药物对照组的IgM水平为0.80mg/mL。PCV2组的血清ALB含量为31.3g/L，预防组的ALB含量为37.0g/L，两者差异显著，空白组的ALB含量为33.5g/L，药物对照组的ALB含量为37.7g/L。PCV2组的血清GLO含量为29.9g/L，预防组的GLO含量为38.5g/L，两者差异极显著，空白组的GLO含量为34.9g/L，药物对照组的GLO含量为37.2g/L。实验表明，本实施例的中草药复方散剂能大幅上调仔猪血清中IgG的水平，从而提高防病抗病能力。同时还能显著提高IgM水平，影响体液免疫反应。白蛋白作为一种贮存蛋白质，可随时修补组织和提供能量。该散剂能显著上调ALB水平，增加机体肝脏代谢功能。同时还能显著提高GLO水平，增强机体免疫功能。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采血，酶联免疫吸附法检测血清中IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ的含量。结果发现，PCV2组的IL-4含量为92.1pg/mL，预防组的IL-4含量为78.2pg/mL，两者差异极显著，空白组的IL-4含量为80.4pg/mL，药物对照组的IL-4含量为86.4pg/mL。PCV2组的IL-10含量为152.5pg/mL，预防组的IL-10含量为131.9pg/mL，两者差异极显著，空白组的IL-10含量为122.0pg/mL，药物对照组的IL-10含量为129.4pg/mL。PCV2组的IL-2含量为273.8pg/mL，预防组的IL-2含量为324.7pg/mL，两者差异极显著，空白组的IL-2含量为260.5pg/mL，药物对照组的IL-2含量为256.7pg/mL。PCV2组的IFN-γ含量为188.6pg/mL，预防组的IFN-γ含量为239.9pg/mL，两者差异极显著，空白组的IFN-γ含量为171.0pg/mL，药物对照组的IFN-γ含量为182.5pg/mL。实验表明，本实施例的中草药复方散剂能显著下调IL-4和IL-10水平，减弱静止性Th0细胞向Th2方向分化，抑制Th2效应，从而解除机体免疫耐受情况；同时该中草药复方散剂能显著上调IL-2和IFN-γ水平，促进静止性Th0细胞向Th1方向分化，增强Th1效应，从而改善机体免疫抑制状态。
实施例2
取同仁堂药店购得的中药刺五加：绞股蓝：叶下珠：荔枝草：紫草：马蹄香按质量比为2:2:2:1:1:1制成散剂后，加10倍蒸馏水于圆底烧瓶中，浸泡1h后加热回流1h，趁热用纱布过滤。药渣再依次加8倍水和6倍水分别加热回流1h。合并3次滤液，减压浓缩生成药浓度为1g/mL的液体制剂，进行仔猪体内试验。
40头健康普通级“杜×大×长”三元杂交断奶仔猪，50日龄，购自南京农业大学江浦试验猪场。适应环境一周后，随机分为4组，每组10头，公母各半。空白组和PRRSV组不进行颈部肌肉注射该中药复方液体制剂。PRRSV组和治疗组以106TCID50/mL的PRRSV SH株攻毒，每头颈部肌肉注射2.0mL，同时滴鼻2.0mL，1次，然后隔离饲养2周。于试验的第三周第1d治疗组和药物对照组肌肉注射该液体制剂每天1次，每次2.0mL，持续2周。试验总周期为4周。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采血，间接ELISA法测定各组血清中特异性抗体的活性，用免疫球蛋白ELISA试剂盒测定IgG、IgM、IgA含量。结果发现，PRRSV组的血清抗体OD值为0.538，治疗组的血清抗体OD值为0.698，两者差异显著，空白组的血清抗体OD值为0.401，药物对照组的血清抗体OD值为0.459。PRRSV组的IgG水平为458.9mg/L，治疗组的IgG水平为640.6mg/L，两者差异极显著，空白组的IgG水平为411.3mg/L，药物对照组的IgG水平为534.1mg/L。PRRSV组的IgM水平为220.9mg/L，治疗组的IgM水平为416.1mg/L，两者差异极显著，空白组的IgM水平为202.5mg/L，药物对照组的IgM水平为302.8mg/L。PRRSV组的IgA水平为47.5mg/L，治疗组的IgA水平为70.8mg/L，两者差异极显著，空白组的IgA水平为48.6mg/L，药物对照组的IgA水平为56.3mg/L。实验表明，该液体制剂能大幅上调仔猪血清中特异性PRRSV的抗体水平，及非特异性免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的含量，从而改善机体免疫抑制状态，提高动物体液免疫功能。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采EDTA-Na抗凝血2mL/头，用于检测淋巴细胞亚群。结果发现，PRRSV组的CD3+细胞亚群比例为74.12，治疗组的CD3+细胞亚群比例为56.38，两者差异极显著，空白组的CD3+细胞亚群比例为57.41，药物对照组的CD3+细胞亚群比例为63.28。PRRSV组的CD4+细胞亚群比例为12.53，治疗组的CD4+细胞亚群比例为25.32，两者差异极显著，空白组的CD4+细胞亚群比例为26.24，药物对照组的CD4+细胞亚群比例为23.91。PRRSV组的CD8+细胞亚群比例为30.04，治疗组的CD8+细胞亚群比例为43.41，两者差异极显著，空白组的CD8+细胞亚群比例为42.27，药物对照组的CD8+细胞亚群比例为34.50。CD3T淋巴细胞的数量直接反映了外周免疫器官中总T细胞数量水平。CD4T细胞具有辅助性T细胞的功能，能诱导和增强免疫应答，激活各种免疫细胞(包括直接激活B细胞的增值与分泌抗体)。CD8T细胞代表着细胞毒性T细胞或抑制性T细胞的一个功能亚群，对消除细胞内源起重要作用。免疫抑制主要表现为CD4数量减少，CD8数量相对增多。实验表明，本实施例的液体制剂能增强动物机体细胞免疫功能，改善免疫抑制。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采肝素抗凝血2mL/头，用于检测淋巴细胞转化率。无菌取脾脏，用于检测脾脏淋巴细胞凋亡率。结果发现，PRRSV组的淋巴细胞转化率值为1.21，治疗组的转化率值为1.92，两者差异极显著，空白组的转化率值为1.22，药物对照组的转化率值为1.53。PRRSV组的凋亡率值为21.23，治疗组的凋亡率值为13.74，两者差异极显著，空白组的凋亡率值为17.28，药物对照组的凋亡率值为15.77。PRRSV组的NK细胞值(％)为23.8，治疗组的NK细胞值(％)为30.2，两者差异极显著，空白组的NK细胞值(％)为23.6，药物对照组的NK细胞值(％)为26.4。实验表明，该中药复方可以大幅上调仔猪淋巴细胞转化率，通过促进猪体内细胞免疫功能，从而增强机体非特异性免疫。同时显著降低脾脏淋巴细胞的凋亡率，减少免疫抑制的直接损害。NK细胞是目前公认的免疫监视系统中最理想的效应细胞，本试验结果表明，本实施例的液体制剂能够增加NK细胞的数量，使整体免疫水平提高。
尽管本发明是参照具体实施例来描述，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，所公开的实施例的其他变化，对于本领域技术人员都是可以预料的，这种的变化应属于所属权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种改善猪免疫抑制状态的中草药复方制剂，其特征在于：所述中草药复方制剂由刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草、马蹄香组成，所述刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草和马蹄香的质量比为2：2：2：1：1：1。
2.根据权利要求1所述的中草药复方制剂，其特征在于：所述中草药复方制剂为固体制剂或液体制剂。
3.根据权利要求2所述的中草药复方制剂，其特征在于：所述固体制剂为散剂。
4.权利要求3所述的中草药复方制剂的制备方法，其特征在于：所述散剂的制备工艺步骤为：将刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草、马蹄香粉碎、并按比例混合均匀后干燥，即制得中草药复方散剂。
5.权利要求2所述的中草药复方制剂的制备方法，其特征在于：所述液体制剂的制备工艺步骤为：将刺五加、绞股蓝、叶下珠、荔枝草、紫草和马蹄香按比例制成散剂后，将其加10倍体积蒸馏水于容器内，浸泡1h后加热回流1h，趁热用纱布过滤得一次药渣，所述一次药渣再加8倍体积水加热回流1h后趁热用纱布过滤得二次药渣，所述二次药渣加6倍体积水加热回流1h后趁热用纱布过滤得三次药渣，合并上述三次药渣对应的三次滤液，减压浓缩成生药浓度为1g/mL的液体制剂。
6.权利要求1所述中草药复方制剂的应用，其特征在于：所述制剂作为饲料添加剂或注射剂应用于畜禽养殖中。
7.一种用于防治猪圆环病毒病的饲料添加剂，其特征在于：所述饲料添加剂为权利要求4所述方法制得的中草药复方散剂。
8.权利要求7所述的饲料添加剂的应用方法，其特征在于：将所述中草药复方散剂以质量比1：100的比例与猪基础饲料混合均匀。
9.一种用于改善猪免疫抑制状态的注射剂，其特征在于：所述注射剂为权利要求5所述方法制得的液体制剂。
10.权利要求9所述的注射剂的注射方法，其特征在于：将所述液体制剂对猪进行肌肉注射，每天一次，每次2ml，持续2周。
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