CN108157676A - 重组胸腺素alpha原在功能饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
重组胸腺素alpha原在功能饲料中的应用,涉及功能饲料。所提供的ProTα新用途是ProTα在制备功能饲料达到改善养殖水水质条件的应用。所述重组胸腺素alpha原可在功能饲料中应用。所述胸腺素α原在功能饲料中的作用是通过降低水体亚硝酸盐、氨氮水平,提高水体溶解氧浓度机体,从而达到增强机体抗病力,提高存活率的效果。所述功能饲料包括水产养殖饲料等。所述重组胸腺素alpha原可在改善水产养殖水体水质中应用。所述胸腺素α原包括重组胸腺素α原和由组织分离纯化的胸腺素α原。
Description
技术领域
本发明涉及功能饲料,尤其是涉及重组胸腺素alpha原在功能饲料中的应用。
背景技术
近年来,沿海地区对虾养殖迅猛发展,随着养殖密度的加大以及养殖池塘的老化,养殖过程中亚硝酸盐含量偏高的问题凸显。如何有效预防亚硝酸盐过高是当今水产养殖的一个困难和挑战。亚硝酸盐作为一种代谢产物对动物具有明显的毒性。通过对虾呼吸作用,亚硝酸盐经鳃丝进入血液后,会使血液中运输氧气的血蓝蛋白载氧能力下降,引起组织缺氧,摄食减少,机体抗病力下降,严重时会导致对虾在池底蜕壳因亚硝酸盐中毒而亡。亚硝酸盐还可与仲胺类反应生成有强烈致癌症性的亚硝酸胺类物质。而且水体中溶解氧浓度越低,亚硝酸盐转化为无毒的硝酸盐速度越慢,造成危害越大。目前,养殖业处理亚硝酸盐浓度高的方法往往采用在水中添加增氧剂,比如目前常用的双氧水、过碳酸钠、过硼酸钠、过氧化钙等;还有包括如还原剂、螯合剂等化学产品,虽然它们能够迅速降低亚硝酸盐的浓度,但是往往造成水体环境条件发生剧烈变化,如果骤然降低水体中的亚硝酸盐浓度,对虾被迫急骤转变体内机制来适应另一种生活环境,这样短时间内连续启动两个应急机制,会对对虾的相关机体部位产生损害,轻者会抑制对虾生长,重者会引起对虾死亡。而且,大量化学物质的使用又增加了对环境的污染。因此,通过其他途径有效稳定降低水中亚硝酸盐,尤其通过改变动物肠道菌群的方法,有效调节代谢产物,从而达到改善水体环境的效果是为一个受欢迎的办法。
研究表明,具有抗氧化能力的成分对于提高肠道抗氧化能力,减少肠道炎症,改善肠道菌群具有重要作用。如花青素、低聚糖等。近年来有人将富含这些成分的物质作为饲料添加剂加入饲料来提高肠道抵抗力,调节肠道菌群,间接改善水体环境,达到增强动物抗病力,提高生存力,减少或不用抗生素,降低死亡率的目的。
胸腺素原α(prothymosinα)是一个小的酸性蛋白,相对分子质量12,000,最初由大鼠的胸腺分离得到。虽然胸腺素是由胸腺分泌的,但在体内许多组织都有胸腺素原α的表达,而且是不含内含子的一种保守的DNA序列。人ProTα由109个氨基酸残基组成,它对提高机体免疫力、抗机会感染以及促进淋巴细胞的成熟与分化,对IL-2和IL-2R的表达有一定的促进作用,甚至于发现它对肿瘤也有一定治疗作用。
Nrf2(NF-E2-related factor2)是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子,生理状态下它与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH—associated protein1)结合使活性处于相对抑制状态。在氧化应激源作用下,Nrf2与Keap1解偶连后与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)上GCTGAGTCA位点结合,启动ARE调控的第II相解毒酶及抗氧化酶基因表达,增加细胞对氧化应激的抗性。Nrf2-Keap1系统在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中有重要地位(1、Dinkova Kostova AT,Holtzclaw WD,Cole RN,et al.Direct evidence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensorsregulating induction of phase 2 enzymes that protect against carcinogens andoxidants.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(18):11908–11913;2、Zhang DD,Hannink M,Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1-dependentubiquitination of Nrf2 and for stabilization of nrf2 by chemopreventiveagents and oxidative stress[J].Mol Cell Biol,2003,23(22):8137–5151;3、GEOFFREYF.KELSO,CAROLYN M.PORTEOUS,GILLIAN HUGHES,ELIZABETH C.LEDGERWOOD,ALISONM.GANE,ROBIN A.J.SMITH AND MICHAEL P.MURPHY.Prevention of MitochondrialOxidative Damage Using Targeted Antioxidants.Annals of the New York Academyof Sciences.2002,959:263-274)。
ProTα能够与Nrf2-Keap1复合物中的Keap1相结合,使Nrf2从由Keap1抑制状态脱离出来,Nrf2与Keap1的解偶连。脱离了束缚的Nrf2在细胞核内,与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并与ARE结合,启动第II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录,提高细胞抗氧化应激能力。研究结果发现,ProTα与Nrf2-Keap1复合物中的Keap1结合是特异性的,突变的ProTα(MProTα)无法行使该功能。广泛存在的ProTα为细胞内恒定的抗氧化基因的基本水平的表达,以达到防止细胞被氧化损伤的目的发挥了重要作用。以上研究结果揭示了ProTα的另一个功能,即有利于氧化应激保护基因的表达。
近来研究发现,ProTα能够保护神经细胞在缺氧状态下引起的损失和细胞凋亡,证明ProTα能够有效保护逆境中细胞受损(4、HiroshiUeda,Review.Prothymosinplaysakeyroleincell -deathmode-switch,Anewconceptforneuroprotectivemechanismsinstroke,Naunyn-Schmiedeberg!sArchPharmacol(2008)377:315-323)。
中国专利CN200810072084.4公开一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物中的应用。
关于ProTα作为免疫增强剂用于抗病毒,抗真菌甚至抗肿瘤的报道均能够检索到,但是有关于外源ProTα能够通过口服途径,达到有效改善养殖水水质条件的报道和相关专利目前还未见到。
发明内容
本发明的目的在于提供重组胸腺素alpha原在功能饲料中的应用。
本发明所提供的ProTα新用途是ProTα在制备功能饲料达到改善养殖水水质条件的应用。
所述重组胸腺素alpha原可在功能饲料中应用。
所述胸腺素α原在功能饲料中的作用是通过降低水体亚硝酸盐、氨氮水平,提高水体溶解氧浓度机体,从而达到增强机体抗病力,提高存活率的效果。
所述功能饲料包括水产养殖饲料等。所述重组胸腺素alpha原可在改善水产养殖水体水质中应用。
所述胸腺素α原包括重组胸腺素α原和由组织分离纯化的胸腺素α原。
实验证明,ProTα能够显著改养殖水水质条件,通过对养殖水亚硝酸盐、氨氮、溶解氧等指标进行检测,同时计算对虾的存活率。结果证明,ProTα能够显著降低水中亚硝酸盐、氨氮水平,提高水体溶解氧水平,对虾生存率明显提高。
ProTα来源可以是动物来源,也可以是人来源,可以是基因工程表达,也可以是合成或动物组织中提取。
根据ProTα的基因序列,设计上下游引物P1和P2,P1引入BamHI酶切位点,P2引入EcoR I酶切位点。用RT-PCR方法从中国健康大学生外周血淋巴细胞中获得得前胸腺素α原全长基因cDNA,PCR产物纯化后与pMD18-T Vector连接,转化DH5α感受态细胞,对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列比对。用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物,将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中,获得重组质粒pGEX 6P-ProTα,转化大肠杆菌BL21,加入IPTG,诱导表达,菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解,离心取上清电泳,得GST-Proα融合蛋白。本发明在原先构建的pGEX 6P-ProTα基础上将pGEX-6p-1-ProTα中的融合蛋白中的PP酶切位点,改成EK酶切位点,因此分别重新合成ProTα上游引物和下游引物如下:
上游引物:5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA-3;
下游引物:3 pGEX Sequencing Primer(24bp):5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3。
经过PCR及酶切后将ProTα基因片断插入原核表达载体pGEX 6P-1中,再经过诱导表达获得融合蛋白,融合蛋白经过EK酶酶切将融合蛋白中的GST切除并经过一系列过柱纯化后获得本发明所使用的重组ProTα蛋白。
本发明所述重组蛋白为重组人前胸腺素α原,其经过上海生工生物技术有限公司测序其基因序列和相应蛋白氨基酸组成(参见中国专利ZL2013 10168184.8)。
本发明公开了胸腺素alpha原蛋白的新用途,通过实验证实,在水产饲料中添加胸腺素alpha原,制备水产功能饲料喂养南美白对虾,结果证明该功能饲料具备明显改善水产养殖中的水质条件,包括显著降低水中氨氮、亚硝酸盐水平,有效提高水体溶解氧浓度,从而达到提高水产动物抵抗力和存活率的效果。实验证实,胸腺素alpha原在制备水产功能饲料方面具有重要应用价值。
附图说明
图1为ProTα对养殖水溶解氧的影响(横坐标代表养殖周数,W 1:表示第1周;W 2、W3、W 4、W 5、W 6、W 7、W8分别代表不同养殖周数;纵坐标代表溶解氧浓度:4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0分别代表溶解氧浓度单位:mg/L)。
图2为代表空白对照组养殖水溶解氧的水平(横坐标代表养殖周数,W 1:表示第1周;W 2、W 3、W 4、W 5、W 6、W 7、W8分别代表不同养殖周数;纵坐标代表溶解氧浓度:4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0分别代表溶解氧浓度单位:mg/L)。
图3为代表ProTα对养殖水亚硝酸盐的影响(横坐标代表养殖周数,W 1:表示第1周;W 2、W 3、W 4、W 5、W 6、W 7、W8分别代表不同养殖周数;纵坐标代表亚硝酸盐浓度:0.5、1.0、1.5分别代表溶亚硝酸盐浓度单位:mg/L)。
图4为代表空白对照组养殖水亚硝酸盐的水平(横坐标代表养殖周数,W 1:表示第1周;W 2、W 3、W 4、W 5、W 6、W 7、W8分别代表不同养殖周数;纵坐标代表亚硝酸盐浓度:2、4、6、8分别代表溶亚硝酸盐浓度单位:mg/L)。
图5为代表ProTα实验组和空白组第四周每天养殖水亚硝酸盐的浓度(横坐标代表养殖周数,1:表示第1天;2~7分别代表不同养殖天数;纵坐标代表亚硝酸盐浓度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5分别代表溶亚硝酸盐浓度单位:mg/L)。
图6为代表前4周ProTα实验组和空白组每周养殖水亚硝酸盐的平均浓度比较(横坐标代表养殖周数,1~4分别代表不同养殖周数;纵坐标代表亚硝酸盐浓度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5分别代表溶亚硝酸盐浓度单位:mg/L)。
图7为代表实验组和对照组氨氮水平,1为实验组;2为对照组。比色卡数据0.2,0.4,0.6,0.9.1.2,1.5mg/L代表不同氨氮浓度与之配对的反应颜色。
图8为代表ProTα对养殖水浊度的影响(横坐标代表养殖周数,W 1:表示第1周;W2、W 3、W 4、W 5、W 6、W 7、W8、W9、W10、W11分别代表不同养殖周数;纵坐标代表水的浊度:10、20、30分别代表浊度度单位:cm)。
图9为代表空白组养殖水浊度水平(横坐标代表养殖周数,W 1:表示第1周;W 2、W3、W 4、W 5、W 6、W 7、W8、W9、W10、W11分别代表不同养殖周数;纵坐标代表水的浊度:10、20、30、40分别代表浊度度单位:cm)。
图10为代表ProTα实验组和空白组虾的存活数量比较图(横坐标代表养殖周数,1~8分别代表不同养殖周数;纵坐标代表对虾数量:10、20、30、40、50、60分别代表对虾数量单位:只)。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明所述的的重组蛋白单体由周克夫联合厦门伯赛基因转录有限公司制备。ProTα单体蛋白制备功能饲料方法主要采用通过按500g饲料添加3mg蛋白的配比充分搅拌后制备成功能饲料。按常规进行喂养。涉及提高对虾养殖水水质试验包括实验室和室外现场实验的实施,具体步骤如下:
选择2~3周龄的南美白对虾虾苗约600只,购自厦门翔安区赵厝虾苗场。分为6组,A-1,A-2,A-3;B-1,B-2,B-3组,每组虾苗50条左右。A组为实验组,喂养添加ProTα的功能饲料,三个重复;B组为空白对照组,喂养常规未添加ProTα的饲料。连续8周。
喂养2周后,测量水中溶解氧、亚硝酸盐、氨氮、浊度等指标。亚硝酸盐、检测用SEALAA3营养盐自动检测仪进行检测;氨氮采用厦门开普瑞生物科技有限公司的氨氮快速检测试剂盒进行检测;用溶解氧用检测仪器检测;浊度用浊度计检测。结果见图1~9。从图中看出,ProTα单体喂养对虾实验组水质指标明显比对照组好。结果如下:
(1)溶解氧通过连续检测8周,实验组每周溶解氧水平都在6mg/L以上;而空白对照组除1,5,6,8周在6mg/L左右,其余各周均在6mg/L一下,参见图1和2。
(2)亚硝酸盐水平,实验组亚硝酸盐水平比对照组显著降低,差异m极显著(P<0.01),连续7周的检测结果可以看出,实验组亚硝酸盐水均在1mg/L以下,而对照组除4,5,7周水平在1mg/L以下外,其余均超过1mg/L,最高可以超过6mg/L,见图3,图4.以第4周为例,一周亚硝酸盐水平变化,实验组均在0.5mg/L水平,而对照组均在0.5-2mg/L水平之上。见图5从前4周平均水平看,实验组亚硝酸盐都在1.5mg/L以下,而对照组1,2周在4mg/L以上,第3周在2mg/L以上,第4周才降低到2mg/L以上。见图6。
(3)氨氮水平从颜色反应可以看到,实验组比对照组颜色明显浅;差异极显著(P<0.01);见图7,其中1为实验组;2为对照组。
(4)浊度数据,从实验组见图8,空白组图9可以看出,实验组图8的浊度除第7周在5以上,1-6周均在5以下;而对照组的2,4,5,6周浊度都在5以上。
(5)ProTα对对虾存活率的影响,实验室条件下,经过3个多月的养殖,收集实验组和对照组对虾,计算总数。结果见图10,从图中可以看出,经过2个月的养殖,实验组的对虾数量明显比实验组数量多,实验组对虾数量还有平均15只,而对照组一组在第7周已经全部死亡,另外两组平均剩下3~5只。两者差异极显著(P<0.01)。
所有数据进行Graph软件进行统计分析。*为显著差异(P<0.05),**为极显著差异(P<0.01)。
功能饲料的实验结果证明,ProTα单体混合常规饲料制备成功能饲料后,能够显著降低水体亚硝酸盐、氨氮水平,降低水的浊度,同时能够提高溶解氧水平。达到提高对虾抗病力,从而达到提高对虾生存率的效果。
Claims (6)
1.ProTα新用途是ProTα在制备功能饲料达到改善养殖水水质条件的应用。
2.重组胸腺素α原在功能饲料中的应用。
3.如权利要求1和2所述应用,其特征在于所述功能饲料包括水产养殖饲料。
4.如权利要求2所述应用,其特征在于所述胸腺素α原包括重组胸腺素α原和由组织分离纯化的胸腺素α原。
5.如权利要求1所述应用,其特征在于所述ProTα来源为动物或人。
6.如权利要求5所述应用,其特征在于所述ProTα来源为基因工程表达、合成或动物组织中提取。
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