CN107849585B - 用于发酵禾本科秸秆的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于发酵禾本科秸秆的方法。这包括甘蔗、高粱和玉米秸秆。此方法在将这些秸秆浸没在水性试剂溶液中时在辊之间将秸秆压缩至其直径的20%和90%之间。这使得这些秸秆在轴向上破裂,而不会显著损失汁液,同时将该试剂溶液拉入到薄壁组织中产生的裂缝网络中。在一些变型中,该水性试剂溶液含有发酵生物,糖从薄壁细胞扩散,与位于这些秸秆的这些裂缝中的这些发酵生物接触,并在这些秸秆内产生乙醇和乳酸。在一些变型中,该水性试剂溶液中酶、酸和芬顿试剂的组合扩散进入并降解这些秸秆中的木质纤维素基质。

Description

用于发酵禾本科秸秆的方法

优先权数据

本国际专利申请要求于2017年2月4日提交的美国专利申请号15/424,843和于2016年6月14日提交的美国专利申请号62/349,674的优先权,将这些申请各自特此通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及用以合成所需化合物的发酵工艺。更确切地,本发明涉及用多种类型微生物进行含氧有机化合物的制备。

发明背景

禾本科最广泛的栽培作物是甘蔗(Saccharum officinarum)、高粱(Sorghumbicolor)和玉米(Zea mays)。词语禾本科源自古希腊语πóα(póa),意为“草料(fodder)”。禾本科作物的秸秆已被用作动物草料数千年。这些秸秆被反刍动物(包括牛、绵羊和山羊)食用,因为反刍动物可以消化纤维素和半纤维素。这些秸秆在储存薄壁细胞中也含有糖,并且有时在储存薄壁细胞中含有较少量的淀粉粒。

这些秸秆中的糖长期以来一直用于生产食用糖和糖蜜,并且早已被发酵成乙醇以制备饮用乙醇(例如朗姆酒)和燃料乙醇。这些秸秆也经常通过在其上撒上乳酸菌进行青贮,这是一个将秸秆作为动物饲料保存长达一年并使秸秆更容易被反刍动物消化的工艺。

自(在德国)发现当切碎禾草并压缩切碎的禾草使空气排出时切碎的(青贮的)禾草不会“腐败”(即,闻起来像醋)以来,青贮已实践了大约200年。即使在今天,青贮禾本科的禾草和其他作物也涉及先把秸秆切碎成长约12至25mm的小块,然后撒上微生物(主要是乳酸菌),然后压缩切碎的秸秆以使空气排出。

这仅仅是因为糖可以扩散到切碎的秸秆的切割面,使得乳酸菌可以消耗糖。大多数酵母和大多数乳酸菌没有自动力(不能自己移动),所以糖必须扩散到它们(这些微生物不能游到糖的位置)。因为它们没有自动力,并且由于禾本科的秸秆不容易被微生物渗透,所以秸秆必须被切碎或粉碎以使糖扩散到微生物。

将微生物和酶撒到切碎或粉碎的秸秆上仅在秸秆的外表面上沉积微生物和酶。在秸秆被切碎或粉碎时形成的裂缝含有保持固定在裂缝中的气泡,防止微生物和酶在撒在秸秆上时沉积在裂缝内。由于酵母和乳酸菌没有自动力,并且由于酶和微生物的扩散极其缓慢,酵母、乳酸菌和酶对秸秆的渗透较差。

在本领域中需要针对酵母、乳酸菌且尤其是酶不完全渗透秸秆的问题的方案。

发明概述

在一些变型中本发明提供了用于发酵禾本科秸秆的方法,该方法包括以下步骤:

(a)提供禾本科的秸秆,其中这些秸秆具有大于100mm的平均长度,并且其中这些秸秆的平均初始含水量在25%和80%之间;

(b)当将秸秆浸没在水性试剂溶液中时,在辊之间压缩秸秆,其中辊将秸秆的平均直径压缩20%和90%之间,并且其中该水性试剂溶液含有一种或多种选自下组的发酵生物,该组由以下各项组成:酵母、乳酸菌、乙酸菌及其组合;

(c)从该水性试剂溶液中除去秸秆,其中这些秸秆保留该一种或多种发酵生物的至少一部分;并且

(d)发酵这些秸秆持续一个发酵时间以在这些秸秆内产生发酵产物。

在优选实施例中,这些秸秆选自下组,该组由以下各项组成:甘蔗秸秆、高粱秸秆和玉米秸秆。

在一些实施例中,这些秸秆具有附着到秸秆的叶子。

在一些实施例中,这些秸秆作为全株存在。

在优选实施例中,辊具有0.1m/s和10m/s之间的切向速度。

在优选实施例中,该水性试剂溶液含有选自下组的酶,该组由以下各项组成:果胶裂解酶、淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、木聚糖酶及其组合。

在一些实施例中,该水性试剂溶液含有选自下组的酸,该组由以下各项组成:甲酸、乙酸、乳酸及其组合。

在一些实施例中,该水性试剂溶液含有亚铁离子、过氧化氢或其组合。

在优选实施例中,发酵时间为1天和7天之间。

在优选实施例中,酵母是酿酒酵母的菌株。

在一些实施例中,在步骤(d)的发酵滞后时间期间将这些秸秆脱水。

在一些实施例中,乳酸菌选自下组,该组由以下各项组成:植物乳杆菌、布氏乳杆菌、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)及其组合。

在优选实施例中,该方法进一步包括使用0.15W/kg至5W/kg的湍流能来混合水性试剂溶液。

在一些实施例中,该方法进一步包括在发酵时间完成之后将秸秆保持在厌氧环境中持续一个青贮时间。

在一些实施例中,青贮时间为一天和一年之间。

在优选实施例中,该方法进一步包括通过粉碎秸秆来回收发酵产物。

在一些实施例中,该方法进一步包括通过从秸秆中蒸发发酵产物来回收发酵产物。

在一些实施例中,该方法进一步包括在步骤(d)之后将秸秆喂给反刍动物。

在一些实施例中,该方法进一步包括在步骤(d)之后使用秸秆进行厌氧消化以产生甲烷。

在一些实施例中,该方法进一步包括在步骤(d)之后使用秸秆进行酶水解以从纤维素产生乙醇。

附图简要说明

图1是在本发明的实施例和实例中使用的实验装置的示意图。

本发明实施方案的详细说明

将参考各种非限制性实施例和附图来详细描述本发明的方法、工艺和系统。

本说明将使本领域技术人员能够制造并使用本发明,并且描述了本发明的若干实施例、修改、变体、替代方案以及用途。当结合附图参考本发明的以下详细说明时,本发明的这些和其他实施例、特征以及优点对于本领域技术人员来说将变得更清楚。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的,除非上下文另有明确指示,否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数的指示物。除非另外定义,否则在此使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

除非另外指明,否则本说明书和权利要求书中使用的表示参数、条件、结果等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。因此,除非相反地指明,否则在以下说明书和所附权利要求书中阐明的数目是近似值,这些近似值可以根据具体的算法和计算而变化。

与“包含”、“含有”或“特征在于”同义的术语“包括”是包含性的或开放性的并且不排除附加的、未列举的元素或方法步骤。“包括”是权利要求语言中使用的专门术语,其是指所指定的权利要求要素是必要的,但是可以添加其他权利要求要素并且仍然构成在该权利要求的范围内的概念。

如在此使用的,短语“由……组成”不包括未在该权利要求中指明的任何要素、步骤或成分。当短语“由……组成”(或其变体)出现在一项权利要求的主体的从句中,而不是紧随前序部分,则它仅限制了该从句中所列出的要素;其他要素作为整体未被排除在该权利要求之外。如在此使用的,短语“主要由……组成”将一项权利要求的范围限制到指定的要素或方法步骤,加上本质上不影响所要求保护的主题的基础和一个或多个新颖特征的那些要素或方法步骤。

关于术语“包括”、“由……组成”以及“主要由……组成”,当在此使用这三个术语之一时,当前披露的且要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任一个。因此,在未以其他方式明确叙述的一些实施例中,“包括”的任何实例可以替换成“由……组成”,或可替代地替换成“主要由……组成”。

本文所述的任何实施例不得受关于反应机制、传质机制或者原料或产品描述的任何理论或推测的限制。

本发明是基于针对如下问题的技术方案:从富含糖的植物薄壁组织生产发酵产物是昂贵的,因为有效地粉碎禾本科的秸秆以提取糖需要大量能量和资本。本发明还基于针对收获后和加工或消费之前禾本科秸秆的降解问题的技术方案。

术语“压缩(compress、compressed、compressing以及compression)”在本文中用于指示秸秆的平均直径减少20%至90%。术语“粉碎(crush、crushed以及crushing)”在本文中用于指示秸秆的平均直径减少超过90%。

本发明使用在将秸秆浸没在含有一种或多种发酵生物的试剂溶液中时将秸秆的平均直径压缩20%和90%之间的技术途径。这种压缩使秸秆破裂而没有显著的糖损失,并且该试剂溶液被拉入薄壁组织中产生的裂缝内。糖从薄壁细胞扩散,与位于裂缝中的发酵生物接触,并在秸秆内产生乙醇和/或乳酸。乙醇和/或乳酸保留秸秆用于随后的乙醇提取和/或作为反刍动物草料消费。在一些变型中,该试剂溶液中的酶降解并分离薄壁细胞壁以用于较低能量的粉碎以提取乙醇或糖。

在本文的实例中证明了本发明的原理。

由作物中的乳酸菌发酵糖产生的低pH防止其他腐败生物生长。保持作物厌氧防止了乙酸菌消耗乙醇并产生乙酸(醋)。由于乙酸菌是高度自动的,除非环境保持厌氧(无氧),否则它们可以消耗青贮秸秆中的所有乙醇。

现在认为,由乳酸菌引起的低pH也导致秸秆中半纤维素的一种类型的稀酸水解,这改善了秸秆的消化率。通常稀酸水解在pH 2.0或更低在几个小时内进行,但在青贮饲料中pH为4.0时,这种稀酸水解在几周或几个月内进行。支持青贮饲料中的稀酸水解的数据描述于亨克(Henk),琳达(Linda)L.和詹姆斯(James)C.林登(Linden),“从高粱中生产固态乙醇(Solid-state production of ethanol from sorghum)”,应用生物化学与生物技术(Applied biochemistry and biotechnology)57.1(1996):489-501,将其特此通过引用并入本文。亨克指出(第491页;内部引用省略),“我们的数据显示,青贮是稀酸水解的一种形式。青贮改善了木质纤维素纤维对酶水解的反应性。

本领域技术人员将认识到,许多微生物和酶通常用于青贮作物,包括酵母、乳酸菌、半纤维素酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶。这描述于宫(Kung),L,“青贮饲料发酵和添加剂(Silage fermentation and additives)”,“阿尔泰克第十七届年会论文集(Proceedingsof Alltech’s Seventeenth Annual Symposium)”,2001,其特此通过引用并入本文。这也描述于查理(Charley),罗伯特(Robert)C.,PCT专利申请PCT/CA 2010/001729,将其特此通过引用并入本文。

本领域技术人员以及熟悉新鲜收获的甘蔗、高粱和玉米的那些技术人员将认识到,这些作物的新鲜收获的秸秆相当脆弱。如果一个普通人用他的脚跟踏在置于地上的秸秆上,他会感觉到它破裂开,并且看着压缩的秸秆,他会看到一个大裂缝、一些小的裂缝和大量甚至更小的裂缝,所有这些裂缝处于轴向。仅用脚跟踩在秸秆上,他还会看到少量汁液从该秸秆中挤出来。他也会认识到,弯曲的秸秆将伴随着喀嚓的断裂声而突然间折断(脆性断裂)-如在玉米作物中众所周知的“青折(green snap)”断裂。本发明利用新鲜收获的秸秆的脆性优点以很少的能量传播秸秆中的裂缝。

禾本科秸秆中的储存薄壁细胞是长约360微米且直径为60微米、壁厚约2微米的薄壁多面体细胞。这更详细地描述于董(Dong),“甘蔗茎的固氮内生菌(对于质外体的新作用)(A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems(a new role for theapoplast))”,植物生理学(Plant Physiology)105.4(1994):1139-1147,将其特此通过引用并入本文。

具体地,董(Dong)在图2图片C和G中示出,甘蔗薄壁细胞在轴向上排列,但不在径向上排列。这就是为什么水在轴向(受节间长度限制)流过质外体但不会在径向或横向上流过质外体的原因。禾本科中其他秸秆的薄壁细胞类似地排列。禾本科中的甘蔗和其他秸秆易于在轴向上破裂,因为薄壁细胞壁在轴向上形成破裂面。由于细胞壁不是在径向上排列,所以禾本科中的秸秆很难沿径向切割,迫使切割通过细胞壁。相比之下,禾本科的秸秆不需要很多的能量来在轴向上分裂或裂开。

禾本科的秸秆在径向压缩时容易裂开。甘蔗秸秆的开裂结果连同开裂的有限单元模式包含于斯肯士(Skantz),J.和S.A.多曼蒂(Domanti),“甘蔗坯的本构行为的实验(Experiments into the constitutive behaviour of sugarcane billets)”,澳大利亚甘蔗技术人员学会论文集(PROCEEDINGS-AUSTRALIAN SOCIETY OF SUGAR CANETECHNOLOGISTS).沃森弗格森公司(WATSON FERGUSON AND COMPANY),1998,将其特此通过引用并入本文。不希望受任何特定理论的约束,认为初始径向压缩产生一个大的裂缝,随后的压缩产生两个较小的裂缝,随后的压缩产生四个甚至更小的裂缝等。

被压缩时会裂开的禾本科秸秆在秸秆上的力被去除时迅速恢复到圆形。秸秆中的纤维具有很高的拉伸强度,并且当秸秆上的力被去除时起到将秸秆拉回到圆形的作用,即使秸秆的薄壁组织中有裂缝。

禾本科秸秆的薄壁细胞中的汁液通常含有2%和20%之间的己糖,主要由蔗糖、葡萄糖和果糖组成。薄壁组织还经常含有淀粉粒。这些秸秆的干物质在榨出汁液后通常称为甘蔗渣。甘蔗渣通常包含约35%的纤维素,25%的半纤维素和22%的木质素。半纤维素通常由约85%的木糖、13%的葡萄糖和2%的阿拉伯糖组成。纤维素、半纤维素和木质素通常紧密结合在一起,阻止了使用酶水解纤维素和半纤维素。青贮(将游离糖转化为乳酸)是水解半纤维素的稀酸水解的一种形式,使得纤维素在反刍动物消化、厌氧消化或酶水解中更易接近酶。

甜高粱茎的淀粉含量描述于赵雅丽(Zhao,Ya Li)等人,“从成熟到一系列延迟收获日期的时间期间甜高粱的茎组成和收获产量的变化(Changes in stem compositionand harvested produce of sweet sorghum during the period from maturity to asequence of delayed harvest dates)”,“生物质和生物能(Biomass and Bioenergy)39(2012):261-273,将其特此通过引用并入本文。赵在表2中示出,秸秆具有占重量约10.1%的糖以及占重量3.6%的淀粉。如果淀粉表达于汁液中,则汁液具有占重量约4.3%的淀粉,但研究显示汁液仅具有占重量约0.1%的淀粉(1000mg/L)。不希望受任何特定理论的约束,认为当汁液被挤出时大部分淀粉留在秸秆中,因为当秸秆处于极端压力下时对淀粉粒存在过滤。

甘蔗和甜高粱汁液的淀粉含量描述于阿尔维斯(Alves),费尔南达维吉诺丁(Fernanda Viginotti)等人,“来自甘蔗和甜高粱秸秆的淀粉的结构和物理化学特征(Structural and physicochemical characteristics of starch from sugar cane andsweet sorghum stalks)”,碳水化合物聚合物(Carbohydrate polymers)111(2014):592-597,将其特此通过引用并入本文。阿尔维斯示出甘蔗汁具有约356mg/L淀粉,而甜高粱汁具有约1147mg/L的淀粉。这意味着甘蔗秸秆具有的淀粉是甜高粱秸秆的约三分之一,并且因此甘蔗秸秆的重量的约1%为淀粉。

热带玉米杂交种的糖含量描述于怀特(White),温迪(Wendy)G.等人,“温带到热带玉米杂交种的糖、生物质和生物燃料潜力(The sugar,biomass and biofuel potentialof temperate by tropical maize hybrids)”GCB生物能源(GCB Bioenergy)4.5(2012):496-508,将其特此通过引用并入本文。怀特表明,温带和热带玉米(Zea mays)的杂交种产生谷粒糖和可发酵秸秆糖两者。

许多发酵生物可以将葡萄糖、果糖、麦芽糖(葡萄糖二聚体)和蔗糖(葡萄糖-果糖二聚体)直接转化成乙醇和乳酸。本文中,葡萄糖和果糖的单体和二聚体将称为糖,将糖转化为乙醇的发酵生物将被称为酵母,并且将糖转化为乳酸的发酵生物将被称为乳酸菌。将糖转化为乙醇的发酵生物可以是真核生物、单细胞生物,或可以是细菌。将糖转化为乳酸的发酵生物可以是真核生物、单细胞生物,或可以是细菌。

许多发酵生物将糖转化为乙醇。产生乙醇的最广泛使用的发酵生物,啤酒酵母,是酿酒酵母的菌株。乙醇在饮料、运输燃料和其他有机化合物的前体中具有显著的经济价值。

其他发酵生物将糖转化为乳酸。这些称为乳酸菌,并且最常见的菌株是植物乳杆菌。乳酸将发酵物的pH降低至约4.2,这抑制大多数其他细菌和真菌的生长。这通常用于保存食物,如酸奶和泡菜。这也常用于保存作物以在之后用作动物饲料(草料),称为“青贮”。

一些生物在氧气的存在下(有氧环境)将乙醇转化为乙酸(醋)。最常见的菌株是醋化醋杆菌。

甲酸的0.5%溶液是乳酸菌以及其他污染细菌的选择性抑制剂,但不抑制酵母。这描述于施密特(Schmidt),J.等人,“保持青贮甜高粱中的糖含量(Preservation of sugarcontent in ensiled sweet sorghum)”,生物资源技术(Bioresource Technology)60.1(1997):9-13中有描述,将其特此通过引用并入本文。全世界生产的大比例的甲酸用于青贮动物饲料。

在如下中描述了用乳酸和乙酸抑制酿酒酵母,纳伦德拉奈斯(Narendranath),N.V.,K.C.托马斯(Thomas)和W.M.英格杜(Intlewew),“乙酸和乳酸对基本培养基中酿酒酵母生长的影响(Effects of acetic acid and lactic acid on the growth ofSaccharomyces cerevisiae in a minimal medium)”,工业微生物学和生物技术杂志(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology)26.3(2001):171-177,将其特此通过引用并入本文。纳伦德拉奈斯指出,“当介质中存在0.5%w/v乳酸时,甚至0.04%w/v乙酸的存在(当本身存在时不会引起酵母生长速率的显著变化)导致酿酒酵母的生长速率的显著降低”。

乙醇的沸点为78℃,乳酸的沸点为122℃,并且乙酸的沸点为118℃。这使得有可能通过使用罐式蒸馏器(有时称为蒸馏釜)从含有乳酸和乙酸的溶液中低成本地分离乙醇。然而,甲酸的沸点为100.8℃,这使得使用罐式蒸馏器分离乙醇和甲酸的混合物更加困难。有限量的甲醇还通过发酵生物和一些酶产生,且具有65℃的沸点。由于它在比乙醇低的温度下沸腾,它可以使用罐式蒸馏器通过弃去馏出物的最初几个百分比(称为头)来去除。甲酸和甲醇两者都对人体有毒,所以如果从发酵的秸秆中生产饮料酒精,则不应该使用甲酸来青贮秸秆。

存在用于将禾本科的秸秆中的糖发酵成乙醇的众所周知的技术。秸秆通常在一系列辊之间被粉碎以通过破裂薄壁细胞来提取汁液,并且然后将汁液与残余固体分离并发酵。因为薄壁细胞很小,所以需要大量的精力粉碎它们。从秸秆生产糖的资本和经营成本的近35%是归因于粉碎的成本。粉碎甘蔗的经济学更详细地描述于戈巴波(Gbaboa),“甘蔗切割机/榨汁机和辊式甘蔗汁提取系统的比较研究(Comparative study on cane cutter/juice expeller and roller model Sugarcane juice extraction systems)”,国际现代科学杂志(INT J CURR SCI)2013,7:E 55-60,将其特此通过引用并入本文。

固态发酵有时用于发酵禾本科的秸秆,将秸秆切成小块(或撕碎秸秆),撒上酵母,并让它们发酵。酵母粘附于新近暴露的薄壁组织,并且切碎的块(或撕碎的秸秆)中的糖分散到酵母中,该酵母将糖发酵成乙醇。这是与青贮相同的机制,但其中使用乳酸菌代替酵母。这种类型的固态发酵的缺点是在发酵之前需要大量的能量来对秸秆进行巴氏灭菌。这种技术的另一个缺点是切割或撕碎秸秆需要大量能量。这种技术的另一个缺点是,由于酶的扩散非常缓慢,不能使秸秆的内部与酶反应。另一个缺点是切碎的或撕碎的秸秆具有比整个秸秆或坯料低得多的容积密度。

其一个实例是在1985年12月24日授予阿斯图里亚斯(Asturias)的美国专利号4,560,659中所述的EX-FERM工艺,将其特此通过引用并入本文。EX-FERM工艺涉及将甘蔗切碎成平均粒径为0.25cm至4.0cm之间的块,与酵母和水混合并发酵。然后将发酵的溶液重新用于随后的发酵中,以在蒸馏前增加乙醇的浓度。

另一种类型的固态发酵描述于布赖恩(Bryan),威廉(William)L.,“甜高粱中糖的固态发酵(Solid-state fermentation of sugars in sweet sorghum)”,酶与微生物技术(Enzyme and Microbial Technology)12.6(1990):437-442,将其特此通过引用并入本文。这种技术将秸秆切割成0.6cm长或撕碎秸秆。秸秆中几乎80%的糖被发酵成乙醇。然而,由于在发酵前没有进行巴氏杀菌,因此产生大量的乳酸和乙酸。

类似类型的固态发酵描述于亨克(Henk),琳达(Linda)L.和詹姆斯(James)C.林登(Linden),“从高粱中固态生产乙醇(Solid-state production of ethanol fromsorghum)”,应用生物化学与生物技术(Applied biochemistry and biotechnology)57.1(1996):489-501,将其特此通过引用并入本文。这种技术使用牧草切碎机将田野中的秸秆和叶切碎,将切碎的牧草撒上酵母和酶,并且然后发酵。缺点是需要逆流提取来提取乙醇,这是比粉碎秸秆更资本密集的方法。亨克指出(第500页)“乙醇高粱青贮饲料在至少230天的时间段内是稳定的,因此潜在地每年产生用于连续乙醇生产的低成本原料”。

另外一种将禾本科的秸秆中的糖发酵成乙醇的技术描述于2016年11月22日授予哈姆里克(Hamrick)的美国专利号9,499,839,将该专利特此通过引用并入本文,并且是与本申请共同拥有的。这种技术使用真空将酵母和酶注入富含碳水化合物的作物(包括甘蔗和甜高粱)的质外体中,从作物周围排出液体,并且然后在质外体内发酵。

禾本科的秸秆可以在青贮后由反刍动物消化。亨克断言这种改善的消化率是由半纤维素的稀酸水解引起的。甜高粱的消化率描述于蒂马尔科(Di Marco),O.N.等人,“来自谷物、甜高粱和褐色中脉高粱类型的牧草青贮饲料的消化率:体内、原位和体外数据的比较(Digestability of forage silages from grain,sweet and bmr sorghum types:Comparison of in vivo,in situ and in vitro data)”,动物饲料科学与技术(AnimalFeed Science and Technology)153.3(2009):161-168,将其特此通过引用并入本文。甘蔗的消化率描述于川岛(Kawashima),T等人,“甘蔗秸秆对于牛的饲用价值(Feeding valueof sugarcane stalk for cattle)”,亚洲大洋洲人动物科学杂志(ASIAN AUSTRALASIANJOURNAL OF ANIMAL SCIENCES)15.1(2002):55-60,将其特此通过引用并入本文。玉米干草秸秆的消化率描述于托莱拉(Tolera),阿杜戈纳(Adugna)和芙瑞卡松德斯通(Frik),“在不同谷物成熟阶段收获的玉米干草的形态分数和干草不同部分的营养价值(Morphological fractions of maize stover harvested at different stages ofgrain maturity and nutritive value of different fractions of the stover)”,动物饲料科学与技术(Animal Feed Science and Technology)81.1(1999):1-16,将其特此通过引用并入本文。

青贮禾草的消化率和营养价值描述于亚科拉(Jaakkola),塞亚(Seija),佩卡哈赫坦恩(Pekka Huhtanen)和K.伊萨(Hissa),“细胞壁降解酶或甲酸对发酵质量和牛消化禾草青贮饲料的影响(The effect of cell wall degrading enzymes or formic acid onfermentation quality and on digestion of grass silage by cattle)”,牧草和饲料科学(Grass and Forage Science)46.1(1991):75-87,将其特此通过引用并入本文。亚科拉的结论是,当梯牧草(Phleum pretense,禾本科)含有对用乳酸菌进行青贮来说不足的糖时,用甲酸进行青贮比用纤维素酶和半纤维素酶进行青贮效果更好。

大多数发酵生物在有氧(含氧)环境中将糖氧化成二氧化碳和水。将一摩尔葡萄糖或果糖(C6H12O6)(或0.5摩尔蔗糖或麦芽糖)和六摩尔氧(O2)氧化成六摩尔二氧化碳(CO2)和六摩尔水(H2O)。这种机制在发酵时从环境中迅速去除氧气。

酵母在厌氧(无氧)环境中将糖发酵成乙醇。将一摩尔葡萄糖或果糖(或0.5摩尔蔗糖或麦芽糖)发酵成2摩尔乙醇和2摩尔二氧化碳,并释放出118kJ的热量。这意味着发酵18%的糖溶液将导致34℃的温升,其意味着需要对发酵培养基进行冷却。发酵1升18%糖溶液(1摩尔葡萄糖)还将产生2摩尔二氧化碳,其在20℃和大气压下的体积为约48升。典型的酵母在20℃和40℃之间最有效地发酵,但低至5℃具有显著的发酵活性(白葡萄酒在7℃和15℃之间发酵)。酵母细胞在超过42℃的温度逐渐死亡。酿酒酵母对pH相对不敏感,并且将在2.9至7.2的pH范围内发酵。这更详细地描述于阿罗约-洛佩兹(Arroyo-López),“温度、pH和糖浓度对酿酒酵母、库德里阿兹威酵母及其种间杂交种的生长参数的影响(Effects oftemperature,pH and sugar concentration on the growth parameters ofSaccharomyces cerevisiae,S.kudriavzevii and their interspecific hybrid)”,国际食品微生物学杂志(International Journal of food microbiology(131.2(2009):120-127,将其特此通过引用并入本文。

在有氧环境和厌氧环境两者中乳酸菌将糖发酵成乳酸,取决于乳酸菌的类型。在同型乳酸发酵中,将一摩尔葡萄糖或果糖(C6H12O6)(或0.5摩尔蔗糖或麦芽糖)发酵成二摩尔乳酸(C3H6O3)。在异型乳酸发酵中,将一摩尔葡萄糖或果糖(C6H12O6)(或0.5摩尔蔗糖或麦芽糖)发酵成一摩尔乳酸(C3H6O3)、一摩尔乙醇(C2H6O)和一摩尔二氧化碳(CO2)。植物乳杆菌在有氧环境和厌氧环境两者中在15℃和40℃之间生长。在有氧环境中,植物乳杆菌呼吸氧气,并且这种消耗的氧气产生过氧化氢(H2O2),过氧化氢抑制其他生物的生长。

大多数酿酒酵母菌株的直径为约10微米。具有约5微米的细胞大小的酿酒酵母菌株是Dry,可从美国乔治亚州德卢斯的拉勒曼德生物燃料与蒸馏酒精(Lallemand Biofuels&Distilled Spirits)获得。它产生按体积计高达20%(按重量计16%)的乙醇浓度,因此可以通过此酵母发酵具有按重量计高达32%的糖的富含糖的作物。这意味着作物或提取的汁液可以在发酵之前脱水,使得所得到的乙醇浓度更高。在大量生产乙醇和二氧化碳之前,酵母发酵可花费1小时至8小时。这通常称为发酵滞后时间。在发酵滞后时间期间脱水可以增加最终的乙醇浓度。

大多数植物乳杆菌菌株是棒状的,直径为约0.5-1.2微米,且长度为1-10微米。植物乳杆菌的一个来源是可从美国威斯康星州密尔沃基的拉曼动物营养公司(LallemandAnimal Nutrition)获得的Silage Inoculant II。通常植物乳杆菌与其他细菌和酶一起用于处理青贮饲料。这描述于1995年7月11日授予埃文斯(Evans)等人的美国专利号5,432,074中,将其特此通过引用并入本文。目前可从拉曼动物营养公司获得的青贮制剂含有植物乳杆菌与布氏乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌和费氏丙酸杆菌的混合物。

发酵生物如此大,使得它们在其一生中不会通过扩散而移动。然而,气体和糖容易扩散,并且容易通过薄壁细胞壁扩散,并且酶通过薄壁细胞外部的液体扩散。二氧化碳的扩散系数为2.5×10–9m2/s,这意味着它在约7分钟内扩散1mm而在约11小时内扩散10mm。蔗糖的扩散系数为7.1×10-10m2/s,这意味着它在约17分钟内扩散1mm而在约39小时内扩散10mm。果胶裂解酶的扩散系数为8.0×10-11m2/s,这意味着它在约3.5小时内扩散1mm而在约14天内扩散10mm。

在糖的存在下,酵母细胞粘附于表面(例如薄壁细胞)。这描述于维尔斯特雷佩恩(Verstrepen)和克利斯(Klis),“酵母中的絮凝、粘附和生物膜形成(Flocculation,adhesion and biofilm formation in yeasts)”,分子微生物学(Molecularmicrobiology)60.1(2006):5-15,将其特此通过引用并入本文。类似地,乳酸菌也粘附到表面(诸如薄壁细胞)。

酵母菌和乳酸菌都以冷冻干燥形式出售并且易于处理。两者均被归类为GRAS(通认安全(Generally Recognized as Safe)),并且普遍在普通饮食(average diet)中消费-例如,面包是用酿酒酵母制成的,而酸奶是由植物乳杆菌(其还存在于唾液中)和嗜酸乳杆菌制成的。类似地,果胶裂解酶、淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和木聚糖酶可以按食品级形式获得。

淀粉是葡萄糖的一种聚合物。在淀粉可以通过酵母转化成乙醇或通过乳酸菌转化为乳酸之前,必须首先通过淀粉酶将其转化为葡萄糖。淀粉在酵母或乳酸菌有活性的温度范围内不溶于水。

存在可用于在酵母有效操作的温度范围内有效地将淀粉转化为葡萄糖的淀粉酶。一个例子是来自美国杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences)的002酶制剂。这含有在里氏木霉中表达的白曲霉α-淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶,其协同作用以将粒状淀粉底物水解成葡萄糖。内切酶活性、α-淀粉酶和外切酶活性、葡糖淀粉酶,在各种各样的乙醇发酵条件下催化粒状淀粉的完全水解。002在20℃和40℃之间及pH 3.5和4.5之间具有显著的活性,因此适用于酵母的pH和温度

薄壁组织可以被酶浸软(细胞彼此分离)。当薄壁组织被浸软时,细胞膜也被破坏,既被机械作用又被细胞壁释放的酶破坏。这导致液泡的内容物从薄壁细胞中渗出,并使酶更容易扩散到液泡中。这也提供了一种浸解作用,其中可以通过挤压或蒸发更容易地去除薄壁细胞中的液体。果胶裂解酶和木聚糖酶浸软禾本科秸秆中的薄壁细胞。这描述于石井(Ishii),“用于分离原生质体的酶(Enzymes for the isolation of protoplasts)”,植物原生质体和基因工程I(Plant Protoplasts and Genetic Engineering I),柏林海德堡施普林格(Springer Berlin Heidelberg),1989,23-33,将其特此通过引用并入本文。石井还表明纤维素也导致细胞壁降解。

果胶裂解酶降解果胶而不产生甲醇作为副产物。这使得发酵汁作为本发明的较高价值的乙醇产品更有用。存在可用于在与酵母相同的pH和温度范围内操作的果胶裂解酶,特别是来自黑曲霉的果胶裂解酶,最适pH为5.5而最适温度为35℃。然而,果胶裂解酶是不寻常的,因为它在低至5℃的温度下具有显著的活性。果胶裂解酶描述于亚达夫(Yadav)等人,“果胶裂解酶:一篇综述(Pectin lyase:a review)”,加工生物化学(ProcessBiochemistry)44.1(2009):1-10中,将其特此通过引用并入本文。在酵母的相同pH和温度范围内操作的果胶裂解酶的两个实例是(丹麦诺维信公司(Novozymes A/S))和“Rohapect 10L”(德国AB酶GmbH)。

石井还表明,木聚糖酶将来自禾本科秸秆的薄壁细胞浸软,而纤维素酶破裂打开这些秸秆的薄壁细胞的细胞壁。可商购的木聚糖酶的实例是HTec3(丹麦诺维信公司),其是内切木聚糖酶和纤维素酶的混合物。HTec3在温度低于30℃时具有约90%的活性,而在pH为4.0时具有约70%的活性,因此适用于酵母的pH和温度。

葡萄糖氧化酶将葡萄糖和O2转化为葡糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶和纤维素酶的组合已经显示出在有氧条件下防止禾草青贮饲料的降解。这描述于劳拉玛(Rauramaa),A.L.,J.J.塞塔拉和A.E.汤米拉(Tommila),“葡萄糖氧化酶对保存禾草青贮饲料的影响(The effect of glucose oxidase on the preservation of grass silage)”,禾草和饲料科学(Grass and Forage Science)46.4(1991):359-364中,将其特此通过引用并入本文。葡萄糖氧化酶在宽的pH和温度范围内是有活性的,这描述于彼耶拉(Biyela),B.N.E.等人,“使用Gluzyme10.000 BG处理的葡萄汁生产降低酒精度的葡萄酒(Theproduction of reduced-alcohol wines using Gluzyme10.000 BG-treatedgrape juice)”,南非葡萄酒酿造学和葡萄栽培杂志(S.Afr.J.Enol.Vitic.)第30卷,第2期,(2009):124-132,将其特此通过引用并入本文。不希望受任何特定理论的约束,认为纤维素酶从艰难水解纤维素中释放出葡萄糖,并且葡萄糖的这种缓慢释放导致葡糖酸和过氧化氢的缓慢产生,其中归因于葡糖酸的较低pH与过氧化氢的毒性的组合效应防止了大多数污染生物产生乳酸和乙酸。

当发酵时,酵母产生大量二氧化碳(CO2)。通过将CO2溶解在水中形成碳酸。当发酵时,CO2的分压为100kPa(1atm),并且此溶液的pH为约3.92。酵母在此pH下发酵良好,来自黑曲霉的果胶裂解酶(如XXL和Rohapect 10L)在此pH下具有显著的活性,并且粒状淀粉水解酶(如STARGEN)在此pH下具有显著的活性。类似地,所有这些酶在酵母的温度范围内(25℃至40℃)具有显著的活性。

甘蔗、高粱和玉米的收获温度可以低于20℃。然而,通过发酵糖释放的热从薄壁组织扩散出来会迅速地将此组织的温度增加到酶具有显著活性的温度范围。

全秸秆甘蔗和高粱的容积密度在300和400kg/m3之间。甘蔗、高粱和玉米(即秸秆)的坯料(切片)的容积密度在180和240kg/m3之间。切碎至长度为10mm和25mm之间的秸秆的容积密度为约60kg/m3。通常,容积密度与秸秆的切碎长度负相关。

如果在水溶液中发酵整个秸秆、坯料或切碎的秸秆,则秸秆中的汁液被稀释在2.5×和10×之间。由于从稀释溶液中分离乙醇的成本昂贵,这是不实际的。例如,当秸秆的容积密度为200kg/m3时,5L的水溶液包围每0.5L的秸秆汁液。如果1L的秸秆汁液具有10%糖,发酵后将具有约5%乙醇。如果秸秆在水溶液中发酵,则所得溶液在发酵后将具有0.5%乙醇,这在商业上无法提取。这可以通过在5%乙醇溶液中发酵整个秸秆和坯料来解决,但这还有污染物随时间累积的其他问题。

由于运输成本主要是体积(而不是重量)的函数,并且由于作物通常在远离其加工的地方收获,所以在这样低的容积密度下运输糖是相当昂贵的,因为卡车只有2%至5%体积被糖占据。本领域需要通过在(或接近)这些作物的收获地点制造乙醇来降低从富含糖的作物制造乙醇的成本,从而降低运输成本。

秸秆中的薄壁细胞是活组织,因此在收获后会呼吸(breathe)。呼吸涉及将薄壁细胞中的氧和糖转化为二氧化碳和能量以维持细胞。储存时,甘蔗、高粱和玉米损失大量的糖来呼吸。本领域需要通过比目前的方法更快速地将糖转化为乙醇来减少呼吸损失的糖。一旦作物中的糖转化为乙醇,它们可被长期储存,允许全年连续去除乙醇。希望通过全年而不仅是收获季节期间使用这种设备,以更有效地利用投资于辊提取、乙醇汽提和蒸馏中的资本。

如果甘蔗、高粱和玉米秸秆储存在厌氧(无氧)条件下,秸秆外部的微生物将定殖于秸秆,并且21天之后将完全该秸秆中的所有糖发酵,主要是发酵成乳酸和乙酸。由于秸秆的外层经常因收获而刮擦和损坏,所以微生物可以更容易地渗透秸秆的外层,导致因发酵成乳酸和乙酸造成的糖损失。将秸秆撒上酵母或乳酸菌而不首先切碎或撕碎秸秆是无效的青贮技术。

酵母在发酵时产生大量的二氧化碳,而发酵期间将酵母注入裂开的秸秆中在秸秆的外部形成泡沫,并在组织内气泡形成的作用下从秸秆中排出液体。出人意料的是,酵母不会被这些泡沫排出,并且酵母可以继续发酵,直到所有的糖都被发酵。

不希望受任何特定理论的约束,认为酵母细胞在糖存在下对薄壁细胞的粘附比发挥作用以从薄壁组织排出酵母的二氧化碳气泡的力更强。

本发明的前提还在于如下事实,糖通过禾本科的秸秆的薄壁细胞中的细胞膜的扩散速率足以使裂缝中的发酵生物高速率发酵薄壁细胞内的糖。然后乙醇扩散到薄壁细胞中。在一些变型中,果胶裂解酶浸软薄壁组织,减少了粉碎秸秆以回收乙醇或未发酵的糖所需的能量。

本发明提供了用于发酵禾本科秸秆的方法,该方法包含以下步骤:

(a)提供禾本科的秸秆,其中秸秆具有大于100mm的平均长度,并且其中秸秆的平均初始含水量在25%和80%之间(基于重量),例如30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%;

(b)当将秸秆浸没在水性试剂溶液中时,在辊之间压缩秸秆,其中辊将秸秆的平均直径压缩20%和90%之间,并且其中该水性试剂溶液含有一种或多种选自下组的发酵生物,该组由以下各项组成:酵母、乳酸菌、乙酸菌及其组合;

(c)从该水性试剂溶液中除去秸秆,其中这些秸秆保留该一种或多种发酵生物的至少一部分;并且

(d)发酵这些秸秆持续一个发酵时间以在这些秸秆内产生发酵产物。

禾本科的秸秆当含水量在25%和80%之间时是脆性的,因此在辊之间压缩它们会导致在轴向上形成细小的裂缝网络。在步骤(b)期间,在秸秆外部的野生型酵母和乳酸菌没有大数目地注入到秸秆的细小裂缝网络中,因为水性试剂溶液中发酵生物的浓度远高于来自秸秆外部的野生型发酵生物的浓度。酵母菌和乳酸菌都没有自动力,所以来自秸秆外部的发酵生物不会定殖于秸秆的内部,并且从秸秆内部扩散的糖在秸秆内被随着水性试剂溶液注入的发酵生物消耗。因此,很少来自秸秆的糖被秸秆外部的野生型酵母和乳酸菌消耗。

秸秆需要足够长以便从进料槽拉入,通过辊(优选实施例中的两个辊或三个辊)推进并通过出口滑槽排出。出口滑槽需要具有恒定(或渐增)的直径,以防止输出堵塞。测试表明,100mm或更长的秸秆可以与辊作用。本领域技术人员将会看到,秸秆可以在辊之间一次一根压缩,或者多根秸秆可以在辊之间进料。

此方法中的关键单元操作是在浸没于水性试剂溶液中的同时压缩秸秆,刚好足以形成微小裂缝的网络而没有太多放出大量的汁液。出人意料的是,可以在高速浸没秸秆的同时压缩秸秆,并且水性试剂溶液以这种高速被拉入微小裂缝的网络中。以1m/s速度的测试显示,约200mm的浸没距离具有大约200毫秒的浸没时间,以使酶和发酵生物渗透秸秆。实例示出,这个时间足以导致秸秆完全渗透。

禾本科的不同秸秆(或不同杂交种)需要不同量的辊间压力。不同的辊直径、不同的弹簧强度、不同的桨叶高度、不同数量的辊和不同的切向速度将对不同类型的秸秆施加不同的裂缝扩展力。然而,不需要过度的实验来确定辊之间所需的力,因为存在确定所需最佳弹簧强度的简单程序。

最简单的校准测试涉及以生产速度(0.1至10m/s)在辊之间运行秸秆,在装置中没有液体,使弹簧以不同弹簧常数变化,直到经历不到1%的汁液损失。这些汁液损失测试可以在几个小时内进行。测试示出,在辊之间在用以实现完成注入的足够压力下只有0.5%的汁液损失发生。

本领域技术人员将认识到,随后的验证测试是在注入之前测量秸秆中的汁液的白利糖度,用水性试剂溶液注入秸秆,并在发酵3天后测量发酵结果。测量乙醇含量和软化薄壁组织将很容易验证所选的辊之间的压力是有效的。

本发明的优选实施例是在辊之间压缩整个秸杆,因为这可以用便宜的设备完成,并且由人工劳动、小型内部压缩发动机或小型电动机驱动。压缩所需的能量主要用于裂缝扩展,这是特别节能的。本领域技术人员可以看到如何用能够进行工业规模注入(超过10公吨/小时)的辊来构建其他实施例。

当秸秆被压缩时,该水性试剂溶液流入显微裂缝的网络,将水性试剂溶液中的发酵生物和酶分布到秸秆的整个薄壁组织中。

禾本科秸秆的底部1/3直径是顶部1/3直径的约两倍大,并且底部1/3中的压缩压力为顶部1/3的约两倍。此直径轮廓(直径作为与秸秆一端的距离的函数)通过辊将秸秆压缩到秸秆的每个点的直径的20%和90%之间来减少,包括20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%和90%,最优选范围为秸秆的每一点的直径的40%和60%之间。

本发明的优选实施例的辊需要与辊间隔成比例的在辊间的间隙处的力。本发明的优选实施例使用弹簧将辊推或拉到一起。弹簧具有如下特征,由弹簧提供的力与弹簧的位移成线性比例(胡克定律)。

秸秆在通过辊之前不容易弯曲,并且在经过辊时被压缩之后容易弯曲。在本发明的优选实施例中,辊被定向成使得进料滑槽从水性试剂溶液上方至水性试剂溶液下方直接进料到辊中。在本发明的优选实施例中,从水性试剂溶液引出的滑槽使得秸秆在通过辊之后向上弯曲。本发明的优选实施例使用两个辊,但是本领域技术人员还将认识到三个辊是可行的实施例。

这些辊需要抓住秸秆以将它们送进这些辊。在本发明的优选实施例中,这些辊具有升高的水平桨,以帮助拉动秸秆通过这些辊。

在本发明的优选实施例中,一个罐包含该水性试剂溶液,并且具有使该水溶液试剂溶液的水平保持恒定的进料阀。通过水性试剂溶液的秸秆带走一些水性试剂溶液,并且测试表明,秸秆质量的约15%的水通过在秸秆中吸收而被带走,需要从含有该水性试剂溶液的罐补充。这意味着一吨秸秆将吸收约150升的水性试剂溶液。本发明的一个实施例具有一对辊,以在秸秆显露在出口管113中之前,在与图1中的辊107和108垂直的方向上压缩秸秆,以便挤出被秸秆吸收的不需要的水性试剂溶液。

酵母是从薄壁组织中的糖和通过酶水解和稀酸水解释放的葡萄糖产生乙醇的生物。当发酵的目的是回收乙醇时,这用于富含糖的秸秆。乳酸菌用于将秸秆内部的pH降至约4.2,这可防止其他生物定殖到秸秆中。这是在青贮秸秆以供随后的反刍动物消耗时使用。在青贮后将秸秆随后用于厌氧消化的情况下,使用酵母和乙酸菌的共培养物将糖转化为乙酸。大多数酵母与较少量乳酸菌的共培养物用于将糖发酵成乙醇并保留秸秆以供随后的反刍动物消耗。

在优选实施例中,这些秸秆选自下组,该组由以下各项组成:甘蔗秸秆、高粱秸秆和玉米秸秆。

这些是禾本科最广泛种植的秸秆。

在一些实施例中,这些秸秆具有附着到秸秆的叶子。

当生产青贮饲料时,叶子通常比秸秆更容易消化,并且对反刍动物而言含有有价值的营养物质。可以在辊之间粉碎附着有叶子的整株植物,以将水性试剂溶液注入秸秆中,同时用相同的水性试剂溶液处理叶子。当在附着有叶子的情况下进行压缩时,优选将秸秆从秸秆的底部(厚端)到秸秆的顶部(薄端)送进辊中,使得叶子折叠在秸秆上。

在一些实施例中,这些秸秆作为全株存在。

当生产青贮饲料时,有时有用的是青贮全株,包括叶子和附着到全株的任何谷粒。压缩也会破开鞘包裹的谷粒,使谷粒更易接近酵母和酶,并使谷粒更易消化。

在优选实施例中,辊具有0.1m/s和10m/s之间的切向速度。

测试示出,1m/s的切向速度可以按每小时注入约1公吨甜高粱秸秆,导致秸秆中超过90%的糖被发酵。更慢或更快的切向速度也可以提供完整的注入。此外,如斯肯士所述,更快的切向速度产生更细的裂缝网络。

在优选实施例中,该水性试剂溶液含有选自下组的酶,该组由以下各项组成:果胶裂解酶、淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶及其组合。

测试表明果胶裂解酶可用于将禾本科的秸秆中的薄壁细胞组织浸软,使得通过粉碎来提取汁液更有效。

淀粉酶与果胶裂解酶结合使用以将薄壁细胞中的淀粉粒水解成葡萄糖。果胶裂解酶和/或木聚糖酶浸软薄壁细胞,而纤维素酶破裂薄壁细胞,允许淀粉酶扩散到淀粉粒。

纤维素酶用于将秸秆中的纤维素水解成葡萄糖,这是缓慢释放葡萄糖的一种方式。葡萄糖进而可以发酵成乙醇或乳酸,并且葡萄糖氧化酶可用于将葡萄糖和O2转化为葡糖酸和过氧化氢。

在一些实施例中,该水性试剂溶液含有选自下组的酸,该组由以下各项组成:甲酸、乙酸、乳酸及其组合。

研究表明,甲酸在青贮禾本科秸秆中是有效的。乙酸和乳酸可用作pH缓冲液,并且都能防止不想要的微生物的生长。

在一些实施例中,该水性试剂溶液含有亚铁离子、过氧化氢或其组合。

在芬顿反应中亚铁离子与过氧化氢一起使用。亚铁盐可溶于水,并且可以以芬顿反应所需的浓度安全地喂给反刍动物。一些乳酸菌产生过氧化氢,己糖氧化酶从葡萄糖、甘露糖和半乳糖产生过氧化氢,而这种过氧化氢与亚铁离子一起催化木质纤维素基质的分解,使其更易于消化并易接近酶。酿酒酵母可耐受高达约2mM的过氧化氢,但乳酸菌和乙酸菌不能耐受这种浓度的过氧化氢。这描述于贾米森(Jamieson),德瑞克(DEREK)J.,“酿酒酵母对过氧化氢和甲萘醌均有不同的适应性反应(Saccharomyces cerevisiae hasdistinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione)”,细菌学杂志(Journal of bacteriology)174.20(1992):6678-6681,将其特此通过引用并入本文。

在优选实施例中,发酵时间为1天和7天之间。

测试已经示出完全发酵花费1天和7天之间,取决于发酵生物的温度和浓度。

实验已经示出,酵母浓度为约2个细胞/薄壁细胞时的发酵时间导致约48小时至96小时的发酵时间,但较低浓度的酵母或乳酸菌可花费更长时间。较低的浓度导致较慢的发酵,其导致温度增幅较小,这减少了对昂贵的冷却机制的需要。

在优选实施例中,酵母是酿酒酵母的菌株。

酿酒酵母是对于将糖发酵成乙醇来说最广泛使用的酵母。此生物具有任何发酵生物的最高乙醇耐受性,并且许多杂交种是可用的。

在一些实施例中,在步骤(d)的发酵滞后时间期间将这些秸秆脱水。

在步骤(d)的发酵滞后时间期间使秸秆脱水,从秸秆中蒸发水,在步骤(d)发酵结束时减少秸秆中的水含量。当发酵产物是乙醇时,此选择导致秸秆汁液中更高的乙醇浓度,这比较低的乙醇浓度更有价值。当发酵产物是乳酸时,此选择导致更高的乳酸浓度,这导致较低的pH和更好的青贮。由小裂缝网络导致的秸秆的增加的暴露内表面面积增加了脱水速率,因为脱水速率与暴露表面积成比例。

通过降低水性试剂溶液中的发酵生物的浓度可以延长发酵滞后时间,因此增加在发酵滞后时间期间去除的水的总量。加热的空气、辐射性加热、传导性加热及其组合在脱水期间向秸秆补充热能,太阳能热空气是优选的实施例。本领域技术人员将认识到,在脱水过程中有多种方法将秸秆中的温度保持在低于38℃,尤其是通过控制热空气通过秸秆的循环速率。在一些简单的实施例中,秸秆可以在发酵滞后时间期间在阳光下简单地干燥,并且之后在大部分发酵时间内将其储存在厌氧环境中。这个简单实施例的成功取决于步骤(d)期间秸秆温度不超过38℃,这个温度将杀死注入到秸秆的细小裂缝网络中的发酵生物。

在发酵滞后时间期间,产生少量乙醇,并且主要通过脱水除去来自秸秆的水。最佳量的脱水使得秸秆中的糖的浓度是发酵生物可发酵的最大值,例如在酿酒酵母的一些菌株的情况下是按重量计约32%的糖。在一些实施例中,乳酸菌选自下组,该组由以下各项组成:植物乳杆菌、布氏乳杆菌、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)及其组合。

这些乳酸菌用于可商购的青贮制剂中。

在优选实施例中,该方法进一步包括使用0.15W/kg至5W/kg的湍流能来混合水性试剂溶液。

使用足够的湍流能,使得科尔莫戈罗夫长度(Kolmogorov length)尺度大约小于质外体自由长度(例如约20微米)。使用科尔莫戈罗夫长度尺度,并知道20℃下水的运动粘度为约10–6m2/s,将这些试剂和工艺用水混合至20微米尺度所需的能量需要约5W/kg,并且混合至50微米尺度需要约0.15W/kg。这些尺度如此使得糖在该尺度的扩散花费几秒,并且酶在该尺度的扩散花费几分钟。

在一些实施例中,该方法进一步包括在发酵时间完成之后将秸秆保持在厌氧环境中持续一个青贮时间。

当环境是厌氧的并且秸秆中没有糖和/或pH低于4.0时,真菌和细菌不能在秸秆中的果胶或乙醇上生长。

在一些实施例中,青贮时间为一天和一年之间。

在收获期间,几乎没有空闲时间用于加工作物以除去糖或乙醇,而青贮是在一整年内展开作物的耗时加工的方法。另外,如果作物被用作动物饲料,则需要在整个时期期间对其进行青贮,以便将其喂给反刍动物,直至下一次收获作物。

在优选实施例中,该方法进一步包括通过粉碎秸秆来回收发酵产物。

果胶裂解酶浸软禾本科秸秆中的薄壁组织。这提供了一种浸解作用,其中相比于对未经处理的秸秆通过常规破碎来去除薄壁细胞中的液体,薄壁细胞中的液体可以可更容易地通过粉碎去除。

在一些实施例中,该方法进一步包括通过从秸秆中蒸发发酵产物来回收发酵产物。

蒸发速率与暴露液体的表面积成比例,而本发明秸秆中微小裂缝网络每单位体积暴露非常大的表面积,使得乙醇蒸发有效率。此外,蒸发的蒸气中的乙醇浓度高于秸秆内的浓度。这使得从来自秸秆的蒸发蒸气直接生产酒精饮料具备实用性。

从发酵的秸秆蒸发乙醇的太阳能蒸发器的一个实例描述于1990年10月30日授予威尔克森(Wilkerson)的美国专利号4,966,655中,将其特此通过引用并入本文。太阳通过将光照射穿过塑料盖来加热秸秆,而夜间冷空气导致蒸发的乙醇蒸气冷凝。这种太阳能蒸发器是密封的,并且将保持厌氧环境,因为通过发酵将继续产生低水平的二氧化碳,保持内部正压。

这种类型的太阳能蒸发器需要很少的资本建造,并且由于紫外光降解塑料,每几年只需要更换塑料盖片。

在一些实施例中,该方法进一步包括在步骤(d)之后将秸秆喂给反刍动物。

机械粉碎和酶促降解的秸秆比未粉碎的秸秆更容易被反刍动物消化。此外,秸秆中的酵母增加蛋白质含量。此外,在青贮期间稀酸水解的作用导致半纤维素和纤维素更易消化。

在一些实施例中,该方法进一步包括在步骤(d)之后使用秸秆进行厌氧消化以产生甲烷。

机械粉碎和酶促降解的秸秆比未粉碎的秸秆更有效地使用在厌氧消化中。另外,在青贮期间稀酸水解的作用导致半纤维素和纤维素更易于进行厌氧消化。

在一些实施例中,该方法进一步包括在步骤(d)之后使用秸秆进行酶水解以从纤维素产生乙醇。

机械粉碎和酶促降解的秸秆在酶水解过程中比未粉碎的秸秆释放更多的葡萄糖。另外,在青贮期间稀酸水解的作用导致半纤维素和纤维素更易于进行酶水解。

本领域普通技术人员将认识到,使用各种低成本技术,发酵期间的温度可以被限制在约38℃,特别是如果发酵发生3天以上,而且初始温度低至5℃将足以启动发酵。这种低温发酵会迅速将秸秆温度提高到高于38℃。

本领域普通技术人员将认识到,已知的装置可用于本文披露的工艺、系统和方法。本文的工艺可以是分批、连续、半连续或伪连续的。本文中对“容器”或“反应器”的提及应被解释为意指一种或多种这样的装置(例如串联或并联)。可能期望或观察到各种流动型态。具有化学反应和涉及多个相的同时传质过程,流体动力学可能相当复杂。根据具体设计,流动型态可以接近塞流或充分混合的流动。

通量或加工能力可以从小型实验室规模单位到完全商业规模的生物炼制厂(包括任何试点、示范或半商业规模)广泛变化。在各实施例中,加工能力为至少约1kg/天、10kg/天、100kg/天、1吨/天(全部吨都为公吨)、10吨/天、100吨/天、500吨/天、1000吨/天、2000吨/天或更高。

总体系统可以在固定位置,或者它可以是便携式的。可以使用可被简单地复制用于实际放大的模块来构造该系统。

各种探针可以允许跨该工艺的各个阶段(多达并且潜在地包括该工艺的所有阶段)进行精确的工艺监测和控制。预期精确的工艺监测将动态地连同在可以利用操作历史来调整工艺条件(包括压力循环程序)的一段时间内得到产率和效率的改善。在一些实施例中,将反应探针处置成与处理区域可操作地连通。这样的反应探针可用于提取液体样品并分析它们,以便确定水解程度或糖谱等。如果认为是必要的或期望的,工艺调整可以基于使用公知的工艺控制原理(反馈、前馈、比例积分导数逻辑等)的测量。

在该工艺内产生或存在的固体、液体和气流可以独立地循环,传递到随后的步骤,或者在任何时候从工艺中去除/吹扫。

实例

以下实例证明本发明的原理。通过实验证据,如上所述,在浸没的同时通过压缩注入酵母和酶已显示对于发酵禾本科秸秆是有用的。

图1的实验装置被设计用于再现本发明的优选实施例的就工业单元的温度、压力和流量控制而言的工业过程功能。它在2016年11月在美国田纳西州孟菲斯的德尔塔生物可再生(Delta BioRenewables)甜高粱农场用于甜高粱收获,以测试压缩新鲜收获的秸秆。然后将一些秸秆冷冻并运输至美国明尼苏达州明尼阿波利斯市,并将其解冻并随后使用此实验装置进行压缩,如下文实例2、3和4所述。在实例2中描述了由压缩引起的质量损失,而实例3和4中描述了发酵和酶解效率。

图1示出了所使用的设备。将秸秆切得比100mm长,没有最大长度限制,将其通过进料管103进料。容器101含有水性试剂溶液。被送入装置的秸秆首先被浸没在该溶液中,并且然后与辊108和107接触。辊108围绕轴109自由旋转,进而允许该轴由于弹簧111而竖直移动。该弹簧的压缩和该辊的移动量可以使用张紧器112来调整,从而允许对各种直径的秸秆进行最佳处理,并确保秸秆的压缩被限制在20%和90%之间。辊107的轴114不能竖直移动并且由外部旋转源驱动。此外部旋转源最典型地是电动机,但也可以是手动曲柄、自行车曲柄或内燃机。辊107提供了增加的秸秆的摩擦和压缩。金属桨叶120有助于通过辊107和辊108推动秸秆。辊107驱动两个辊之间的秸秆,并且在完成它们通过该系统的过程之后,秸秆通过出口管113排出。当一根秸秆离开辊之间的空间并因此不再被它们驱动时,它通过被正在辊之间压缩的下个秸秆推动而被系统排出。容器101装满水性试剂溶液允许,并且规定该容器通过填充塞122保持充满并且通过排放塞121排放。

该实验装置使用:辊107的直径为大约90mm,辊108的直径为大约100mm,金属桨叶120的厚度和高度为大约6mm,辊107和辊108之间的最小距离为9.5mm,辊107的切向速度为大约1m/s,进料管103和出口管113的直径为100mm,并且进料管103和出口管113的长度为2m。

以下实例使用美国田纳西州孟菲斯的德尔塔生物可再生甜高粱农场的甜高粱。通过挤压放出来自甜高粱秸秆的汁液,并用数字折射计测量以白利糖度计的糖含量。所使用的甜高粱秸秆含水量为70%。

注意,通过将白利糖度乘以约0.8来调节甜高粱汁液的白利糖度测量值以获得总糖的重量百分比。这是因为甜高粱汁液比甜菜或甘蔗汁液具有更多的葡萄糖和果糖,而葡萄糖和果糖的折射系数与蔗糖的不同。这描述于刘荣厚(Liu,Ronghou),李金夏(JinxiaLi),和沈飞(Fei Shen),“通过固定化酵母发酵从甜高粱的秸秆汁液精炼生物乙醇(Refining bioethanol from stalk juice of sweet sorghum by immobilized yeastfermentation)”,再生能源(Renewable Energy)33.5(2008):1130-1135中,将其特此通过引用并入本文。

本发明的四个实例如下所示。

实例1

实例1示出了在台钳的钳口之间压缩浸没在水性试剂溶液中的一片甜高粱秸秆与未浸没的另一片之间的差异。得到的在浸没时压缩的发酵比未经浸没压缩并且然后随后浸没的发酵多30%。

将甜高粱进行发酵,有浸没在水性试剂溶液中时压缩50%以及在空气中压缩并浸没在水性试剂溶液中30分钟两种情况。

使用在2015年10月在美国田纳西州孟菲斯的德尔塔生物可再生甜高粱农场收获的甜高粱秸秆,在干冰中运输并储存在冷冻箱中,直到2016年6月测试。从冷冻箱中选出甜高粱秸秆,长度为200mm且直径为10mm。将它在冰箱中解冻两天。将秸秆切成两个100mm长度,左样品重7.1g且右样品重9.4g。少量汁液被放出,并且白利糖度测量为13%。

通过将1升水升温至38℃,然后加入1g来自拉勒曼德生物燃料与蒸馏酒精(Lallemand Biofuels&Distilled Spirits)的Thermosacc酵母和1g来自BSG公司的Fermax酵母营养物来制备一升水性试剂溶液。将此水性试剂溶液用磁力搅拌器搅拌30分钟,以使冷冻干燥的酵母再水化,同时该水性试剂溶液的温度保持在38℃。

将左样品放入装有水性试剂溶液的塑料袋中,挤压至5mm的直径,并且然后立即除去并排放。左样品的质量从7.1g增加到7.5g,增加约5.6%。

将右样品在暴露于空气中时挤压至5mm的直径,然后称重。右样品的质量从9.4g减少到8.7g,减少约7.4%。然后将右样品浸没在该水性试剂溶液中30分钟。来自秸秆的气泡是可见的,持续10分钟。30分钟后,右样品的质量从8.7g增加到9.3g,增加约6.9%。

然后将左和右样品放入两个密封的PVC管中,每个约100mm长,且内径为20.9mm。然后将这些PVC管浸没在保持在38℃的水浴中并连接到气体计数器。

使用来自德国波鸿的Dr.-Ing.Ritter Apparatebau GmbH&Co.KG的两台MilliGascounter(MGC-1型)通过从每个PVC管产生的气体测量发酵的进展。在发酵期间以毫升分辨率测量产生的气体量。发酵3.35g糖(通常是蔗糖)产生1L的气体(CO2),因此发酵的糖的量、发酵速率和发酵的糖的总量可以通过随时间产生的气体的图来推断。

左样品在897分钟(14.95小时)内产生0.0753L气体。右样品在942分钟(15.7小时)内产生0.0767L气体。

发酵完成后,从每个样品中挤出汁液,并且左样品的白利糖度为2.6,且右样品的白利糖度为4.2。左样品的pH为3.98,且右样品的pH为3.61。

为了从白利糖度测量计算甜高粱汁液的糖含量,我们将13%的白利糖度乘以0.8,得到汁液的糖含量为约10.4%。这是因为甜高粱汁液比甘蔗汁液具有更多的葡萄糖和果糖,而葡萄糖和果糖的折射系数与蔗糖的不同。这描述于刘(Liu)等人,“通过固定化酵母发酵从甜高粱的秸秆汁液精炼生物乙醇(Refining bioethanol from stalk juice ofsweet sorghum by immobilized yeast fermentation)”,再生能源(Renewable Energy)33.5(2008):1130-1135中,将其特此通过引用并入本文。

为了计算每根秸秆的糖含量,我们假设含水量为约70%,得到秸秆糖质量的估计值为8.3%。鉴于左样品在压缩之前的质量为7.1g,并且假定由于压缩而损失了7%的糖,得到左样品中糖的估计值为0.55g。类似地,右样品在压缩之前的质量为9.4g,得到右样品中糖的估计值为0.73g。

左样品产生0.55g/0.0753L=7.3g/L(49%效率),而右样品产生0.73g/0.0767L=9.5g/L(35%效率)。这表明本发明的效率显著高于破裂甜高粱并随后将其浸没的替代途径。此外,这示出本发明将水性试剂溶液注入秸秆至少比替代途径快100倍(几秒代替10分钟),这是至关重要的,因为随着作物被收获需要将其快速注入。

实例2

实例2示出了使用图1所述的装置以1m/s在辊间未经浸没时压缩甜高粱秸秆时的质量损失。此压缩使用高弹簧负载(张紧器112转动以将弹簧111压缩越过零静止弹簧压力5mm)和低弹簧负载(张紧器112转动以将弹簧111压缩至零静止弹簧压力)。实例3中使用了这种低弹簧负载,而在实例4中使用了这种高弹簧负载。

实验程序为:

(1)切割八段600mm的甜高粱

(2)记录质量和平均直径

(3)将张紧器112设定为越过零静止弹簧压力5mm

(4)进料4段高粱并记录质量

(5)将张紧器112设定为零静止弹簧压力

(6)进料4段高粱并记录质量

在这些实验中使用的弹簧具有17.4kN/m的胡克定律弹簧常数,通过向弹簧以2kg增量添加重量并测量该弹簧的位移来测量。该曲线是相当线性的,24kg重量(235.36N)将弹簧从52.2mm压缩到38.7mm(压缩13.5mm)。

在20mm秸秆上测量的直径减小和计算的粉碎力示于表1中。这表明在高弹簧负载(5mm弹簧压缩)下,20mm的秸秆在桨叶120和辊108之间被压缩75%并且在辊107和辊108之间被压缩45%。

表1:直径减小和粉碎力

表2示出了对于高弹簧负载(5mm弹簧压缩)平均值为0.35%的质量损失和对于低弹簧负载(0mm弹簧压缩)平均值为0.24%的质量损失。实例3中使用了这种低弹簧负载,而在实例4中使用了这种高弹簧负载。注意,在实例2中,秸秆压缩50%时,汁液损失为7%。此实例证明,以1m/s在辊之间压缩得到的汁液损失明显小于秸秆的简单静态压缩。

表2:压缩的质量损失

实例3

实例3显示了在低弹簧负载下在辊之间压缩之后用四种不同酶组合(无、HTec3、Pectinex XXL以及HTec3和Pectinex XXL)进行发酵的结果。这表明在低弹簧负载下发酵成功,但酶作用无效。不希望受任何特定理论的约束,认为低弹簧负载比高弹簧负载产生较少程度的秸秆裂缝网络,并且酶的平均扩散距离比发酵时间长,而糖的显著更快的扩散速度导致糖完全扩散到酵母细胞,尽管距离更远。

表3显示了实例3和实例4中样品1-4的酵母和酶组成。

表3:实例3和4中使用的酵母和酶

表4显示了低弹簧负载下秸秆的发酵结果。在发酵完成后,这些样品中任何一个的薄壁组织都没有可见的软化。

表4:实例3的发酵结果

实例4

表5示出高弹簧负载下秸秆的发酵结果。发酵后,样品1的薄壁组织未软化,样品2适度软化,而样品3和4的薄壁组织完全溶解。这表明高弹簧负载下发酵和酶作用都是有效的。不希望受任何特定理论的约束,认为高于100%的效率是由HTec3中的纤维素酶对秸秆中的纤维素的酶水解引起的。

使用商业甘蔗榨汁机从这四个样品放出汁液,并使用GC-100H程序将甲醇含量分析发送到美国田纳西州诺克斯维尔的加尔布雷斯实验室公司(Galbraith Laboratories,Inc.)。在放出的汁液中样品1具有42ppm的甲醇,样品2具有35ppm的甲醇,样品3具有64ppm的甲醇,而样品4具有70ppm的甲醇。这示出在秸秆内发酵期间产生的甲醇非常有限,而Pectinex XXL产生非常适量的甲醇。

表5:实例4的发酵结果

在此详细描述中,已经参考了多个实施例和附图,其中以说明的方式示出了本发明的具体示例性实施例。描述这些实施例以使得本领域技术人员能够实践本发明,并且应当理解,本领域技术人员可以对各种披露的实施例进行修改。

当上述方法和步骤表明某些事件以某种顺序发生时,本领域普通技术人员将认识到可以修改某些步骤的顺序,并且此类修改是根据本发明的变体进行的。另外,某些步骤可以在可能的情况下按并行过程同时进行,也可以依次进行。

本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容均通过引用结合在此,就如同每个出版物、专利或专利申请已经在此明确地且单独地提出。

上述实施例、变型和附图应提供本发明的实用性和多功能性的指示。在不脱离本发明的精神和范围的情况下,也可以使用未提供在此阐述的所有特征和优点的其他实施例。这样的修改和变体被视为落入由权利要求书限定的本发明范围内。在本披露与字典或其他参考之间的定义冲突的情况下,以本披露为准。

Claims (20)

1.一种用于发酵禾本科的秸秆的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供禾本科的秸秆,其中所述秸秆具有大于100mm的平均长度,并且其中所述秸秆具有在25%和80%之间的平均初始含水量;
(b)当将所述秸秆浸没在水性试剂溶液中时,在辊之间压缩所述秸秆,其中所述辊将所述秸秆的平均直径压缩在20%和90%之间,并且其中所述水性试剂溶液含有选自由以下组成的组的一种或更多种发酵生物,该组由以下各项组成:酵母、乳酸菌、乙酸菌及其组合;
(c)从所述水性试剂溶液中除去所述秸秆,其中所述秸秆保留所述一种或更多种发酵生物的至少一部分;并且
(d)发酵所述秸秆持续一个发酵时间以在所述秸秆内产生发酵产物。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述秸秆选自下组,该组由以下各项组成:甘蔗秸秆、高粱秸秆和玉米秸秆。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述秸秆具有附着到所述秸秆的叶子。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述秸秆作为全株存在。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述辊具有在0.1m/s和10m/s之间的切向速度。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述水性试剂溶液含有选自下组的酶,该组由以下各项组成:果胶裂解酶、淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、木聚糖酶及其组合。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述水性试剂溶液含有选自下组的酸,该组由以下各项组成:甲酸、乙酸、乳酸及其组合。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述水性试剂溶液含有亚铁离子、过氧化氢或其组合。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述发酵时间为在1天和7天之间。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述酵母是酿酒酵母的菌株。
11.如权利要求1所述的方法,其中在步骤(d)的发酵滞后时间期间,将所述秸秆脱水。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述乳酸菌选自下组,该组由以下各项组成:植物乳杆菌、布氏乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、费氏丙酸杆菌及其组合。
13.如权利要求1所述的方法,所述方法进一步包括使用从0.15W/kg至5W/kg的湍流能来混合所述水性试剂溶液。
14.如权利要求1所述的方法,所述方法进一步包括在所述发酵时间完成之后将所述秸秆保持在厌氧环境中持续一个青贮时间。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述青贮时间为在一天和一年之间。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括通过粉碎所述秸秆来回收所述发酵产物。
17.如权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括通过从所述秸秆中蒸发所述发酵产物来回收所述发酵产物。
18.如权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(d)之后将所述秸秆喂给反刍动物。
19.如权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(d)之后使用所述秸秆进行厌氧消化以产生甲烷。
20.如权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(d)之后使用所述秸秆进行酶促水解和发酵以从纤维素产生乙醇。
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