CN108072688A - 一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108072688A
CN108072688A CN201711401384.8A CN201711401384A CN108072688A CN 108072688 A CN108072688 A CN 108072688A CN 201711401384 A CN201711401384 A CN 201711401384A CN 108072688 A CN108072688 A CN 108072688A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
biosensor
sensitive detection
preparation
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711401384.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108072688B (zh
Inventor
严长浩
严欣
刘康宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201711401384.8A priority Critical patent/CN108072688B/zh
Publication of CN108072688A publication Critical patent/CN108072688A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108072688B publication Critical patent/CN108072688B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法属于纳米材料学、电化学领域。本发明采用自组装的方法在ITO导电玻璃导电面镀上一层银膜，并进一步制作出生物传感器电极，对电极进行了研究并将此电极用于BSA的检测。使用银纳米粒子作为标记物，利用银纳米粒子的自有的导电性，通过直接检测电化学的方法进行检测。制作成本低，可重复性强，同时检测时无需进行信号的放大，检测步骤简单，无需复杂操作的蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法。

Description

一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料学、电化学领域。
背景技术
近年来，在生物电化学领域中．对蛋白质和电极之间的电子转移的直接电化学研究愈来愈受到重视。由于蛋白质扩展的三维空间结构致使其电活性中心被包埋在多肽链中，而且它在常规电极表面的吸附变性会引起电极表面的钝化，所以蛋白质在一般电极上的电子转移速度很慢，得不到有效的电流响应。
纳米材料是当今热点研究领域之一，银纳米粒子具有优异的导电性能和电催化性能，制备银纳米粒子修饰电极可用作有机记忆存储器、生物传感器、电容器、催化剂和有机物或无机物浓度的测量等方面，因此银纳米粒子修饰电极有广泛的应用价值和前景。由于纳米银粒子粒径小，比表面积大，表面反应活性高，从而具有良好的催化活性，但利用银纳米材料作电极修饰剂用于蛋白质的测定在国内外仍未见报道。纳米银也能够应用电化学方法检测，其良好的氧化特性和导电性是发展纳米银电化学检测探针的前提。
发明内容
本发明目的在于提出一种制作成本低，可重复性强，同时检测时无需进行信号的放大，检测步骤简单，无需复杂操作的蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法。
本发明包括如下步骤：
1）在以偶氮二异丁腈为引发剂，聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，乙醇和水作为溶剂的条件下，将苯乙烯与丙烯醛共聚，取得表面功能化聚苯乙烯微球；
2）将表面功能化聚苯乙烯微球溶于无水乙醇后，与银氨水溶液混合，在80℃恒温条件下搅拌反应，取得表面修饰银纳米粒子；
3）将BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液与表面修饰银纳米粒子混合，在37℃下振荡孵育1小时，经超声离心除去过量的BSA蛋白质后，取得蛋白质修饰溶液；所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中BSA蛋白质的浓度为10-14mol/L～10-9mol/L；
4）将导电玻璃导电面向上浸没于蛋白质修饰溶液中，经过1小时后取出，再放入25℃恒温真空干燥箱烘干1小时，取出，得蛋白质灵敏检测的生物传感器。
本发明采用自组装的方法在 ITO导电玻璃导电面镀上一层银膜，并进一步制作出生物传感器电极，对电极进行了研究并将此电极用于BSA 的检测。使用银纳米粒子作为标记物，利用银纳米粒子的自有的导电性，通过直接检测电化学的方法进行检测。
以上表面功能化的聚苯乙烯微球上的银纳米颗粒之间的间隙构成了电子传输通道，促成了电子的传递与物质的氧化还原反应。该蛋白质灵敏检测的生物传感器用循环伏安法考察了BSA与电极之间的之间电化学行为。
本发明初步建立了基于生物传感电极的循环伏安检测法，此方法的特点是电极制作成本低，可重复性强，同时检测时无需进行信号的放大，检测步骤简单，无需复杂操作。因此，基于生物传感电极的检测方法将在蛋白质的检测中起到特殊的不可替代的作用。
本发明的创新点在于 ：
1、表面功能化的聚苯乙烯微球上的银纳米颗粒之间的间隙构成了电子传输通道，促成了电子的传递与物质的氧化还原反应。极大的促进了电化学生物传感器的灵敏度。
2、此种蛋白质灵敏检测的生物传感器重复性强、操作简单、价格廉价且高灵敏。
进一步地，本发明所述步骤1）中，将聚乙烯吡咯烷酮溶于乙醇和去离子水中，取得聚乙烯吡咯烷酮溶液；将引发剂偶氮二异丁腈溶于苯乙烯中，取得溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯；再将聚乙烯吡咯烷酮溶液和溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯在70℃下混合后，再加入丙烯醛，经反应后再加入盐酸，在80℃条件下反应12h，取得反应成生的固相，以乙醇和水洗涤，经离心取得表面功能化聚苯乙烯微球。该工艺可获得的聚苯乙烯醛基微球的特点：该生物传感器制备简单，检测限低。
所述步骤1）中，所述苯乙烯和丙烯醛的投料质量比为1∶1 。该投料比满足二元共聚的特点，保证球的外部有足够的醛基基团。
所述步骤2）中，所述银氨水溶液中银离子与聚苯乙烯醛基微球的投料质量比为1∶100。该投料比使得微球表面包覆的银纳米粒子粒径较小且均匀包覆。
所述步骤3）中，所述所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液由BSA蛋白质和pH为7.2的磷酸盐缓冲液混合组成。蛋白质溶液在过酸或过碱的环境中容易失活变性，所以选择在中性的条件下进行配制。
附图说明
图1为不同蛋白质浓度下PBS中生物传感器的CV图。
图2为不同蛋白质浓度与峰电流的图。
具体实施方式
一、电极的制备：
实施例1：
1、表面功能化聚苯乙烯微球的制备：
（1）将17.6mL无水乙醇、20.8mL去离子水和2.1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）加入装有冷凝管的三口烧瓶中，并将其置于70℃恒温水浴锅中，机械搅拌并保持转速为315r/min。
（2）将2.1g引发剂AIBN溶于6 mL苯乙烯中，取得溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯。
（3）在（1）取得的体系中加入溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯，30min后加入6mL丙烯醛（C3H4O），恒温反应7h后，加入盐酸并升高恒温水浴锅的温度至80℃反应12h，停止反应后，用乙醇/水离心洗涤超声数次，得表面功能化聚苯乙烯微球（PS-CHO）乳液。
2、表面修饰银纳米粒子（PS-CHO@Ag）的制备：
取0.02gAgNO3溶1mL去离子水，滴入1mL氨水，稀释至10mL的银氨溶液。
取4mL表面功能化聚苯乙烯微球（PS-CHO）乳液溶于1mL无水乙醇中，用恒温滴液漏斗逐滴滴入银氨溶液，80℃恒温水浴下315r/min反应两小时，停止反应。用乙醇/水离心洗涤超声一次，得表面修饰银纳米粒子（PS-CHO@Ag）微球。
3、蛋白质修饰：
将BSA蛋白质分散在10mM磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.2）中，配成10-9mol/L的BSA溶液。
将BSA蛋白溶液加入到表面修饰银纳米粒子（PS-CHO@Ag）微球中，混合物在37℃下振荡孵育1小时。然后将溶液进行超声离心以除去过量的BSA蛋白质，取得纳米探针溶液。
4、生物传感器的制备：
取导电玻璃，先用丙酮超声洗净，烘干后再用乙醇超声洗净，最后用去离子水超声洗净，烘干。
将导电玻璃导电面向上浸没在制备好的蛋白质修饰过的溶液中，待表面沉积了一层膜后，取出在25℃下烘干，再次沉浸到该溶液中，待表面又沉积了一层膜后，取出在25℃下烘干，重复以上步骤三次，即得到电化学生物传感器的工作电极。
实施例2、3、4、5、6：
与实施例1相同的步骤在此不再复述，仅改变在步骤3中配制的BSA蛋白溶液浓度：将BSA蛋白分散在10mM磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.2）中，分别配成10-14mol/L、10-13mol/L、10- 12mol/L、10-11mol/L和10-10mol/L的BSA溶液。
其他步骤与实施例1中相同。
二、试验结果分析：
电化学实验在CHl660D型电化学工作站上进行，三电极系统：工作电极为自制修饰导电玻璃，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极。实验温度为25℃。
循环伏安测试方法：先配置pH为7.2的0.1mol/L的PBS缓冲溶液，电解池中加入配置好的10mL的PBS缓冲溶液，然后插入饱和甘汞电极（内置饱和KCl溶液）作为参比电极，铂电极作为对电极，分别采用以上各实施例制得的导电玻璃作为工作电极。采用循环伏安法，记录伏安(cv)曲线。
图1是加入吸附10-9~10-14浓度的牛血清蛋白的导电玻璃作为工作电极后，在电解池中，电压为-0.3V~0.2V时，采用循环伏安法，测试工作曲线。图1中氧化峰即下半峰的峰电流值呈逐渐减小趋势。
图2是对氧化峰电流值取作Y轴，吸附不同的蛋白质浓度的log函数作为X轴。拟合后的曲线，方程式为：Y=-7.5e-6+(-0.08383+7.5e-6)/(1+exp(X+25.5)/1.3)
R2=0.98215 X∈(10-14~10-9mol/L）。

Claims (5)

1.一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）在以偶氮二异丁腈为引发剂，聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，乙醇和水作为溶剂的条件下，将苯乙烯与丙烯醛共聚，取得表面功能化聚苯乙烯微球；
2）将表面功能化聚苯乙烯微球溶于无水乙醇后，与银氨水溶液混合，在80℃恒温条件下搅拌反应，取得表面修饰银纳米粒子；
3）将BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液与表面修饰银纳米粒子混合，在37℃下振荡孵育1小时，经超声离心除去过量的BSA蛋白质后，取得蛋白质修饰溶液；所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中BSA蛋白质的浓度为10-14mol/L～10-9mol/L；
4）将导电玻璃导电面向上浸没于蛋白质修饰溶液中，经过1小时后取出，再放入25℃恒温真空干燥箱烘干1小时，取出，得蛋白质灵敏检测的生物传感器。
2.根据权利要求1所述蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法，其特征在于所述步骤1）中，将聚乙烯吡咯烷酮溶于乙醇和去离子水中，取得聚乙烯吡咯烷酮溶液；将引发剂偶氮二异丁腈溶于苯乙烯中，取得溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯；再将聚乙烯吡咯烷酮溶液和溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯在70℃下混合后，再加入丙烯醛，经反应后再加入盐酸，在80℃条件下反应12h，取得反应成生的固相，以乙醇和水洗涤，经离心取得表面功能化聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求2所述蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法，其特征在于所述步骤1）中，所述苯乙烯和丙烯醛的投料质量比为1∶1。
4.根据权利要求1所述蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法，其特征在于所述步骤2）中，所述银氨水溶液中银离子与聚苯乙烯醛基微球的投料质量比为1∶100。
5.根据权利要求1所述蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法，其特征在于所述步骤3）中，所述所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液由BSA蛋白质和pH为7.2的磷酸盐缓冲液混合组成。
CN201711401384.8A 2017-12-22 2017-12-22 一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法 Active CN108072688B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711401384.8A CN108072688B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711401384.8A CN108072688B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108072688A true CN108072688A (zh) 2018-05-25
CN108072688B CN108072688B (zh) 2019-09-03

Family

ID=62155355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711401384.8A Active CN108072688B (zh) 2017-12-22 2017-12-22 一种蛋白质灵敏检测的生物传感器的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108072688B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101672847A (zh) * 2009-09-30 2010-03-17 青岛科技大学 一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法
CN102632247A (zh) * 2012-04-20 2012-08-15 武汉大学 一种负载型银纳米复合材料的制备方法
CN102675501A (zh) * 2012-06-08 2012-09-19 上海蓝怡科技有限公司 一种粒径可控单分散聚苯乙烯微球的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101672847A (zh) * 2009-09-30 2010-03-17 青岛科技大学 一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法
CN102632247A (zh) * 2012-04-20 2012-08-15 武汉大学 一种负载型银纳米复合材料的制备方法
CN102675501A (zh) * 2012-06-08 2012-09-19 上海蓝怡科技有限公司 一种粒径可控单分散聚苯乙烯微球的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANAN ZHANG等: "Colloidal silver deposition onto functionalized polystyrene microspheres", 《POLYMER CHEMISTRY》 *
JOSEPH WANG: "Nanoparticle-Based Electrochemical Bioassays of Proteins", 《ELECTROANALYSIS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108072688B (zh) 2019-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ahmad et al. Wide linear-range detecting high sensitivity cholesterol biosensors based on aspect-ratio controlled ZnO nanorods grown on silver electrodes
CN102778571B (zh) 一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测方法
WO2016062101A1 (zh) 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用
CN103454426B (zh) 纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法
CN106383158B (zh) 一种基于银-石墨烯纳米复合物的过氧化氢无酶传感器及其制备方法
CN107727858B (zh) 一种基于Rh@Pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备方法及应用
CN108445057A (zh) 一种用于检测重金属离子的电化学传感器的制备及分析方法
CN106568820B (zh) 基于dna信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用
CN106596942B (zh) 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法及应用
CN105866205A (zh) 基于金纳米粒子-巯基化石墨烯修饰电极的电化学dna生物传感器的构建及应用
CN105699645B (zh) 一种电化学沙丁胺醇传感器的制备方法及应用
CN109115855A (zh) 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的制备方法及应用
CN104391123A (zh) 一种基于花状纳米氧化锌微球和金钯纳米花复合材料构建的生物传感器的制备方法及应用
CN109342745A (zh) 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法及应用
CN104181299A (zh) 一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用
CN107091872B (zh) 一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器及其应用
CN110441535B (zh) 一种基于Pd NCs功能化CuInOS检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法
CN109709188B (zh) 一种氮硫双掺杂氧化石墨烯标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
CN106093390B (zh) 一种PtCu@g‑C3N4/rGO标记的电化学免疫传感器的制备方法及应用
CN105911128B (zh) 一种无酶葡萄糖电化学传感器及其应用
CN105044179A (zh) 一种检测肿瘤标志物的三维石墨烯修饰电极及其制备方法
CN110596218A (zh) 用于有机磷农药检测的酶传感器的制备方法及其产品和应用
CN106770530B (zh) 一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用
CN110082403A (zh) 基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时-电流传感器及其应用
CN105301077A (zh) 一种检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant