CN107513030A - 一种从l‑羟脯氨酸发酵液中分离纯化l‑羟脯氨酸的方法 - Google Patents

一种从l‑羟脯氨酸发酵液中分离纯化l‑羟脯氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从L‑羟脯氨酸发酵液中分离纯化L‑羟脯氨酸的方法。本发明包括发酵液菌液分离、超滤膜过滤、复合吸附剂处理、除盐、真空浓缩结晶等步骤。本发明方法对发酵液进行预处理再进行过滤除菌，增加了过滤通量，缩短了过滤处理时间，蛋白去除率提高20%以上；不使用阳离子交换树脂，大大减少了酸碱废水；不使用纳滤膜或反渗透膜处理，一次结晶就制得合格产品，极大降低了动力成本和能耗，形成了一条高效低成本的羟脯氨酸分离纯化方法。本发明可简化生产工艺路线，缩短生产周期，降低生产成本，提高L‑羟脯氨酸的提取收率至85%以上，成品含量均在99.0%以上。

Description

一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种L-羟脯氨酸的fenlichujnhua 方法。
背景技术
L-羟脯氨酸为亚氨基酸，是脯氨酸羟基化后的产物，是胶原蛋白的主要组成成分，不属于20种常见的氨基酸。近些年来L-Hyp的研究和开发已经引起广泛关注，应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。
目前，合成L-羟脯氨酸的方法有水解提取法、生物酶法和直接发酵法。我国L-羟脯氨酸的生产主要采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程制备，收率仅为5%，“三废”排放量大、污染严重，能耗高、纯度低及生产成本高，很容易被市场淘汰。由于该工艺采用的是动物源原料，生产过程中采用亚硝酸氧化工艺，该工艺的微量残余物或杂质对后续衍生化的中间体或原料药产生潜在的危害。国内外许多制药公司已经提出了对于反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的生物源来源要求，这种要求限制了动物源反式-4-羟基-L-羟脯氨酸的使用。
生物法生产反式4-羟基-L-羟脯氨酸，是当前世界上解决化学法能耗大、污染大、成本高等问题的最佳途径。目前，生物酶催化法制造L-羟脯氨酸主要分为利用活细胞以脯氨酸为底物进行生物催化生产和直接利用微生物发酵生产两种方法。生物催化法需要添加辅因子，转化率较低，且脯氨酸残余较多，为后续提取工艺带来困难。而利用基因工程菌发酵高效生产L-羟脯氨酸，不需外源添加L-脯氨酸和辅因子，发酵产物中杂酸较少，提取工艺与水解提取和生物酶法相比较为简单。
发酵液中的L-羟脯氨酸提取路线大多采用阳离子交换树脂吸附羟脯氨酸，使用碱液作为洗脱剂，得到L-羟脯氨酸解析液，该过程中产生大量酸碱废水，造成巨大的环保废水处理压力。CN 104276990 A中公开了一种利用填充活性炭柱对L-羟脯氨酸发酵液进行脱色的工艺，该工艺虽然节省了活性炭用量，但是活性炭柱清洗、再生过程产生了大量酸碱废水。CN 105777603 A中公开了一种使用阴阳离子树脂和微滤、纳滤膜混合处理一次浓缩结晶制取L-羟脯氨酸的工艺，该过程使用的阳离子树脂虽然并不是常规的吸附L-羟脯氨酸而是吸附杂质，但是阴阳离子树脂重复多次交替使用，也会产生大量的清洗和再生废水；纳滤膜过滤可以有效的去除色素，但动力成本较大，同时纳滤过程会造成一部分L-羟脯氨酸被截留在浓缩液中，这部分目的产物还要重新进行阴阳离子处理后再回收，工艺路线较为复杂。CN 105506019 A中公开的L-羟脯氨酸提取工艺为微滤、超滤和纳滤膜连续处理后，脱色、浓缩结晶、重结晶。该工艺路线未对发酵液进行预处理，三次膜过滤能耗较大，且料液体积逐级增大，造成浓缩过程能耗较大，重结晶过程进一步增大能耗，总收率较低。
发明内容
本发明旨在提供一种低能耗、低污染、工艺路线简单、高收率的L-羟脯氨酸的分离纯化方法。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
1）发酵液菌液分离：对L-羟脯氨酸发酵液进行预处理，过滤除菌得到过滤清液；
2）超滤膜过滤：将上述过滤清液泵入超滤膜系统，除去大分子蛋白，得到超滤清液；
3）复合吸附剂处理：将超滤清液预热后，加入复合吸附剂于60-70℃保温0.5-1.0 h；
4）除盐：板框过滤除去复合吸附剂得到一级料液，在一级料液中加入一定量的沉淀剂和螯合剂，保温搅拌0.5-1h，除去一级料液中残留的硫酸根和其它金属离子，得到二级料液；
5）真空浓缩结晶：将二级料液板框过滤除去沉淀物，得到的三级料液进行真空浓缩，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸。
所述步骤1）中的预处理方法为：调节L-羟脯氨酸发酵液的pH为2.0-5.0，然后加入L-羟脯氨酸发酵液中L-羟脯氨酸质量0.1-2%的絮凝剂，升温至60-70℃并保温30min。
所述步骤1）中絮凝剂为三氯化铁、硫酸铝钾、硫酸铝铵或聚丙烯酰胺中的任意一种。
所述步骤1）中过滤除菌采用孔径为50-200nm的陶瓷膜过滤或采用孔径为30-100nm的有机管式微滤膜过滤。
所述步骤2）中超滤膜的截留分子量为3000-10000D，卷式膜，材质为亲水聚醚砜。
所述步骤3）中的复合吸附剂为活性炭、硅藻土、活性白土中的任意两种，所述活性炭的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的10-20%；所述硅藻土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的0.5-5.0%；所述活性白土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的0.5-5.0%。
所述步骤4）中的沉淀剂为氧化钙、氢氧化钙、氯化钙、氢氧化钡或氯化钡中的任意一种，沉淀剂的添加量为超滤清液的0.5-3.0%(w/v)；所述螯合剂为EDTA或EDTA二钠，螯合剂的添加量为超滤清液的0.01-0.1%(w/v)。
其中，沉淀剂的添加量为超滤清液的0.5-3.0%(w/v)是指，例如超滤清液的体积为100L，则沉淀剂的添加量为0.5-3kg。
类似的，螯合剂的添加量为超滤清液的0.01-0.1%(w/v)是指，例如超滤清液的体积为100L，则螯合剂的添加量为0.01-0.1kg。
所述步骤5），先将三级料液真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.15-0.25kg/L的一级浓缩液，然后加入一级浓缩液中L-羟脯氨酸质量的0.2-2.0%的晶种，继续真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.3-0.4kg/L的二级浓缩液，然后降温至5-15℃，冷却结晶，离心收集晶体并在温度50-60℃，真空度-0.08Mpa的条件下双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸。
进一步，本发明方法还包括步骤步骤6）和步骤7），
6）大孔树脂处理：结晶母液经大孔吸附树脂处理，除去蛋白和色素，得到大孔树脂流通液；其中，大孔吸附剂骨架为交联聚苯乙烯，其型号是CAD-40，LS-20B，LS-200，LS-300中的任意一种，处理温度为40-60℃，pH值为4.0-7.0。
7）母液浓缩结晶：将大孔树脂流通液真空浓缩，加入晶种，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸。
所述步骤7）中结晶方式和干燥工艺与步骤5）中一致。
结晶母液循环套用3-6次后，所得晶体（L-羟脯氨酸粗品）与超滤清液混合制取L-羟脯氨酸成品，结晶母液具体循环次数由每次所得晶体品质决定。
本发明采用以上技术方案，与现有生产工艺相比，具有以下优点：
1、对发酵液进行预处理再进行过滤除菌，增加了过滤通量，缩短了微滤膜处理时间，蛋白去除率提高20%以上；
2、不使用阳离子交换树脂，只使用一次大孔吸附树脂对结晶母液进行流通处理，减少了80%以上的处理量，且不需要使用大量的碱解析，也不用频繁的酸碱再生，极大地减少了酸碱废水；
3、不使用纳滤膜或反渗透膜处理，为了防止硫酸盐超标，加入硫酸根沉淀剂处理料液，避免使用离子交换树脂或电渗析脱盐导致的高污染和高能耗。
4、结晶过程中加入晶种，提高了结晶收率，且一次结晶就制得合格产品，总收率达85%以上，极大降低了动力成本和能耗，形成了一条高效低成本的L-羟脯氨酸分离纯化方法。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，具体如下：
取100L L-羟脯氨酸发酵液（L-羟脯氨酸含量50.5g/L）用50%硫酸调pH=4.0，加入0.5%的硫酸铝钾，60℃保温30min后用50nm陶瓷膜过滤除菌，得120L L-羟脯氨酸过滤清液（L-羟脯氨酸含量为41.25g/L）；清液过截留分子量为6000D的超滤膜，得过滤清液145L（含量33.45g/L）；超滤清液中加入10%（w/w）的活性炭即485g，0.5%（w/w）即24.3g的硅藻土，65℃保温0.5h后板框过滤除去复合吸附剂；过滤清液中加入0.2%即300g的氢氧化钡，0.01%即14.5g的EDTA，保持搅拌0.5h后板框过滤出去沉淀；清液160L（含量28.85g/L）60℃真空浓缩至料液残余约30L（L-羟脯氨酸含量约15%，即150g/L）时加入0.5%即22.5g（150g/L*30L*0.5%=22.5g）的晶种，继续浓缩至料液残余约15L（L-羟脯氨酸含量含量约30%），降温至15℃后三足离心机收集晶体，离心过程中用水少量多次淋洗晶体；双锥真空干燥，温度55℃，-0.08MPa处理12h后得到3.67kg L-羟脯氨酸含量成品，纯度99.31%（PITC-异硫氰酸苯酯柱前衍生法HPLC检测，色谱柱为：天津博纳艾杰尔Venusil AA；流动相A：7.6g无水乙酸钠 +925ml高纯水溶解，用冰醋酸调pH至6.50，再加入70ml乙腈，流动相B：80%乙腈；柱温：40℃）；结晶母液1经大孔吸附树脂CAD-40流通处理（温度50℃，pH5.5）后，重复结晶和烘干步骤，得0.8kg L-羟脯氨酸含量成品，含量99.15%。，即总共收获4.47kg的L-羟脯氨酸，总收率达88.5%。
实施例2
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，具体如下：
取120L L-羟脯氨酸发酵液（L-羟脯氨酸含量56.8g/L）用50%硫酸调pH=3.5，加入0.5%的三氯化铁，65℃保温30min后用30nm有机管式微滤膜过滤除菌，得145L L-羟脯氨酸过滤清液（L-羟脯氨酸含量为46.54g/L）；清液过截留分子量为10000D的超滤膜，得过滤清液170L（L-羟脯氨酸含量39.3g/L）；超滤清液中加入15%（w/w）的活性炭即1.0kg，0.5%（w/w）即33.4g的硅藻土，70℃保温0.5h后板框过滤除去复合吸附剂；过滤清液中加入0.5%（w/v）即850g的氢氧化钡，0.01%（w/v）即17g的EDTA，保持搅拌0.5h后板框过滤出去沉淀；清液175L（含量36.26g/L）60℃真空浓缩至料液残余约35L（L-羟脯氨酸含量约18%）时加入0.3%即19g的晶种，继续浓缩至料液残余约18L（L-羟脯氨酸含量约35%），降温至15℃后三足离心机收集晶体，离心过程中用水少量多次淋洗晶体；双锥真空干燥，温度50℃，-0.08MPa处理12h后得到5.07kg成品，纯度99.2%；结晶母液经大孔吸附树脂LS-20B流通处理（温度40℃，pH5.9）后，重复结晶和烘干步骤，得0.95kg成品，含量99.36%，L-羟脯氨酸总收率达88.3%。
实施例3
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，具体如下：
取150L L-羟脯氨酸发酵液（L-羟脯氨酸含量48.5g/L）用50%硫酸调pH=4.0，加入1.0%的硫酸铝铵，70℃保温30min后用50nm陶瓷膜过滤除菌，得180L L-羟脯氨酸过滤清液（L-羟脯氨酸含量为40g/L）；清液过截留分子量为3000D的超滤膜，得过滤清液210L（L-羟脯氨酸含量33.61g/L）；超滤清液中加入20%（w/w）的活性炭即1.4kg，0.7%（w/w）即49.4g的硅藻土，70℃保温0.5h后板框过滤除去复合吸附剂；过滤清液中加入0.4%（w/v）即840g的氯化钡，0.02%（w/v）即42g的EDTA，保持搅拌0.5h后板框过滤出去沉淀；清液230L（L-羟脯氨酸含量29.46g/L）50℃真空浓缩至料液残余约42L（L-羟脯氨酸含量约16%）时加入0.5%即33g的晶种，继续浓缩至料液残余约22L（含量约30%），降温至15℃后三足离心机收集晶体，离心过程中用水少量多次淋洗晶体；双锥真空干燥，温度50℃，-0.085MPa处理12h后得到5.08kg成品，含量99.16%；结晶母液经大孔吸附树脂LS-300流通处理（温度60℃，pH5.85）后，重复结晶和烘干步骤，得1.19kg成品，含量99.08%，L-羟脯氨酸总收率达86.2%。
实施例4
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
1）发酵液菌液分离：对L-羟脯氨酸发酵液进行如下预处理：调节L-羟脯氨酸发酵液的pH为2.0，然后加入L-羟脯氨酸发酵液中L-羟脯氨酸质量0.1%的絮凝剂（三氯化铁），升温至60℃并保温30min； 然后采用孔径为50nm的陶瓷膜过滤除菌，得到过滤清液；
2）超滤膜过滤：将上述过滤清液过截留分子量为3000D的超滤膜，除去大分子蛋白，得到超滤清液；
3）复合吸附剂处理：将超滤清液预热后，加入复合吸附剂于60℃保温1.0 h；本实施例的复合吸附剂为活性炭和活性白土，活性炭的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的10-%；活性白土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的0.5%；
4）除盐：板框过滤除去复合吸附剂得到一级料液，在一级料液中加入沉淀剂和螯合剂，保温搅拌0.5-1h，除去一级料液中残留的硫酸根和其它金属离子，得到二级料液；
本实施例的沉淀剂为氧化钙，其添加量为超滤清液的0.5%(w/v)；螯合剂为EDTA，其添加量为超滤清液的0.01%(w/v)；
5）真空浓缩结晶：将二级料液板框过滤除去沉淀物，得到的三级料液，先将三级料液真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.15kg/L的一级浓缩液，然后加入一级浓缩液中L-羟脯氨酸质量的0.2%的晶种，继续真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.3kg/L的二级浓缩液，然后降温至5℃，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，然后在温度50℃，真空度-0.08Mpa的条件下双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸；
6）大孔树脂处理：结晶母液经大孔吸附树脂处理，除去蛋白和色素，得到大孔树脂流通液；其中，大孔吸附剂骨架为交联聚苯乙烯，其型号为LS-20B，处理温度为40℃，pH值为4.0；
7）母液浓缩结晶：将大孔树脂流通液真空浓缩，加入晶种，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸，该步骤的结晶方式和干燥方式与步骤5）中一致。
实施例5
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
1）发酵液菌液分离：对L-羟脯氨酸发酵液进行如下预处理：调节L-羟脯氨酸发酵液的pH为5.0，然后加入L-羟脯氨酸发酵液中L-羟脯氨酸质量2%的絮凝剂（硫酸铝钾），升温至70℃并保温30min； 然后采用孔径为200nm的陶瓷膜过滤除菌，得到过滤清液；
2）超滤膜过滤：将上述过滤清液过截留分子量为10000D的超滤膜，除去大分子蛋白，得到超滤清液；
3）复合吸附剂处理：将超滤清液预热后，加入复合吸附剂于70℃保温0.5h；复合吸附剂为活性炭和硅藻土，活性炭的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的20%；硅藻土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的2%；
4）除盐：板框过滤除去复合吸附剂得到一级料液，在一级料液中加入沉淀剂和螯合剂，保温搅拌1h，除去一级料液中残留的硫酸根和其它金属离子，得到二级料液；
本实施例的沉淀剂为氢氧化钙，其添加量为超滤清液的3.0%(w/v)；螯合剂为EDTA二钠，其添加量为超滤清液的0.1%(w/v)；
5）真空浓缩结晶：将二级料液板框过滤除去沉淀物，得到的三级料液，先将三级料液真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.25kg/L的一级浓缩液，然后加入一级浓缩液中L-羟脯氨酸质量的2.0%的晶种，继续真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.4kg/L的二级浓缩液，然后降温至15℃，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，然后在温度60℃，真空度-0.08Mpa的条件下双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸；
6）大孔树脂处理：结晶母液经大孔吸附树脂处理，除去蛋白和色素，得到大孔树脂流通液；其中，大孔吸附剂骨架为交联聚苯乙烯，其型号为LS-200，处理温度为60℃，pH值为7.0。
7）母液浓缩结晶：将大孔树脂流通液真空浓缩，加入晶种，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸，该步骤的结晶方式和干燥方式与步骤5）中一致。
实施例6
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
1）发酵液菌液分离：对L-羟脯氨酸发酵液进行如下预处理：调节L-羟脯氨酸发酵液的pH为3.5，然后加入L-羟脯氨酸发酵液中L-羟脯氨酸质量0.15%的絮凝剂（硫酸铝铵），升温至65℃并保温30min； 然后采用孔径为50nm的有机管式微滤膜过滤除菌，得到过滤清液；
2）超滤膜过滤：将上述过滤清液过截留分子量为5000D的超滤膜，除去大分子蛋白，得到超滤清液；
3）复合吸附剂处理：将超滤清液预热后，加入复合吸附剂于65℃保温0.5h；所述复合吸附剂为硅藻土和活性白土，硅藻土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的3.0%；活性白土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的3.0%；
4）除盐：板框过滤除去复合吸附剂得到一级料液，在一级料液中加入沉淀剂和螯合剂，保温搅拌1h，除去一级料液中残留的硫酸根和其它金属离子，得到二级料液；
本实施例的沉淀剂为氢氧化钡，其添加量为超滤清液的2%(w/v)；螯合剂为EDTA，其添加量为超滤清液的0.05%(w/v)。
5）真空浓缩结晶：将二级料液板框过滤除去沉淀物，得到的三级料液，先将三级料液真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.2kg/L的一级浓缩液，然后加入一级浓缩液中L-羟脯氨酸质量的1%的晶种，继续真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.35kg/L的二级浓缩液，然后降温至10℃，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，然后在温度55℃，真空度-0.08Mpa的条件下双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸；
6）大孔树脂处理：结晶母液经大孔吸附树脂处理，除去蛋白和色素，得到大孔树脂流通液；其中，大孔吸附剂骨架为交联聚苯乙烯，其型号为LS-300，处理温度为50℃，pH值为5.5。
7）母液浓缩结晶：将大孔树脂流通液真空浓缩，加入晶种，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸。该步骤的结晶方式和干燥方式与步骤5）中一致。
实施例7
一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
1）发酵液菌液分离：对L-羟脯氨酸发酵液进行如下预处理：调节L-羟脯氨酸发酵液的pH为4，然后加入L-羟脯氨酸发酵液中L-羟脯氨酸质量0.1%的絮凝剂（聚丙烯酰胺），升温至60℃并保温30min； 然后采用孔径为100nm的有机管式微滤膜过滤除菌，得到过滤清液；
2）超滤膜过滤：将上述过滤清液过截留分子量为8000D的超滤膜，除去大分子蛋白，得到超滤清液；
3）复合吸附剂处理：将超滤清液预热后，加入复合吸附剂于60℃保温1.0 h；复合吸附剂为活性炭和硅藻土，活性炭的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的15%；硅藻土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的2.0%；
4）除盐：板框过滤除去复合吸附剂得到一级料液，在一级料液中加入沉淀剂和螯合剂，保温搅拌1h，除去一级料液中残留的硫酸根和其它金属离子，得到二级料液；
本实施例的沉淀剂为氯化钡，其添加量为超滤清液的-3.0%(w/v)；螯合剂为EDTA二钠，其添加量为超滤清液的-0.1%(w/v)；
5）真空浓缩结晶：将二级料液板框过滤除去沉淀物，得到的三级料液，先将三级料液真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.15kg/L的一级浓缩液，然后加入一级浓缩液中L-羟脯氨酸质量的0.2%的晶种，继续真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.3kg/L的二级浓缩液，然后降温至8℃，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，然后在温度55℃，真空度-0.08Mpa的条件下双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸；
6）大孔树脂处理：结晶母液经大孔吸附树脂处理，除去蛋白和色素，得到大孔树脂流通液；其中，大孔吸附剂骨架为交联聚苯乙烯，其型号为CAD-40，，处理温度为55℃，pH值为6.0。
7）母液浓缩结晶：将大孔树脂流通液真空浓缩，加入晶种，冷却结晶，离心收集晶体，离心过程冷水少量多次冲洗，双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸。该步骤的结晶方式和干燥方式与步骤5）中一致。

Claims (9)

1.一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）发酵液菌液分离：对L-羟脯氨酸发酵液进行预处理，过滤除菌得到过滤清液；
2）超滤膜过滤：将上述过滤清液泵入超滤膜系统，得到超滤清液；
3）复合吸附剂处理：将超滤清液预热后，加入复合吸附剂于60-70℃保温0.5-1.0 h；
4）除盐：板框过滤除去复合吸附剂得到一级料液，在一级料液中加入一定量的沉淀剂和螯合剂，保温搅拌0.5-1h，得到二级料液；
5）真空浓缩结晶：将二级料液板框过滤除去沉淀物，得到的三级料液进行真空浓缩，冷却结晶，离心收集晶体，双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤1）中的预处理方法为：调节L-羟脯氨酸发酵液的pH为2.0-5.0，然后加入L-羟脯氨酸发酵液中L-羟脯氨酸质量0.1-2%的絮凝剂，升温至60-70℃并保温30min。
3.根据权利要求2所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤1）中絮凝剂为三氯化铁、硫酸铝钾、硫酸铝铵或聚丙烯酰胺中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤1）中过滤除菌采用孔径为50-200nm的陶瓷膜过滤或采用孔径为30-100nm的有机管式微滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤2）中超滤膜的截留分子量为3000-10000D。
6.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3）中的复合吸附剂为活性炭、硅藻土、活性白土中的任意两种，所述活性炭的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的10-20%；所述硅藻土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的0.5-5.0%；所述活性白土的添加量为超滤清液中L-羟脯氨酸质量的0.5-5.0%。
7.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤4）中的沉淀剂为氧化钙、氢氧化钙、氯化钙、氢氧化钡或氯化钡中的任意一种，沉淀剂的添加量为超滤清液的0.5-3.0%(w/v)；所述螯合剂为EDTA或EDTA二钠，螯合剂的添加量为超滤清液的0.01-0.1%(w/v)。
8.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述步骤5），先将三级料液真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.15-0.25kg/L的一级浓缩液，然后加入一级浓缩液中L-羟脯氨酸质量的0.2-2.0%的晶种，继续真空浓缩至L-羟脯氨酸浓度为0.3-0.4kg/L的二级浓缩液，然后降温至5-15℃，冷却结晶，离心收集晶体并在温度50-60℃，真空度-0.08Mpa的条件下双锥真空干燥，得到成品L-羟脯氨酸。
9.根据权利要求1所述的一种从L-羟脯氨酸发酵液中分离纯化L-羟脯氨酸的方法，其特征在于：还包括步骤步骤6）和步骤7），
6）大孔树脂处理：结晶母液经大孔吸附树脂处理，得到大孔树脂流通液；其中，大孔吸附剂骨架为交联聚苯乙烯，其型号是CAD-40，LS-20B，LS-200，LS-300中的任意一种，处理温度为40-60℃，pH值为4.0-7.0；
7）母液浓缩结晶：将大孔树脂流通液真空浓缩，加入晶种，冷却结晶，离心收集晶体，双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸。
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