CN108362651B - 一种便携式无透镜多光谱显微成像系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种便携式无透镜多光谱显微成像系统和方法，系统包括沿光路依次布置的光源照明模块、移动载物台和图像传感器，所述光源照明模块包括多个不同中心波长的发光元件、合色棱镜以及出射孔，多个发光元件的出射光从不同入射方向进入合色棱镜后出射，再经由出射孔至所述移动载物台；在移动载物台和图像传感器之间还设有标定板，该标定板带有标定图案以及透明区；所述图像传感器用于获取标定图案的图像数据以校准发光元件的波长，还用于经由透明区获取移动载物台上待检样品的图像数据。本发明便携式多光谱无透镜显微成像系统，结构简单、省去成像透镜和精密光谱器件，适用于野外条件下便携地进行生物组织和细胞检测。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像领域，尤其涉及一种采用无透镜多光谱显微成像系统和方法。
背景技术
常用的检测手段之一就是利用生物显微镜对采集到的生化样品进行直观的检测。现有的显微镜大多基于显微物镜的光学显微镜结构，低倍率的光学显微镜相对来说价格低廉，但是分辨率有限，通常为2um；高倍率的光学显微镜能够达到300nm的光学分辨率，例如相衬显微镜、微分干涉相衬显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜，促进了生命科学研究水平的提高，以更高的分辨率和成像质量为疾病诊断，尤其是重大恶性疾病的早期诊断提供了有力的影像学依据，但是通常价格高昂，且体积较大、较为笨重，不利于在野外使用。
随着时代的发展，移动医疗和环保领域的野外生化检测对便携式生化检测和数据分析的设备的需求越来越大。实现显微设备的体积小型化、成本低廉化、操作简便化，必然能够大大降低医疗检测的门槛，为资源条件有限的地区的医疗检测、农业和环境保护领域的野外实时生化检测提供便利和实时精准测量。
近年来，为了追求简化照明与成像光路，抛弃昂贵笨重的光学镜头及光路结构的目标，无透镜显微成像的技术得到长足发展。无透镜显微成像技术能够大大降低显微镜的成本，同时为整体系统的小型化、轻量化提供更多可能性。
发明内容
本发明提供了一种便携式多光谱无透镜显微成像系统，结构简单、省去成像透镜和精密光谱器件，适用于野外条件下便携地进行生物组织和细胞检测。
本发明一种便携式无透镜多光谱显微成像系统，包括沿光路依次布置的光源照明模块、移动载物台和图像传感器，所述光源照明模块包括多个不同中心波长的发光元件、合色棱镜以及出射孔，多个发光元件的出射光从不同入射方向进入合色棱镜后出射，再经由出射孔至所述移动载物台；
在移动载物台和图像传感器之间还设有标定板，该标定板带有标定图案以及透明区；所述图像传感器用于获取标定图案的图像数据以校准发光元件的波长，还用于经由透明区获取移动载物台上待检样品的图像数据。
为了固定以及安装各部件，本发明的显微成像系统还可以设置支架或外壳，优选设有封闭的外壳，在外壳上、与移动载物台相应的部位处设置有样品取放口。
作为优选，所述移动载物台包括：
载物板，该载物板上设有透明或镂空形式的样品放置区；
调节机构，用于驱动所述载物板改变与图像传感器之间的距离。
使用状态下光源照明模块位于载物板下方，光线依次经由样品放置区和标定板，向上入射至图像传感器。
作为优选，所述调节机构包括螺纹配合的固定丝杠和调节螺母；
其中固定丝杠沿光线入射至图像传感器的方向布置有至少两根，载物板活动的穿设在各固定丝杠上，调节螺母承托在载物板的下方。
作为优选，所有调节螺母通过联动机构同步转动，还设有驱动调节螺母旋转的电机。
通过电机以及联动机构可实现自动控制并调节载物板高度，联动机构可采用齿轮传动或同步带等形式，电机优选精度较高的伺服电机。当然在简化结构的情况下，也可直接采用手工方式调节。
为优选，所述调节机构包括螺纹配合内、外套筒，内、外套筒的中心区域为光路通道，内、外套筒中一者为固定安装，另一者的轴向端面承托在载物板的下方。
内、外套筒相对转动时，活动的一者可沿内、外套筒轴向运动实现载物板的升降。
作为优选，还设有抵紧弹簧，抵紧弹簧的两端中：
一端为固定端，另一端为载物板顶面相抵的施力端。
固定端可连接至壳体内壁，施力端抵紧载物板可防止其晃动，保证精度，在调节螺母或活动套筒下降时，也起到辅助驱动的作用。
内、外套筒中活动的一者也可通过电机以及相应的传动机构，实现直供运行。当然在简化结构的情况下，也可直接采用手工方式调节。
载物板可采用中间镂空的薄铝板。中间镂空部位作为样品放置区，在实际使用时，可使用通用型标准生物样品盖玻片，(尺寸为75mm*25mm*1mm)放置在薄铝板上。
所述发光元件为LED。LED数量根据要光谱数量设置，例如4～10个，优选6～8个，各LED的中心波长均不相同，可提供不同光谱波长的照明条件。例如LED数量为8个，中心波长分别为：
420nm，445nm，460nm，470nm，520nm，590nm，620nm和660nm。
各LED的中心带宽为20nm，功率为3W。
合色棱镜为能够将来自不同入射方向的多个光谱的光在某一个共同的面出射。合色棱镜中两个对角面的光谱选择特性分别为：一个对角面上薄膜对400nm-480nm的光具有反射性，而480nm-790nm的光具有透射性；另一个对角面上的薄膜对波长为400nm-610nm的波段的光具有透过性，而对波长为610nm-790nm波段的光具有反射性。
在合色棱镜的出射端面的中心有一个75um的出射孔。
具体布置例如：
合色棱镜的左端为蓝光波段的LED，即中心波长分别为420nm、445nm、460nm和470nm的LED；
合色棱镜的底端为绿光LED，即中心波长分别为520nm和590nm的LED；
合色棱镜的右端为红光波段的LED，即中心波长分别为620nm和660nm。
图像传感器(例如普通的商用裸板型的CMOS图像传感器)与标定板之间，预先固定连接，即相对距离是已知并确定的，连接方式可以采用粘结或连接件等方式。
标定板可采用玻璃平板，标定图案可以为任意的图形，图形中的线宽为2um-10um之间，图形中不含有周期性变化的图案，利用光刻等技术将该标定案曝光在一个玻璃平板上，有标定图案的区域对光线完全反射，没有标定图案的区域即为透明区。
本发明采用成本较低的LED光源，但其中心光的波长值，具有随温度变化而偏移的特性，因此需要进行监控，现有的思路就是使用一个光谱仪监控，但光谱仪昂贵且不利于便携式设备的简约化。本发明采用标定板通过相应的计算可得到相对准确的中心波长。
作为优选，所述标定图案的面积占图像传感器面积的1/100到1/4。
总体而言，待检样品的图像数据图像传感器的绝大多数区域；标定图案只占很小一部分，但通常分辨率不低于64*64个像素(像素尺寸为CMOS像素单元尺寸，例如单个像素尺寸为1.67um)。标定图案布置在相对集中的某一区域，该区域正对于CMOS传感器的某一侧。
作为优选，还设有控制模块，用于接收和处理来自所述图像传感器的图像数据，经计算获得样品显微图像。
作为优选，还设有图像显示模块，用于接收和显示来自所述控制模块的样品显微图像。
控制模块可以采用具有相应数据处理能力的计算机等形式，例如嵌入式控制模块等。
控制模块本身既可以通过数据接口以外接的方式布置，也可以设置在壳体内部。
光源照明模块中的各发光元件以及移动载物中的调节机构都可以接入并受控于所述控制模块。
图像显示模块既可以通过数据接口以外接的方式布置，也可是嵌装在壳体上。
为了实现对图像数据的处理，所述控制模块包括处理器和存储器，存储器中配置有以下指令模块供处理器调用运行：
第一模块，用于读取不同发光元件工作状态下的待检样品以及标定图案的图像数据；
第二模块，用于根据标定图案的图像数据，校准当前发光元件的波长；
第三模块，用于在待检样品与图像传感器在多个不同距离上，分别读取待检样品的图像数据；
第四模块，用于根据校准后的波长，利用不同距离上待检样品的图像数据计算得到待检样品的重构光场，即得到样品显微图像。
本发明还提供一种便携式无透镜多光谱显微成像方法，基于本发明的便携式无透镜多光谱显微成像方法实现。
一种便携式无透镜多光谱显微成像方法，包括：
读取不同发光元件工作状态下的待检样品以及标定图案的图像数据；
根据标定图案的图像数据，校准当前发光元件的波长；
在待检样品与图像传感器多个不同距离上，分别获取待检样品的图像数据；
根据校准后的波长，利用不同距离上待检样品的图像数据计算得到待检样品的重构光场，即得到样品显微图像。
本发明成像系统硬件结构简单，便于携带，通过多个发光元件可实现多光谱图像的采集，另外采用成本较低的LED作为光源，结合波长校准的方式保证了精度。
附图说明
图1是本发明的便携式无透镜多光谱显微成像系统的装置示意图；
图2a是图像传感器与标定板部分的结构示意图；
图2b为标定板及其标定图案的结构示意图；
图3为中心波长为660nm的LED照明下，恢复得到的美国空军分辨率板(USAF1951)的样品显微图。
具体实施方式
如图1所示，本发明一种便携式无透镜多光谱显微成像系统包括：外壳1，外壳1中，在底部设置光源照明模块，具体包括LED2、合色棱镜3、75um的出射孔4。
LED2共有8个，其中中心波长为420nm，445nm，460nm和470nm的蓝光LED，以两行两列的方式排布在合色棱镜的左端；
中心波长为520nm和590nm的绿光LED，排布在合色棱镜的底端；
中心波长为620nm和660nm的LED排布在合色棱镜的右端。
合色棱镜的上端面为光的出射面，薄铝板的中心带有75um的出射孔4的紧贴着合色棱镜的光出射面。出射光经过出射孔4，由于出射孔4的衍射效应，可以将出射孔4视为二次衍射，发射球面波的点光源。
光源照明模块上方为移动载物台，具体包括中心镂空的载物板6(采用薄铝片形式)，壳体1内的顶部设有向下延伸的定位杆7，载物板6活动的穿过定位杆7，在定位杆7上套有抵紧弹簧向下抵压载物板6，载物板6下方设有调节机构，包括螺纹配合内套筒5A和外套筒5B，内套筒5A固定安装，外套筒5B旋转时可以顶升载物板6，定位杆可以防止载物板6随外套筒5B旋转。
载物板6上方设有图像传感器9(CMOS图像传感)图像传感器9，朝向载物板的一侧还固定有标定板8，结合图2a和图2b可见，图像传感器9与标定板8用胶水粘合固定，两者之间的距离为z，z为500um～1mm，标定板8左侧为透明区，右侧带有标定图案。标定图案的区域只占图像传感面积的1/100-1/4，并且正对于图像传感的相应一侧。
出射孔发出的光依次穿过内、外套筒的中空部分、载物板的镂空区、待检样品和标定板，最终在图像传感器上成像。
为了实现图像数据的处理，还可以外接控制模块，以下通过流程方式描述本发明的便携式无透镜多光谱显微成像方法，在控制模块中可配置相应的指令模块，以软件方式进行计算和数据处理。
本发明的便携式无透镜多光谱显微成像方法包括：
(1)控制模块能够同步控制LED和图像传感器，当某一个LED点亮时，图像传感器会同步记录下此时的图像数据(以下称为全息图)，全息图包含两部分信息，一部分为待检样品的全息图I1，一部分为标定图案的全息图M。
(2)利用全息自聚焦算法，通过全息图M和公式(1)标定此时照明光的最优化波长λ0，即校准后的波长。
全息自聚焦标定距离的算法原理为，通常在平面光波照射下，光场从物平面u(x0,y0；0)传播到探测平面u(x,y；z)满足方程式(1)。
u(x,y；z)＝∫∫u(xo,yo；0)h(x-xo,y-yo；z)dxodyo (1)
式中，h(x-x0,y-y0；z)为菲涅尔传播核函数。
由于图像传感器与标定板两者之间的距离为z为标定好的已知值，则可求出作为未知量的波长λ0。
具体步骤包括：
(2-1)预估λ的范围，例如400nm-780nm。
(2-2)利用黄金分割选择法，在预估范围内选择50～500个λ值，针对每一λ值将图像传感器上的强度图像的强度根号值
反传播-z的距离，得到物平面上的伪复振幅分布U(x，y；0)。
此步骤中图像传感器上的强度图像即为全息图M，I(x,y；z)为全息图M中各点的强度值，z为标定板与图像传感器的距离。
本实施例在预估范围内选择50个λ值，数量越多精度越好，但相应的计算量增大，将
反传播-z的距离，从而就回到了物体本身所在的物平面上，得到物平面上的伪复振幅分布U(x，y；0)。称它为伪复振幅是因为单幅强度全息图获得的复振幅分布具有“孪生像”。
(2-3)计算每一λ值下伪复振幅分布的模值的导数的Gini系数(Gini ofGradient，以下简称GoG)，当GoG为最小时，选取对应的λ1；
在预估范围下限至λ1范围(除λ1以外)内确定GoG最小时对应的λ2；
在λ1至预估范围上限范围(除λ1以外)内确定GoG最小时对应的λ3。
(2-4)将(λ2，λ3)设为最新的λ的范围，重复步骤(2-2)和步骤(2-3)直到λ3-λ2<1nm，此时的λ1值即为校准后的波长λ0。
(3)利用待检样品的全息图I1和公式(1)计算待检样品与图像传感器之间的距离zc。
计算距离依旧是利用全息自聚焦算法，原理为通常在平面光波照射下，光场从物平面u(x0,y0；0)传播到探测平面u(x,y；z)满足方程式(1)，式中，h(x-x0,y-y0；z)为菲涅尔传播核函数。
u(x,y；z)＝∫∫u(xo,yo；0)h(x-xo,y-yo；z)dxodyo (1)
令光场从初始物平面传播到图像传感器探测平面的传播的“光程”为z，将图像传感器探测到的光场复振幅的强度值逆向传播，从而就回到了物体本身所在的物平面上，得到物平面上的伪复振幅分布，称它为伪复振幅是因为单幅强度全息图获得的复振幅分布具有“孪生像”。
具体步骤包括：
(3-1)预估z的范围，可依据已知的设备部件尺寸、历史数据、辅助刻度等方式，例如0-1.5mm。
(3-2)利用黄金分割选择法，在预估范围内选择50～500个z值，针对每一z值将图像传感器上的强度图像的根号值
逆向传播-z的距离，得到物平面上的伪复振幅分布u(x,y；0)。
此步骤中图像传感器上的强度图像即为全息图I1，I(x,y；z)为全息图I1中各点的强度值，z为待检样品与图像传感器的距离。
本实施例在预估范围内选择50个z值，数量越多精度越好，但相应的计算量增大。
(3-3)计算每一z值下伪复振幅分布的模值的导数的Gini系数(Gini ofGradient，以下简称GoG)，当GoG为最小时，选取对应的z1；
在预估范围下限至z1范围(除z1以外)内，例如(0～z1)，找到GoG最小时对应的zzuo；
在z1至预估范围上限范围(除z1以外)内，例如(z1～1.5mm)，找到GoG最小时对应的zyou。
(3-4)将(zzuo～zyou)设为最新的z的范围，重复步骤(3-2)和步骤(3-3)，直到zyou-zzuo≤1um，此时的z1即待检样品与图像传感器之间的距离。
通过调节机构多次改变待检样品与图像传感器的距离，并在不同距离上分别采集待检样品的全息图，以及通过步骤(3)的方式计算待检样品与图像传感器的距离。
每次改变时按照同一移动方向，逐渐减小待检样品与图像传感器的距离，每次改变的幅度为10um-50um。
每次改变距离后，仍采用步骤(3)的方式确定待检样品与图像传感器的距离。
(5)根据校准后的波长，利用不同距离上待检样品的全息图计算得到待检样品的重构光场，即得到样品显微图像。
假设标定得到的照明光波长为667nm，在该波长下依次移动待检样品，依次在五个位置上通过图像传感器获得相应的全息图分别为{I1，I2，I3，I4，I5}，对应的待检样品到传感器的距离为{Z1，Z2，Z3，Z4，Z5}，
在待检样品与图像传感器距离为Z1时，此时图像传感器可视为第一测量平面，在图像传感器处获得的全息图I1的合成复振幅U1；待检样品在其余位置的情况以此类推。
基于以上数据恢复待检样品的清晰显微图像的步骤为：
(5-1)计算待检样品在第一位置处相应全息图I1的合成复振幅U1，其中
(5-2)计算待检样品在下一位置处相应全息图I2的合成复振幅估计值U'2；
将合成复振幅U1传输到第二测量平面从而得到其合成复振幅估计值
计算方式为：
式中d为Z2-Z1，即待检样品两次位置的间距；
λ为校准后的波长；
j为虚数单位。
(5-3)根据合成复振幅估计值U'2计算对应的合成复振幅U2；
具体为利用
对复振幅估计值的振幅U'2表达式中的(|U'2|)进行替换，即
(5-4)依照步骤(5-2)和步骤(5-3)的原理，依次计算待检样品在其余各位置处，相应全息图的合成复振幅；直至获得最后一位置处相应全息图的合成复振幅
(5-5)将最后一位置处相应全息图的复振幅U5逆运算传至目标平面，从而得到目标(待检样品)的重构光场U0。
(5-6)依照步骤(5-2)将的原理，利用所述重构光场U0计算待检样品在第一位置处相应全息图I1的合成复振幅估计值
(5-7)重复步骤(5-1)-(5-6)，直至式(2)达到所需的精度。
所需的精度可根据需要设定，例如MSE小于10-3，此时对应的重构光场U0，即为当前校准波长下，待检样品的清晰的显微图。
重复进行(5-1)时，按照步骤(5-3)的原理，通过上一次循环时(5-6)得到的U1'获得下一次循环的时(5-1)中的U1。
(6)开启不同的LED并重复步骤(1)～步骤(5)，即可得到多光谱的样品的显微图。
参见图3，利用本发明成像系统，在中心波长为660nm的LED照明下，恢复得到的美国空军分辨率板(USAF1951)的样品显微图，表明本发明的成像分辨率优于1um。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是本发明并非局限于此，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。显然这些改动和变型均应属于本发明要求的保护范围保护内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何特殊限制。
Claims (8)
1.一种便携式无透镜多光谱显微成像方法，其特征在于，包括：
读取不同发光元件工作状态下的待检样品以及标定图案的图像数据；
根据标定图案的图像数据，校准当前发光元件的波长；
在待检样品与图像传感器多个不同距离上，分别获取待检样品的图像数据，所述待检样品与图像传感器之间的距离zc，包括：
(1)预估z的范围；
(2)利用黄金分割选择法，在预估范围内选择50～500个z值；
(3)计算每一z值下伪复振幅分布的模值的导数的Gini系数，当GoG为最小时，选取对应的z1；
在预估范围下限至z1范围内，除z1以外，找到GoG最小时对应的zzuo；
在z1至预估范围上限范围内，除z1以外，找到GoG最小时对应的zyou；
(4)将zzuo～zyou设为最新的z的范围，重复步骤(2)和步骤(3)，直到zyou-zzuo≤1um，此时的z1即待检样品与图像传感器之间的距离zc；
根据校准后的波长，利用不同距离上待检样品的图像数据计算得到待检样品的重构光场，即得到样品显微图像。
2.一种便携式无透镜多光谱显微成像系统，用于实施权利要求1所述的便携式无透镜多光谱显微成像方法，所述便携式无透镜多光谱显微成像系统包括沿光路依次布置的光源照明模块、移动载物台和图像传感器，其特征在于，所述光源照明模块包括多个不同中心波长的发光元件、合色棱镜以及出射孔，多个发光元件的出射光从不同入射方向进入合色棱镜后出射，再经由出射孔至所述移动载物台；
在移动载物台和图像传感器之间还设有标定板，该标定板带有标定图案以及透明区；所述图像传感器用于获取标定图案的图像数据以校准发光元件的波长，还用于经由透明区获取移动载物台上待检样品的图像数据；
所述移动载物台包括：
载物板，该载物板上设有透明或镂空形式的样品放置区；
调节机构，用于驱动所述载物板改变与图像传感器之间的距离。
3.如权利要求2所述的便携式无透镜多光谱显微成像系统，其特征在于，所述调节机构包括螺纹配合的固定丝杠和调节螺母；
其中固定丝杠沿光线入射至图像传感器的方向布置有至少两根，载物板活动的穿设在各固定丝杠上，调节螺母承托在载物板的下方。
4.如权利要求2所述的便携式无透镜多光谱显微成像系统，其特征在于，所述调节机构包括螺纹配合内、外套筒，内、外套筒的中心区域为光路通道，内、外套筒中一者为固定安装，另一者的轴向端面承托在载物板的下方。
5.如权利要求2所述的便携式无透镜多光谱显微成像系统，其特征在于，所述发光元件为LED。
6.如权利要求2所述的便携式无透镜多光谱显微成像系统，其特征在于，还设有控制模块，用于接收和处理来自所述图像传感器的图像数据，经计算获得样品显微图像。
7.如权利要求6所述的便携式无透镜多光谱显微成像系统，其特征在于，还设有图像显示模块，用于接收和显示来自所述控制模块的样品显微图像。
8.如权利要求7所述的便携式无透镜多光谱显微成像系统，其特征在于，所述控制模块包括处理器和存储器，存储器中配置有以下指令模块供处理器调用运行：
第一模块，用于读取不同发光元件工作状态下的待检样品以及标定图案的图像数据；
第二模块，用于根据标定图案的图像数据，校准当前发光元件的波长；
第三模块，用于在待检样品与图像传感器在多个不同距离上，分别读取待检样品的图像数据，所述待检样品与图像传感器之间的距离zc，包括：
(1)预估z的范围；
(2)利用黄金分割选择法，在预估范围内选择50～500个z值；
(3)计算每一z值下伪复振幅分布的模值的导数的Gini系数，当GoG为最小时，选取对应的z1；
在预估范围下限至z1范围内，除z1以外，找到GoG最小时对应的zzuo；
在z1至预估范围上限范围内，除z1以外，找到GoG最小时对应的zyou；
(4)将zzuo～zyou设为最新的z的范围，重复步骤(2)和步骤(3)，直到zyou-zzuo≤1um，此时的z1即待检样品与图像传感器之间的距离zc；
第四模块，用于根据校准后的波长，利用不同距离上待检样品的图像数据计算得到待检样品的重构光场，即得到样品显微图像。
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