CN108499620A - 一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，该方法应用纳米压印技术制作间接操控粒子链接微纳粒子，应用光纤聚焦间接操控粒子，实现间接操控粒子的俘获，进而控制微纳粒子三维移动和空间转动。所述间接操控粒子包括抓手、与抓手链接的微杆、链接微杆和微纳粒子的微盘；所述抓手与光纤光斑模式匹配，位于光纤光斑的暗点，能够通过光纤光斑实现对抓手的俘获。本发明具有操控便利、自由度高、可集成化、对被操控粒子无激光创伤的特点。

Description

一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法
技术领域
本发明涉及一种生物间接操控的方法，尤其涉及一种基于NIL(Nanoimprintlithograthy)纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法。
背景技术
在过去的十年中，微纳米尺度的生物对象(biological object)的微操控(micromanipulation)已成为生物纳米技术领域的一个重要课题。根据应用过程的复杂性和规模，微操控包括三维空间的俘获，平移/旋转，收集或分离，活细胞手术/微注入等一系列日益精细化的操控。在尺度上，已经更多从细胞层面进入亚细胞过程的操控。在几个相互竞争的3D微操控技术中(包括电泳，磁力，机械等)，显微光镊技术作为几乎无创(non-invasive)的一种方法，突出优点是可以在绝大部分细胞和亚细胞组分的尺度范围里施加可调节的10-14-10-8N的控制力，用于实现微操控过程。使用光镊对生物对象操控目前分为直接和间接操控(即激光是否直接作用于生物对象)。鉴于实施过程的简单性，至今为止的大部分光镊相关工作是直接操控。虽然已经证明其在生物测定与亚纳米精度位移的适用性，并能够实现相当多细胞的微操控，但使用时面临的主要问题之一是活细胞捕获中的光损伤。在这过程中，功率为数十mW至数百mW的聚集激光束直接作用于生物对象，实现各种空间运动。然而，很快发现直接捕获和操控对活细胞或细胞组分可导致相当严重的光损伤，其损伤机制包括光化学反应，局部加热，双光子吸收和光敏剂激发的单态氧。同时，研究证实：细胞的光损阈值其实是非常低的，在直接光镊俘获和操控中，即使降低激光功率也不能有效解决光损伤问题。所有这些研究结果表明：在未来的生物工程中，应该尽可能避免使用直接的激光束进行细胞捕获或微操控，以消除激光对生物对象的不良影响。同时，工程中越来越多需要的DNA层面的微操控，由于DNA链太细(1.8-2.6nm，远小于聚集光束衍射极限束腰直径可直接俘获的粒子直径，约数百纳米至数十微米)，不能使用简单的直接操控，几乎所有的DNA工作都涉及间接操控。由此，细胞和亚细胞对象的间接微操控(indirectmicromanipulation)将成为生物工程中一个极为重要的工具和研究课题。
在不受激光直接光照影响情况下，间接微操控完成生物对象的定位、运输、分选等过程控制，在医学研究上可以通过这些过程研究诊断，治疗，药物传递，将使从不同学科的研究人员在活细胞和亚细胞尺度进行基础和应用研究，从而进行高度准确的细胞和药物相互作用判别，开发新药物和新诊断方法，在非常早期阶段检测到致命疾病的发病，是具有重大创新意义的基础研究工作，并且有巨大的生物医学应用价值和市场潜力。
在间接微操控方面，近年来国际上投入大量资源对这一课题进行研究。为了实现间接操控生物对象，光镊被取而代之的用来捕捉电介质微球(如乳胶，聚苯乙烯，二氧化硅等)，并由这些微球连接到生物对象的两端或边界面上，用以驱动生物对象的各种空间运动。与磁力或电泳操控技术不同，光镊可以通过同时使用数个激光光束实现多个操控而不相互干扰，此特点给间接微操控提供了很好的条件，同时空间光调制器(SLM，spatiallight modulator)的出现，使计算机实现可编程同时控制多个微球协调运动，以环绕生物对象并推动其运动。
间接操控中使用微球已有一定的历史，但因微球具有完美的对称性，导致只有3个运动自由度。相比核酸和运动蛋白等亚细胞组分，细胞具有不规则多样性形态表现，大小差距和物理性能不同，使得抓手(微球)的配置取决于待抓对象和将被操纵对象的过程所决定，虽然在很多情况下，粒径范围在1-2.5μm内的选择，在某些情况下，小珠的直径使用75nm左右的，而在其他情况下，也有用10μm大直径的珠。微球与生物对象分子连接常用生物素-链霉亲和素，地高辛抗-地高辛(Biotin-streptavidin，digoxigenin-antidigoxigenin)得以实现，通常可使得间接粒子与生物对象的链接几率提高数倍。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，应用纳米压印技术制作间接操控粒子链接微纳粒子，应用光纤聚焦间接操控粒子，实现间接操控粒子的俘获，进而控制微纳粒子三维移动和空间转动。
进一步地，所述纳米压印技术具体为：在衬底上制作间接操控粒子发的模版；在待加工材料表面涂上光刻胶，然后将模版压在其表面，采用加压的方式使图案转移到光刻胶上；用紫外光使光刻胶固化，移开模板后，用刻蚀液将光刻胶刻蚀掉，露出待加工材料表面，然后使用化学刻蚀的方法进行加工，完成后去除全部光刻胶，最终得到间接操控粒子。
进一步地，所述间接操控粒子包括抓手、与抓手链接的微杆、链接微杆和微纳粒子的微盘；所述抓手与光纤光斑模式匹配，位于光纤光斑的暗点，能够通过光纤光斑实现对抓手的俘获。
进一步地，所述光纤采用LP21模式，所述间接操控粒子的抓手为十字形，在四个端点处均设置圆柱形卡角。
进一步地，所述光纤采用LP31模式，所述间接操控粒子的抓手为王字形，在每个端点处均设置圆柱形卡角。
进一步地，所述微盘的表面具有生物镀层，通过生物镀层与微纳粒子链接；所述生物镀层采用链霉亲和素streptavidin涂层或聚乙二醇二胺涂层实现。
进一步地，所述链霉亲和素涂层：采用硝酸铈(IV)+铵+硝酸浸泡微盘，创建-OH根，再由APTES引入-NH2，最后生物素孵育后与链霉亲和素结合。
进一步地，所述链霉亲和素涂层：由APTES浸泡微盘并引入-NH2，生物素孵育后与链霉亲和素结合。
进一步地，应用光纤聚焦间接操控粒子的过程在HEPES缓冲液中进行。
进一步地，通过改变光纤的三维位置，实现微纳粒子三维移动，通过旋转光纤的角度，实现微纳粒子的空间转动。
本发明的有益效果是：
1.本发明具有间接操控微粒更高运动自由度的特点。
2.本发明具有商品化小型化的潜力，可与微流控芯片相结合实现Lab-on-a-chip集成。
3.本发明具有间接微纳粒子形状一致性和配置多样化，可根据操控过程和任务指定，不再局限与微球单一几何形状，有效实现对不同形态的生物对象的微操控。
4.本发明采用间接操控，对被操控粒子无激光创伤。
附图说明
图1(a)为结合光纤LP21模式的间接操控粒子一个角度的模型图；
图1(b)为结合光纤LP21模式的间接操控粒子另一个角度的模型图；
图2(a)为结合光纤LP31模式的间接操控粒子一个角度的模型图；
图2(b)为结合光纤LP31模式的间接操控粒子另一个角度的模型图；
图中，光纤光斑1、被操控微纳粒子2、微盘3、抓手4。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的工作原理如下：
1.米氏粒子在光阱中受力分析：
对于非吸收介质，根据能量守恒和动量守恒，可以得到：
所以可得
同理可得纵向力的微分形式：
其中αi是光线在入射电介质微粒表面的入射角，αr是折射角，θ是单位面元法线与z轴夹角，θ0为新光轴与光线夹角，θm为积分上限，n1是小球折射率，n2是周围介质折射率，R为反射系数，T为透射系数，其中T＝1-R。
2.高斯光束特性
基膜高斯光束形式为：
基于上述原理，可采用LP21光纤光学，其四斑模型中粒子往两边移动都会受到光作用产生一个复位的合力实现操控。
3.间接操控
间接操控微粒由高聚物制备，间接操控粒子具备一个多点中心，由光束光阱控制该中心，而结构延伸出各种探针形状与生物对象链接，间接操控粒子在注入微流道前使用前述亲和素(如streptavidin)进行表面处理，使其探针可以高几率与生物对象粘连结合。
具体来说，本发明提供的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，应用纳米压印技术制作间接操控粒子链接微纳粒子，应用光纤聚焦间接操控粒子，实现间接操控粒子的俘获，进而控制微纳粒子三维移动和空间转动。
进一步地，所述纳米压印技术具体为：采用电子束刻蚀等手段，在硅或其他衬底上加工出间接操控粒子发的模版；在待加工材料表面涂上光刻胶，然后将模版压在其表面，采用加压的方式使图案转移到光刻胶上；用紫外光使光刻胶固化，移开模板后，用刻蚀液将光刻胶刻蚀掉，露出待加工材料表面，然后使用化学刻蚀的方法进行加工，完成后去除全部光刻胶，最终得到间接操控粒子。
进一步地，所述间接操控粒子包括抓手、与抓手链接的微杆、链接微杆和微纳粒子的微盘；所述抓手与光纤光斑模式匹配，位于光纤光斑的暗点，能够通过光纤光斑实现对抓手的俘获。
进一步地，所述光纤采用LP21模式，所述间接操控粒子的抓手为十字形，在四个端点处均设置圆柱形卡角。
进一步地，所述光纤采用LP31模式，所述间接操控粒子的抓手为王字形，在每个端点处设置圆柱形卡角。
进一步地，所述微盘的表面具有生物镀层，通过生物镀层与微纳粒子链接；所述生物镀层采用链霉亲和素streptavidin涂层或聚乙二醇二胺涂层实现。
进一步地，所述链霉亲和素涂层：采用硝酸铈(IV)+铵+硝酸浸泡微盘，创建-OH根，再由APTES引入-NH2，最后生物素孵育后与链霉亲和素结合。
进一步地，所述链霉亲和素涂层：由APTES浸泡微盘并引入-NH2，生物素孵育后与链霉亲和素结合。
进一步地，应用光纤聚焦间接操控粒子的过程在HEPES缓冲液中进行。
进一步地，通过改变光纤的三维位置，实现微纳粒子三维移动，通过旋转光纤的角度(在LP21模式下)，实现微纳粒子的空间转动。
如图1、2所示，本发明为实现上述方法，提供了两种间接操控粒子的模型图。图1中光纤光斑1为光纤LP21模式四瓣光斑，抓手4为四爪抓手结构，采用四爪抓手与LP21模式的四瓣光斑相结合，有效的进行旋转移动等操控。图2中光纤光斑1为光纤LP31模式六瓣光斑，抓手4为六爪抓手结构，六爪抓手可提供更强力的抓力，并可与六瓣光模式结合进行操控。
该方法的一个实施例的实现过程如下：
步骤1：根据光纤模式设计间接操控粒子模型，在衬底上加工出间接操控粒子模板。
步骤2：在待加工操控粒子的材料表面涂上光刻胶，然后将模板压在其表面，采用加压的方式使图案转移到光刻胶上。用紫外光使光刻胶固化，移开模板后，用刻蚀液将光刻胶刻蚀掉，露出待加工材料表面，然后使用化学刻蚀的方法进行加工，完成后去除全部光刻胶，得到高精度加工的间接操控粒子材料。
步骤3：采用硝酸铈(IV)+铵+硝酸浸泡高聚物间接操控粒子微盘，创建-OH根，再由APTES引入-NH2，最后生物素孵育后与链霉亲和素结合。
步骤4：将间接操控粒子和待操控微纳粒子置入HEPES缓冲液中，应用光纤光束聚焦间接操控粒子，实现对微纳粒子的操控。

Claims (10)

1.一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，应用纳米压印技术制作间接操控粒子链接微纳粒子，应用光纤聚焦间接操控粒子，实现间接操控粒子的俘获，进而控制微纳粒子三维移动和空间转动。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述纳米压印技术具体为：在衬底上制作间接操控粒子发的模版；在待加工材料表面涂上光刻胶，然后将模版压在其表面，采用加压的方式使图案转移到光刻胶上；用紫外光使光刻胶固化，移开模板后，用刻蚀液将光刻胶刻蚀掉，露出待加工材料表面，然后使用化学刻蚀的方法进行加工，完成后去除全部光刻胶，最终得到间接操控粒子。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述间接操控粒子包括抓手、与抓手链接的微杆、链接微杆和微纳粒子的微盘；所述抓手与光纤光斑模式匹配，位于光纤光斑的暗点，能够通过光纤光斑实现对抓手的俘获。
4.根据权利要求3所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述光纤采用LP21模式，所述间接操控粒子的抓手为十字形，在四个端点处均设置圆柱形卡角。
5.根据权利要求3所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述光纤采用LP31模式，所述间接操控粒子的抓手为王字形，在每个端点处均设置圆柱形卡角。
6.根据权利要求3所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述微盘的表面具有生物镀层，通过生物镀层与微纳粒子链接；所述生物镀层采用链霉亲和素streptavidin涂层或聚乙二醇二胺涂层实现。
7.根据权利要求6所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述链霉亲和素涂层：采用硝酸铈(IV)+铵+硝酸浸泡微盘，创建-OH根，再由APTES引入-NH2，最后生物素孵育后与链霉亲和素结合。
8.根据权利要求6所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，所述链霉亲和素涂层：由APTES浸泡微盘并引入-NH2，生物素孵育后与链霉亲和素结合。
9.根据权利要求1所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，应用光纤聚焦间接操控粒子的过程在HEPES缓冲液中进行。
10.根据权利要求1所述的一种基于纳米压印技术间接操控微纳粒子的方法，其特征在于，通过改变光纤的三维位置，实现微纳粒子三维移动，通过旋转光纤的角度，实现微纳粒子的空间转动。
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