CN108132233A - 一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法，通过对微藻培养系统净输入光量子数量和微藻叶绿素荧光动力学参数的测定，计算培养过程中实际为藻细胞所利用的光能，根据光合作用生物质固定与光能吸收的关联，计算实时系统的营养物质需求，最终实现基于微藻光能利用优化营养要素供给的目的。本发明从微藻培养过程中能、质固定相关性入手，提升微藻培养的光能利用效率。

Description

一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法
技术领域
本发明涉及一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法。
背景技术
微藻是一类单细胞光合生物的统称，因其具有较高的光能利用效率，得到了广泛的关注，尤其是在近一个世纪，随着能源危机的爆发，微藻研究也呈现周期性发展态势。高光效、低成本培养一直是能源微藻研究和产业化实现的关键。从宏观角度，微藻储能物质的生产就是利用光合作用，将太阳光能转化为化学能，并以合适的载体固定存储，而微藻生物质的变化也将影响其转化太阳光能的效能。因此，有效的调节这一过程中能(太阳光能)、质(生物质)转化，是提升整体效率的基础。
微藻能、质固定均发生在叶绿体中，其能量和碳源输入是两个独立而又相关的过程。光合系统中的光系统II(PS II)通过分解水将光能转化为电子传递，经光系统I(PS I)产生还原力NADPH，同时，水分解产生的质子梯度推动ATP合酶产生ATP，最终，还原力和能量作用于暗反应元件，通过卡尔文循环完成CO2的固定。贯穿这一过程，固碳是电子流向的目标。如果电子传递链受阻，为了避免多余的电子将产生大量的氧自由基而损伤细胞，多余的能量被通过热耗散等形式消耗，或者通过调节PS I/II的活性减少对光能的捕获，同时，细胞也会通过代谢调节，改变整体的的能量状态水平，引发复杂的反馈调节。光合系统能量利用能力多少可以使用叶绿素荧光动力学参数测定进行表征。微藻自养培养过程中的这种光暗反应的动态平衡调节的本质就是微藻能、质转化的动态平衡。强化细胞能、质固定间的耦联，达到生长与储能物质积累的最大化，将为能源微藻的产业化提供新的工艺基础和契机，也将加深对微藻光合作用的调节机制的深入理解。
中国科学院大连化学物理研究所首次提出了基于能、质转化的微藻培养控制思路(201410604418.3)，其实施需要突破的一个技术难点在于如何确定真正被微藻所利用的光能。本发明引入了叶绿素荧光动力学参数，对光反应阶段实际量子传递效率进行测定，以此建立光能输入与藻细胞实际固定的光能的经验公式，并进一步计算满足光能固定所需要的碳、氮和磷等主要营养元素的需求量，实现微藻生产过程中生产要素的有效供给。微藻生物质固定的光能既可以通过燃烧热测定等离线精确方法获得，也可以通过诸如红外、光合商测定等在线快速估算方法获得，尤其适用于大规模生产过程中微藻培养，因其目标产物清晰，生物质成分稳定。
发明内容
本发明涉及一种用于微藻培养过程中，以叶绿素荧光动力学参数检测为基础，基于实际利用光能进行营养物需求量计算的方法。
本发明是一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法，其特征在于通过对微藻培养系统净输入光量子数量和微藻细胞叶绿素荧光动力学参数的测定，计算培养过程中微藻细胞固定光能的速率，并通过光合作用中光能与生物质固定之间的相互关系，计算主要营养元素的需求量。
本发明所中所述的光量子指的是能够激活光合作用的那部分光量子，其波长主要位于400-700nm，即photosynthetically active radiation(PAR值)。在一定范围内，PAR值越大，微藻光合系统固碳能力越强。但是当PAR值查过一定强度后，过多的光量子超出了光合系统的利用能力，一方面光合系统会通过增强耗散来消耗这部分能量，同时过多的光将使光系统产生破坏，即光损伤。现有研究表明，这种损伤主要发生在光合系统II(PSII)中。即当光强上升到该强度后，光合强度不再继续随着光强增加而增加，此时的光强为最大饱和光强。因此，用于计算光合能量固定的光量子数应为实际光量子数和饱和光强对应光量子数之间的小值。测定有效光合量子数的方法有多种，本发明优选使用具有有效光合量子数测定功能的传感器或辐照计。
光合系统对光能的利用效率可以通过叶绿素荧光参数进行表征。本发明即通过对叶绿素荧光动力学参数进行测定，以此作为计算细胞实际固定光能的参数。其中可能涉及到的叶绿素荧光动力学参数包括如下参数中的一种或多种：Fv/Fm，即光系统II最大光化学量子产量，Fv’/Fm’，即光系统II有效光化学量子产量，Y(I)，即光系统I光化学效率。叶绿素荧光动力学参数的测定优选具有在线测定能力的叶绿素荧光仪。
光合系统固定的生物质和能量在细胞内进行了复杂转化，但是在特定培养条件下，尤其是在以稳定生产为目标的条件下，细胞的生物质构成相对稳定，这为本发明进行能-质换算提供了可能。同时，叶绿素荧光参数不仅提供了微藻光能利用能力信息，同时也是一个重要的微藻细胞生理状态表征参数，与细胞所处特定生理状态密切相关。因此，本发明以叶绿素荧光参数检测为基础，希望通过有限实验获得对应不同状态下细胞固定能、质相关经验公式，作为基于叶绿素荧光参数计算微藻特定条件下固定生物质的计算基础。
为了实现上述换算，另一个需要获得的信息是微藻在特定状态下的生物质含能情况。尽管生物质在细胞生长过程不断变化，但是其本质仍是化学键的断裂和重新生成，而其能量本质即为化学能，即生物质的热值。生物质热值可以通过测定燃烧热直接获得，也可基于元素分析、红外测定等进行间接测定【MengYY,YAO CH,XUE S,YANG HB,Application ofFourier transform infrared(FT-IR)spectroscopy in determination of microalgalcompositions.Bioresource Technology,2014,151:347-354.；Zhang DM,Yan F,Sun ZL,Zhang QH,Xue SZ,Cong W.On-line modeling intracellular carbon and energymetabolism of Nannochloropsis sp.in nitrogen-repletion and nitrogen-limitation cultures.Bioresource Technology,2014,164:86-92.】，或基于微藻光合商估算其生物质够能进行间接计算。
生物质中主要元素间比例在特定生理状态下相对稳定，因此，在生物质总量基础上，能够计算主要营养元素的需求量，作为补加营养的技术基础。最终，根据计算结果确定培养系统中主要营养物补充量，实现基于光能利用水平的微藻营养补充控制。
发明原理：
光是微藻大规模培养的能量来源，微藻生长变化的本质是对其固定光能的利用和再分配，因此，以能量守恒为基础，以可以实时快速测定的微藻光能利用情况为出发，解算实时微藻营养需求情况，最终实现微藻培养的高效调控。与已有的方式相比较，本方法能够更准确实时的响应输入光变化而进行微藻生长要素的精确调节，实现光能和营养物质的高效利用。
具体实施方式
实施例一、
对于单侧光源的培养系统，如自然光、单侧人工光源的光生物反应器，使用平面型辐照计测定正对光源培养系统外侧光强Par1和与之相对的培养系统另一外侧正对光源方向的投射光强Par2，其差值为被培养系统所吸收的光量子数。对于具有不同方向光源的培养系统，使用具有球面积分功能的辐照计，测定系统吸收光量子数。
如夏季大连地区平均入射的光PAR值约为1000μmol/m2s，而稳态培养过程中100L微藻反应器的平均透过光为6μmol/m2s，此时吸收的光量子为994μmol/m2s。而在实验室500mL光生物反应器中，入射光190μmol/m2s，透射光6.3μmol/m2s，吸收的光量子为183.7μmol/m2s。
实施例二、
对培养系统的藻液取样，使用离线叶绿素荧光仪Water-PAM或Duel-PAM系统或等效系统，经过暗诱导测定藻细胞的荧光动力学参数值，包括Fv/Fm，Fv’/Fm’，Y(I)等。正常培养过程中，湛江等鞭金藻的对应的叶绿素荧光值分别为Fv/Fm在0.70～0.72，Fv’/Fm’在0.55～0.60，Y(I)I在0.90～0.95。
实施例三、
根据测定的系统吸收光量子数与细胞光合量子效率，通过Ecapture＝k(t)ηPardt的公式计算瞬时细胞固定光能，其中Ecapture为单位光照面积下瞬时光合系统固定的能量；k(t)是一个与培养系统光照等效面积和培养时间相关的一个经验系数，为测定状态下系统性光能损失(如散射等)，可以通过相同光量子效率下测定藻细胞热值与所固定光量子之间的比例获得其经验值，单位是Jm2/μmol；η为表观光量子效率，取PS II和PS I光量子效率中最小值min(Fv/Fm,Fv’/Fm’,Y(I))；Par为实施例一中所测定的系统吸收光量子数。其中η也可以简化为单一叶绿素荧光动力学参数作为基础进行计算，如仅测定Y(I)或Fv/Fm。
为了获得上述经验参数，测定不同时刻的Par值，叶绿素荧光参数Fv/Fm,Fv’/Fm’或Y(I)中的一种或多种。取出一定量的藻细胞测定当时的热值ΔHcell(J/mol)并进行元素分析，同时还需要测定同时刻的单位光照面积下的生物质含量，二者的乘积即为Ecapture。将上述测定结果带入公式中，即可求解出经验系数k(t)。
通过元素分析，微藻的生物质能够表示利用C归一化的为形如CHhNnOoPp的分子式，并计算出微藻生物质的摩尔热值ΔHcell；或使用量热仪，直接测定微藻的燃烧热作为热值；或使用参考文献中【MengYY,YAO CH,XUE S,YANG HB,Application of Fourier transforminfrared(FT-IR)spectroscopy in determination of microalgalcompositions.Bioresource Technology,2014,151:347-354.；Zhang DM,Yan F,Sun ZL,Zhang QH,Xue SZ,Cong W.On-line modeling intracellular carbon and energymetabolism of Nannochloropsis sp.in nitrogen-repletion and nitrogen-limitation cultures.Bioresource Technology,2014,164:86-92.】结合红外表征或者光合商表征，进行估算。
即对应t时刻元素的需求量为：
C需求摩尔数＝Ecapture/ΔHcell
N需求摩尔数＝n*Ecapture/ΔHcell
P需求摩尔数＝p*Ecapture/ΔHcell
实施例四、
利用燃烧热测定仪对几种典型微藻，包括湛江等鞭金藻(金藻)、四爿藻(海洋绿藻)、小球藻(淡水绿藻)和螺旋藻(蓝藻)的燃烧热值进行测定，分别为：2.2±0.08、1.7±0.02、2.0±0.03和2.1±0.01，单位x104J/g。
因此利用Par值和叶绿素荧光值，结合实施例三所获得的经验参数k(t)，计算出对应时刻生物质固定定量，并根据上述生物质能和元素比例计算出实时所需碳氮磷的需求量，最终根据培养基的构成获得营养的补加需求。以湛江等鞭金藻500mL培养为例，通过元素分析获得其指数期生物质结构简式为CH1.94O0.26N0.12P0.01，平均分子量20.09，取η＝Fv’/Fm’＝0.58，通过前期实验获得经验参数k(t)为8.1x10-4Jm2/μmol,摩尔燃烧热2.2x20.09＝44.2x104J/mol，吸收光量子数为183.7μmol/m2s，所以，需要的瞬时碳源数为
k(t)ηPardt//ΔHcell＝8.1x10-4x0.58x 183.7/(44.2x104)dt＝1.95x10-7mol/sdt
对应N和磷的瞬时需求量为0.23x10-7mol/s dt和0.02x10-7mol/s dt。

Claims (7)

1.一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法，其特征在于通过对微藻培养系统净输入光量子数量和微藻细胞叶绿素荧光动力学参数的测定，计算培养过程中微藻细胞光能固定的速率，并通过光合作用中光能与生物质固定之间的相互关系，计算培养系统的碳源、氮源的需求量进行补充。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻培养系统净输入光量子数量是指能够有效激活光合作用的光量子数量，即波长位于400-700nm范围的光量子数量，即PAR值。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻细胞叶绿素荧光动力学参数包括下述参数的一种或多种，可以由叶绿素荧光仪直接测量获得，即：Fv/Fm，即光系统II最大光化学量子产量，Fv’/Fm’，即光系统II有效光化学量子产量，Y(I)，即光系统I光化学效率。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：以细胞吸收的光能与细胞热值(ΔHcell)的比值计算实际生物质固定量，即主要营养物质需求量，其中细胞热值可以通过测定燃烧热直接获得，也可通过测定主要元素构成、红外表征或呼吸商，建立对应生物质关联经验公式进行换算。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：通过如下公式计算微藻固定光能，
Ecapture＝k(t)ηPardt，其中Ecapture为单位光照面积下瞬时光合系统固定的能量；k(t)是一个与培养系统光照等效面积和培养时间相关的一个经验系数，需要通过实验测定；η为表观光量子效率，取PS II和PS I光量子效率中最小值min(Fv/Fm,Fv’/Fm’,Y(I))，由叶绿素荧光仪直接读取；Par为实施例一中所测定的系统吸收光量子数，即权利要求2中所获得的测量值；dt为测定光通量的时间。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：其中η也可以简化为单一叶绿素荧光动力学参数作为基础进行计算，如仅测定Y(I)或Fv/Fm。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于：对于生物质化学简式为CHhOoNnPp、摩尔燃烧热为ΔHcell的微藻，通过如下公式计算微藻营养物质需求，
C需求摩尔数＝Ecapture/ΔHcell
N需求摩尔数＝n*Ecapture/ΔHcell
P需求摩尔数＝p*Ecapture/ΔHcell。
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