CN108192857A - 一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，属于医药技术领域。该方法是将去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和HCM心肌细胞培养液混合后培养iPSCs。本发明证实HCM心肌细胞培养液可有效诱导iPSCs心肌定向分化。qPCR结果表明β‑MHC、GATA‑4、Mef2C、NCX‑1等mRNA表达显著增加。

Description

一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是引起死亡最常见的疾病之一，且心肌细胞一旦损伤缺乏再生能力，体外诱导培养心肌细胞进行心脏移植已成为治疗心血管疾病重要的研究热点。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有多向分化的潜能,可分化为多种细胞。目前研究虽证实iPSCs体外可分化心肌细胞，但其自然分化效率不高。IPSCs分化为心肌细胞受多种因素调控，特别是细胞外微环境的变化。目前有关HCM心肌细胞培养液诱导干细胞分化的研究鲜有报道，且不同类型细胞对于相同的刺激因素表现不同的诱导效应。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法。

目前诱导iPSCs心肌定向分化的方法各异，本研究为了推进iPSCs的临床应用，旨在提供一种有效安全的诱导心肌分化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，包括如下步骤：通过将去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和HCM心肌细胞培养液混合后培养iPSCs，倒置显微镜、细胞免疫技术以及qPCR检测其心肌定向分化情况。实验证实不同浓度HCM分化培养液均可在第7天显著减少小鼠诱导性多能干细胞OCT-4表达，但对各心肌基因表达诱导作用不一，以1:1.5体积比的HCM分化培养液最佳。

所述的HCM心肌细胞培养液，是将HCM心肌细胞常规培养3d，传代前吸取培养液过滤即可。

优选的，所述的去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和HCM心肌细胞培养液的体积比为1：1～1:2；更优选为1:1.5。

优选的，所述的培养iPSCs的时间为10～14d。

本发明的机理是：本申请通过研究HCM心肌细胞培养液对诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)定向心肌分化的影响，以建立一种安全有效的体外诱导iPSCs分化为心肌细胞的实验方法，iPSCs作为心肌定向分化的理想细胞，具有广阔的应用前景，目前虽然诱导其心肌定向分化的方法很多，但仍未发现一种极为有效的诱导方法，造成其治疗效果受限。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明证实HCM心肌细胞培养液可有效诱导iPSCs心肌定向分化。qPCR结果表明β-MHC、GATA4、Mef2C、NCX-1等mRNA表达显著增加。

附图说明

图1是qPCR检测诱导性多能干细胞拟胚体中心肌特异性标志物的表达情况。

具体实施方式

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1制备iPSCs

1)滋养层(MEF)的制备：0.1％(体积分数)的明胶加入T25培养瓶，于37℃细胞培养箱静置20min后将其吸除，加入5～6mL预热37℃的MEF培养液，与此同时将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(购自上海中科院细胞库)从液氮中快速取出，置于37℃水浴中快速融解并立即用体积分数为75％的酒精擦拭冻存管后拿到超净台内，将冻存管内的细胞悬液转移至含MEF培养液的15mL离心管内，以1000rpm离心5min，弃上清液重悬后加入到T25培养瓶中，放置到CO2恒温培养箱中，培养24h后得到滋养层即可加入iPSCs；

2)iPSCs的培养以及传代：步骤(1)中培养24h后得到的滋养层，4倍显微镜下可见已经均匀铺满T25培养瓶，此时可迅速从液氮中取出iPSCs(中科院上海生科院生化细胞所和中科院上海生科院生化细胞所干细胞平台提供)冻存管，复苏过程类似小鼠胚胎成纤维细胞，将复苏的iPSCs直接传入MEF铺板的T25培养瓶，置于37℃细胞培养箱，每日换液并且观察细胞集落形态的变化。待细胞集落长到合适大小及时传代，PBS(不含钙镁离子)轻轻冲洗一遍后加入0.25％(体积分数)胰酶(含EDTA)消化，小鼠iPSCs培养液终止消化，以1000rpm离心5min，弃上清加培养液吹打制备成单细胞悬液。

实施例2HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs分化

含15％FBS、50U/mL青霉素及10μg/mL链霉素的DMEM培养液重悬HCM心肌细胞后以适当细胞密度接种于T25培养瓶中培养，1～2d传代。将培养3d的传代前的培养液吸出，经0.22μm滤过膜过滤后，即诱导培养液，即HCM心肌细胞培养液，备用。

取生长对数期的iPSCs，以100×106cells/mL iPSCs悬滴培养48h后，接种于0.1％明胶预处理1小时的六孔板，将预先配制的去除LIF的常规iPSCs细胞培养液与HCM心肌细胞培养液按1:0、1：1、1:1.5、1:2比例混合配制成15％胎牛血清的分化培养液培养iPSCs。常规未处理的iPSCs作为对照组。

常规iPSCs细胞培养液：80％DMEM、15％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％非必须氨基酸、1％核苷、1000U/mL LIF、0.25％巯基乙醇、1％双抗。

实施例3qPCR检测iPSCs经诱导预处理后心肌特异性蛋白表达情况

按TRIZOL操作说明书抽提样品细胞的总RNA。取总RNA用反转录酶逆转录得到cDNA；于PCR仪上进行扩增，根据实时定量扩增曲线获取目的基因和内参基因的Ct值，以目的基因表达的相对定量值进行统计学分析，实验重复3次。

RT-PCR检测诱导性多能干细胞拟胚体中心肌特异性标志物mRNA表达情况，结果如图1所示，结果表明：相比对照组而言，GATA-4、Mef2c、β-MHC和NCX-1四个心肌特异性标志物中，预先配制的去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液与HCM心肌细胞培养液按1:0的体积比，仅能有效提高GATA-4和β-MHC的表达量；按1:1或1:2体积比诱导分化，GATA-4、β-MHC和NCX-1三个均可有效提高(P<0.05)；而按1:1.5比例配制，四个心肌特异标志物的表达量均有统计学意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，其特征在于包括如下步骤：将去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和HCM心肌细胞培养液混合后培养iPSCs；所述的HCM心肌细胞培养液，是将HCM心肌细胞常规培养3d，传代前吸取培养液过滤。

2.根据权利要求1所述的HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，其特征在于：所述的iPSCs细胞培养液和HCM心肌细胞培养液的体积比为1:1～1:2。

3.根据权利要求1或2所述的HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，其特征在于：所述的iPSCs细胞培养液和HCM心肌细胞培养液的体积比为1:1.5。

4.根据权利要求1所述的HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，其特征在于：所述的培养iPSCs的时间为10～14d。