CN108627597A - 一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱对硫酸沙丁胺醇有关物质进行定性或定量检测，检测条件包括：色谱柱：辛烷基键合硅胶柱，检测波长：210～400nm，流动相包括流动相A、流动相B，流动相A：含缓冲液的水相，pH为1.5～4.0，进一步的，pH为2.0～3.0；流动相B:主要包括甲醇或乙腈；流动相采用梯度洗脱法洗脱；检测步骤包括：(1)制备供试品溶液、对照品溶液；(2)分别将供试品溶液、对照品溶液进样检测。本发明采用的硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，能够保证有关物质有效分离。

Description

一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及检测方法领域，特别是涉及一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法。

背景技术

硫酸沙丁胺醇〔1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇硫酸盐〕是一种强效速效的选择性β2受体激动剂，对于哮喘性支气管炎、支气管哮喘和肺气肿患者的支气管痉挛等呼吸道疾病均有较好的治疗作用。

有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。有关物质研究是药品质量研究中关键性的项目之一，其含量不仅反映药品纯度的直接指标，而且有重要的安全意义。现有的国内外药典收载了硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，但药典的检查方法存在严重的缺陷，不能够分离和检测出所有的硫酸沙丁胺醇有关物质，导致不能保障硫酸沙丁胺醇的质量和安全性。

本发明研究了一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法。

发明内容

发明人在研究硫酸沙丁胺醇质量和安全性时，偶然的发现了一种能够分离和检测硫酸沙丁胺醇中有关物质的方法，具体的，一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱进行检测，对有关物质进行定性或定量，检测条件包括：

色谱柱：辛烷基键合硅胶柱，检测波长：210～400nm，流动相包括流动相A、流动相B，流动相A：含缓冲液的水相，pH为1.5～4.0，进一步的，pH为2.0～3.0；流动相B:主要包括甲醇或乙腈；流动相采用如下梯度洗脱程序：

检测步骤包括：

(1)制备供试品溶液、对照品溶液；

(2)分别将供试品溶液、对照品溶液进样检测。

所述硫酸沙丁胺醇包括硫酸沙丁胺醇原料药或其制剂。

所述供试品为待检测的硫酸沙丁胺醇。

本发明中定性检测，可以使用常规方法进行，例如选用对照品通过外标法进行对应分析，又或者通过HPLC将各成分分开以后，通过常规鉴定手段进行定性分析，如质谱、薄层、紫外等等。

本发明中定量检测，可以使用外标法、内标法、自身对照法、面积归一法等常规方法进行含量计算。

在定量分析时，若使用外标法，可采用常规手段制作标准曲线进行计算；但在定性分析时，则无需制作标准曲线，可通过保留时间来判定。

进一步地，流动相采用如下梯度洗脱程序：

进一步地，所述流动相A还含有三乙胺或己胺，进一步选自三乙胺，三乙胺体积浓度为0.05％～0.2％，更进一步为0.1％。

进一步地，所述缓冲液是磷酸盐-磷酸缓冲液；进一步地，磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠的一种或多种的混合物；更进一步地，所述缓冲液中，磷酸氢二铵浓度为10mmol/L～30mmol/L，优选为20mmol/l。

在本发明中缓冲液是取适当浓度的磷酸盐溶液，加入磷酸调节pH而制得。

进一步地，所述流动相B:主要包括甲醇。

在确定了本发明色谱柱填料的基础上，所述色谱柱长度为100～150mm；内径为3.0～4.6mm；填料的粒径为2.7～3.5μm；在本发明的一个具体实施例中，色谱柱长度为150mm；内径为4.6mm；填料的粒径为2.7μm。

本发明的实施例中，所述色谱柱填料为ZORBAX SB-C8或Poroshell 120SB-C8，优选为Poroshell 120SB-C8。

在确保正常的保留时间、系统压力等情况下，根据色谱柱尺寸，可以适当调整流速、柱温、进样量等的范围，例如，所述流速为0.5ml/min～1.0ml/min，优选为0.6ml/min；

例如，所述检测条件还包括柱温，所述柱温：28～32℃，优选为30℃；

例如，所述检测条件还包括进样量，所述进样量：5～20μl，优选为5μl l。

进一步地，所述制备供试品溶液、对照品溶液的溶剂选自甲醇、乙腈、水的一种或多种混合物，本发明研究发现，采用乙腈作为溶剂时，对检测效果有干扰，因此本发明进一步采用甲醇和水的混合物作溶剂；更进一步地，甲醇和水的混合物中甲醇体积百分比为10％～50％，在本发明的的一个具体实施例中为30％。

本发明检测波长，可以在前述公开的范围内通过常规手段进行调节选择。在寻找最佳检测波长时，可以使用紫外分光光度法、HPLC配套使用的全波段扫描等方式进行，再配合HPLC检测器的检测效果(如避免溶剂干扰等)，采用常规技术授权找到适宜的检测波长。本发明一个具体实施方式中，检测波长选自210～230nm，进一步选自218～222nm，例如220nm。

所述STS为硫酸沙丁胺醇。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用的硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，能够保证有关物质有效分离，且在实际检测的过程中，高效液相运行的过程转中柱压较低，对仪器要求不高；

2、本发明采用的硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法流动相体系与现有技术，如药典等方法中的流动相体系不一致，分离出的杂质峰更多，本发明检测方法可分离和有效检测15个已知杂质，而同样采用EP药典方法分离本发明硫酸沙丁胺醇有关物质主峰(硫酸沙丁胺醇色谱峰)与已知杂质J的色谱峰完全重合，采用2015年中国药典的方法虽可分离较多杂质，但分离度差。

附图说明

图1是本发明流动相梯度优化的色谱条件梯度1下的系统适用性谱图；

图2是本发明流动相梯度优化的色谱条件梯度2下的系统适用性谱图；

图3是本发明降解预实验的典型图谱；

图4是本发明2015版中国药典STS原料的有关物质分析方法-系统谱图；

图5是本发明EP STS原料的有关物质分析方法-系统谱图；

图6是采用本发明一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法分离和检测15个已知杂质图谱；

图7是本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件1图谱；

图8是本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件2图谱；

图9是本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件3图谱；

图10是本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件4图谱。

具体实施方式

实施例1

取硫酸沙丁胺醇适量，精密称定，加溶剂[甲醇-水(3:7v/v)]溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用上述溶剂定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Poroshell 120SB-C8，4.6×150mm，2.7μm)，以0.1％三乙胺-磷酸氢二铵缓冲液(取磷酸氢二铵2.64g，加水溶解并稀释至1000ml，加入1ml三乙胺，再用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1进行线性梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.6ml；检测波长为220nm。另取沙丁胺醇对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质D对照品、杂质F对照品、杂质J对照品、S38901对照品、S38903-Z1对照品、S54879对照品、S54868对照品和S38461对照品各适量，精密称定，加上述溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含本品1mg，其余杂质各10μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。精密量取系统适用性溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为：杂质J、沙丁胺醇、S38901、S54879、S38903-Z1、S54868、杂质D、杂质A、杂质B、杂质F和S38461，杂质J与沙丁胺醇之间的分离度应不小于1.0，其余各已知杂质峰间的分离度应不小于1.0。精密量取对照溶液和供试品溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中扣除溶剂峰外如有杂质峰，按主成分自身对照法计算杂质含量，均应符合表2中相应限度规定。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰峰面积0.06倍(0.03％)的峰忽略不计。

表1梯度洗脱程序

表2硫酸沙丁胺醇特定杂质限度

本发明一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法可分离和检测15个已知杂质图谱见图6。

表3本发明可分离和检测的15个已知杂质的信息

实施例2

1分析方法建立

1.1实验设计和概述

硫酸沙丁胺醇(STS)的合成路径如下：

根据STS合成路线，可知本品原料药中可能出现的杂质有起始原料、中间体、工艺副产物及降解产物，其中起始原料为S38461，中间体为S38901和S38903，工艺副产物有中间体S38901还原过程中可能产生的过渡态(杂质D和杂质J)和S38903的醚化的副产物(杂质A、杂质B、S54868、S54879和杂质F)，而可能降解产生的杂质有杂质A、杂质B、S54868、S54879、杂质F和杂质J。

根据合成工艺对杂质的清除能力，本品中间体Ⅰ(S38901)中需控制的已知杂质有S38461-Z1、S38461和S38901-Z1；中间体Ⅱ(S38903)中需控制的已知杂质有杂质J、S38901、S38903-Z1、S54879、S54868、杂质D、杂质A、杂质F、杂质B、S54871、S54881和杂质C；本发明建立一个可以同时检测上述中间体和成品有关物质的分析方法，这样更方便观察和分析杂质的清除情况，也更有利于后期的检测分析。

1.2分析方法的筛选

1.2.1色谱柱的选择

研究结果显示需杂质在C8柱上有更好的分离，故初步确立在C8色谱柱进行方法筛选。

1.2.2检测波长的选择

分析方法希望能同时分离检测15个杂质，包括杂质A、杂质B、杂质D、杂质F、杂质J、S38901、S38903-Z1、S54879、S54868、S38461、杂质C、S54871、S54881、S38461-Z1和S38901-Z1，结合各组分的紫外吸收波长，其中有8个杂质(杂质A、杂质B、S54879、S54868、S38903-Z1、S54871、S54881、杂质C)的紫外吸收与主成分沙丁胺醇一致，在225nm处有最大吸收；所有杂质在220nm处都有较强的吸收；除杂质D外，其他杂质在225nm处的吸收值约为220nm处吸收值的1.0～1.5倍，而含醛基结构的杂质D(限度0.05％)在225nm处的吸收值仅为220nm处吸收值的0.57倍(其最大吸收波长为216.8nm)；起始原料中控制的主要杂质水杨醛(含醛结构)在220nm处的吸收也强于225nm处的吸收；综合考虑，选择220nm作为检测波长，与起始原料有关物质的检测波长一致。

1.2.3确定初步的色谱条件

在选定了检测波长和色谱柱后，为了更有效分离STS与其相邻杂质以及其他杂质，对流动相梯度进行筛选。选取至少含有主成分、杂质A、杂质B、杂质D、杂质F、杂质J、S38901、S38903-Z1、S54879、S54868和S38461的混合溶液作为系统适用性溶液，用于考察方法的分离能力。

1、采用表4中色谱条件时，使用Agilent ZORBAX SB-C8，4.6×150mm，3.5μm与使用其他与之等效的色谱柱相较，采用等效色谱柱绝对保留时间在10～15分钟的三个已知杂质峰，分离度变差，表4中方法耐用性不好。

表4本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件1

2、采用表5中色谱条件时，杂质C色谱峰与S38461色谱峰完全重合。

表5本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件2

3、采用表6中色谱条件时，杂质C色谱峰与S38461色谱峰间的分离度可达到0.6。

表6本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件3

4、采用表7中色谱条件时，系统适用性溶液中各杂质之间的分离度均能达到1.0，但是梯度洗脱程序与表4～6中的梯度洗脱程序比较，运行时间延长10分钟，杂质S38461色谱峰和杂质C色谱峰的理论板数与使用表4～6中的色谱条件比较理论板数降低。

表7本发明未能达到最佳分离效果的色谱条件4

5.采用表8中的色谱条件在梯度1和梯度2条件下，系统适用性溶液中各杂质分离度均可达1.0以上，但在流动相梯度1条件下，在对各杂质定位时发现，S38461和杂质C重合；而在流动相梯度2条件下，S38461和杂质C分离度可达2.0以上，故选择流动相梯度2条件作为最终的梯度条件。梯度2条件作为最终的梯度条件的方法下，杂质B和S54871保留时间相同，其余杂质间的分离度均可达到1.0；通过调整不同的流动相梯度，仍不能在其余杂质有很好分离的情况下，将杂质B和S54871分离；从合成工艺分析，杂质B和S54871均为工艺杂质，且S54871产生的可能性极小，多批小试样品和临床批样品的检测结果也显示，未检出杂质B和S54871，因此考虑将杂质B和S54871合并控制，限度为0.1％。

对表8中在梯度2条件下的方法进行耐用性考察：使用不同品牌的仪器检测，或使用不同批次的色谱柱检测，系统适用性溶液中主峰与相邻杂质之间的分离度均大于2.0，各杂质之间的分离度均大于1.0，耐用性良好。

强制降解预实验显示，主峰与相邻杂质间的分离度均大于2.0，主要降解杂质与已知杂质间的分离度均大于1.0，该方法的专属性良好，见图3。

故确定用该方法检测STS原料的有关物质。

表8本发明流动相梯度优化的色谱条件

1.3与各国药典分析方法对比研究

USP40及JP17STS有关物质方法为TLC法，EP9.4方法及2015版中国药典STS原料的有关物质分析方法见表9。分别用EP9.4方法及2015版中国药典STS原料的有关物质分析方法对STS系统溶液进样分析，结果显示，采用ChP方法，部分杂质无法完全分离，采用EP方法，杂质J与主峰出峰时间重合，见图4，图5。

表9 EP9.4方法及2015版中国药典STS原料的有关物质分析方法

1.4待验证的方法

取硫酸沙丁胺醇适量，精密称定，加溶剂[甲醇-水(3:7v/v)]溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用上述溶剂定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Poroshell 120SB-C8，4.6×150mm，2.7μm或等效色谱柱)，以0.1％三乙胺-磷酸氢二铵缓冲液(取磷酸氢二铵2.64g，加水溶解并稀释至1000ml，加入1ml三乙胺，再用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1进行线性梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.6ml；检测波长为220nm。另取沙丁胺醇对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质D对照品、杂质F对照品、杂质J对照品、S38901对照品、S38903-Z1对照品、S54879对照品、S54868对照品和S38461对照品各适量，精密称定，加上述溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含本品1mg，其余杂质各10μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。精密量取系统适用性溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为：杂质J、沙丁胺醇、S38901、S54879、S38903-Z1、S54868、杂质D、杂质A、杂质B、杂质F和S38461，杂质J与沙丁胺醇之间的分离度应不小于1.0，其余各已知杂质峰间的分离度应不小于1.0。精密量取对照溶液和供试品溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中扣除溶剂峰外如有杂质峰，按主成分自身对照法计算杂质含量，均应符合表2中相应限度规定。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰峰面积0.06倍(0.03％)的峰忽略不计。

表1同实施例1表1

表2同实施例1表2

2方法验证结果

2.1验证数据小结

综上所述，该方法的系统适用性和专属性、线性和范围、精密度、准确度和方法的耐用性均符合要求，证明该方法适合用于STS项目原料药(硫酸沙丁胺醇)的有关物质检测。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱对硫酸沙丁胺醇有关物质进行定性或定量检测，检测条件包括：

色谱柱：辛烷基键合硅胶柱，检测波长：210～400nm，流动相包括流动相A、流动相B，流动相A：含缓冲液的水相，pH为1.5～4.0，进一步的，pH为2.0～3.0；流动相B:主要包括甲醇或乙腈；流动相采用如下梯度洗脱程序：

检测步骤包括：

(1)制备供试品溶液、对照品溶液；

(2)分别将供试品溶液、对照品溶液进样检测。

2.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相采用如下梯度洗脱程序：

3.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A还含有三乙胺或己胺，进一步选自三乙胺，三乙胺体积浓度为0.05％～0.2％，更进一步为0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述缓冲液是磷酸盐-磷酸缓冲液；进一步地，磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠的一种或多种的混合物；更进一步地，所述缓冲液中，磷酸氢二铵浓度为10mmol/L～30mmol/L，优选为20mmol/l。

5.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B:主要包括甲醇。

6.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱长度为100～150mm，优选为150mm；内径为3.0～4.6mm，优选为4.6mm；填料的粒径为2.7～3.5μm，优选为2.7μm。

7.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测条件还包括流速，所述流速为0.5ml/min～1.0ml/min，优选为0.6ml/min。

8.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测条件还包括柱温，所述柱温：28～32℃，进一步选自30℃。

9.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述制备供试品溶液、对照品溶液的溶剂选自甲醇、乙腈、水的一种或多种混合物，进一步选自甲醇和水的混合物；更进一步地，甲醇和水的混合物中甲醇体积百分比为10％～50％，优选为30％。

10.根据权利要求1所述的一种硫酸沙丁胺醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测波长：210～230nm，进一步的，检测波长：218～222nm，优选为220nm。